Biotecnología Vegetal 2010 Transformación

Biotecnología a Vegetal 2010Transformación

Introducción de ADN foráneo en células vegetalesSistemas basados en vectores biológicos• Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciensy Agrobacterium rhizogenes• Sistemas basados en virus vegetalesSistemas de transferencia física• Transformación por bombardeo conmicropartículas• Transformación de protoplastos por fusógenosy/o cationes divalentes• Transformación de protoplastospor electroporación•“Whiskers” de siliconas• Microinyección• Electroporación de tejidos enteros

TRANSFORMACION CON AGROBACTERIUM

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium ataca a un amplio rango de huéspedes, a la mayoría delas dicotiledóneas, y con baja eficiencia a varias monocotiledóneasTumor provocado por A.tumefaciensLos tumores aparecen asociadosa heridasCélulas aisladas de los tumoressiguen creciendo en ausencia de labacteriaCélulas aisladas de los tumoressiguen creciendo en ausencia dehormonasCélulas aisladas de los tumoresproducen grandes cantidades deopinasLa formación del tumor está asociadacon la presencia de un megaplásmido

Ciclo de la enfermedad de la agalla de corona causada porAgrobacterium tumefaciens

Mapa genético del plásmido Ti de octopinaTi 200-800 kpbRegión T entre 20 y 80 kpb

La región T

La región T está definida por dos repeticiones directas de 25 paresde bases altamente homólogasEl borde derecho es imprescindible, el izquierdo no

Sistema de dos componentes para reconocer células vegetales susceptibles

Procesamiento de la hebra T y formación del complejo T maduroEl complejo T esta compuesto de unacadena simple de ADN-T cubierta porproteína VirE2. Una única molécula deproteína VirD2 se halla unidacovalentemente al extremo 5’ del DNA.Se estima que se requieren 600moléculas de VirE2 para recubrir los 20kb del ADN-T.

Transporte del complejo T

Procesos celulares y factores en la plantaLa integración del ADN-T al genoma de la célula vegetal involucra el apareamientono homólogo entre éste y el ADN cromosómico

Agrobacterium tumefaciens aprovecha los mecanismos de defensade la planta

Resumen de los mecanismos implicados en la transformación porAgrobacterium tumefaciens

Vectores basados en el plásmido TiSíntesis de hormonasy opinas prescindiblecointegradosbinarios

Ejemplos de vectores binarios

Optimización en el diseño de los vectores binariosVectorTamaño(kb)Sitiosúnicos derestricciónen ADN-TLacZSelecciónbacterianaMarcadordeselecciónen:Origen de replicaciónAgrobacteriumE. coliMobilizaciónpBIN19 11777 9 Si Kanamicina BD pRK2 pRK2 SipC22 17500 2 No Ampicilina,estreptomicina yespectinomicinaBD pRi ColE1 SipGA482 13200 7 No Tetraciclina BD pRK2 ColE1 SipPCV001 9200 6 No Ampicilina BD pRK2 ColE1 SipCGN1547 14440 5 Si Gentamicina BI pRi ColE1 SipJJ1881 25700 4 No Tetraciclina BI pRK2 pRK2 SipPZP111 8909 9 Si Cloranfenicol BI pVS1 ColE1 SipGreen0029 4632 18 Si Kanamicina BI pSa pUC NoTomado de: Hellens y Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.

Genes para la selección de transformantesGen de selecciónProducto genéticoFuenteSelecciónnptIINeomicina fosfotransferasaTn5Kanamicina, G418,paromomicina, neomicinaBleResistencia a bleomicinaTn5 y StreptoalloteichushindustanusBleomicina, fleomicinadhfrDihidrofolato reductasaPlásmido R67MetotrexatocatCloranfenicol acetiltransferasaFago p1CmCloranfenicolaphIVHigromicina fosfotransferasaE. coliHigromicina BSPTEstreptomicinafosfotransferasaTn5EstreptomicinaaacC3, aacC4Gentamicin-3-NacetiltransferasaSerratia marcescens;Klebsiella pneumoniaeGentamicinabarFosfinotricin acetiltransferasaStreptomiceshygroscopicusFosfinotricina, bialofosEPSP5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasaPetunia hybridaGlifosato

Genes para la selección de transformantesGen selectorProducto genéticoFuenteSelecciónbxnBromoxinil nitrilasaKlebsiella ozaenaeBromoxinilpsbAProteína Q nAmaranthus hybridusAtrazinatfdA2,4-D monooxigenasaAlcaligenes eutrophusÁcido 2,4diclorofenoxiacéticoDHPSDihidroxipicolinato sintasaE. coliS-aminoetil L-cisteínaAKAspartato kinasaE. coliAlta concentración delisina y treoninasulDihidropteroato sintasaPlásmido R46SulfonamidaCsrl-lAcetolactato sintasaArabidopsis thalianaHerbicida sulfonilureatdcTriptofano decarboxilasaCatharanthus roseus4-metil triptofanomanAManosa 6P-isomerasaE. coliManosa 6P

PROTOCOLOS DE TRANSFORMACIONTotipotencialidadDesdiferenciaciónRediferenciación

Transformación mediante cocultivo de Agrobacterium tumefaciensy discos de hojas de tabacoABCD

Transformación mediante co-cultivo de Agrobacterium tumefaciens ycotiledones de sojaABCcotiledón con heridasinducción de tallos- higromicinainducción de tallos+ higromicinaEFGinducción de tallos+ higromicinaenraizamiento+ higromicinatransplante

Transformación de Arabidopsis thaliana mediante Agrobacteriumtumefaciens usando la técnica de inmersión floralplantas deArabidopsisflorecidasinmersión de lasflores en lasolución deinfiltración conAgrobacteriumrecolección desemillasselección desemillas en placa

Transformación transitoria de Nicotiana benthamiana por agroinfiltración

GENES REPORTEROS

Genes reporterosGenes reporterosAbreviaturaOrigenDetecciónβ-glucuronidasagus/uidAE. coliFluorométrico (cuantitativo)o histoquímico (in situ),no radiactivoProteína de fluorescenciaverdeGFPAequorea victoriaFluorescencia,no destructivaCloranfenicolacetiltransferasaCatE. ColiEnsayo radiactivosensitivo, semi cuantitativoLuciferasaLucPhotinus pyralisLuminiscenciaLuciferasaluxA, luxBVibrio harveyiLuminiscencia

Uso de GFP para estudiar el desarrollo de la raíz

Uso de GFP para seguir la transformación de Brachypodium distachyonsemillas esterilizadasembriones inmaduroscultivo en medio de proliferación con auxina2+2+1 semanasproUbq1/intronGFPtNOSpro35SHPTtNOSRBLBincubación con Agrobacterium+acetosiringona2 díaspaso a medio con auxina, higromicina y antibiótico2+2 semanasVentaja: no invasivo, se puede seguir in vivo

Uso de GFP para seguir la transformación de Brachypodium distachyon3 semanas en medio de regeneración (-aux+citoquinina)+ higromicina + antibióticomedio de germinación (-aux-citoq)- higromicina + antibióticoanálisis de la progenie

Uso del gen uidA (β-glucuronidasa) de E.coliembriones de arroz• La proteína Gus es estable y conserva suactividad cuando es fusionada a otrasproteínas.• La detección de la actividad Gus es muysensible.• La reacción históquímica es destructivapor lo tanto el ensayo no puede realizarseen tejido vivo.vasculatura de Arabidopsis

SISTEMAS DE TRANSFERENCIA DIRECTA

El rango natural de hospedantes de Agrobacterium es un factor limitante en latransformación de monocotiledóneas y algunas dicotiledóneas que no presentabansusceptibilidad a la bacteria. En consecuencia, se desarrollaron métodos alternativosde transferencia de ADN basados en procedimientos de naturaleza química,fisicoquímica, o mecánica.Estos nuevos métodos son conocidos como de transferencia directa por transferirADN desnudo sin la mediación de vectores biológicos.Sistemas de transferencia directa de ADNTransferencia por bombardeo de micropartículas o biobalísticaTransferencia mediada por policationes (PEG, PVP) y/o fusógenos lipídicosTransferencia mediada por electroporaciónTransferencia con whiskers de carburo de silicioTransferencia por microinyección

Sistemas de transferencia directa de ADNVentajas• Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismosvectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal• No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantastransgénicas• Requieren construcciones más simples y pequeñas• Son apropiados para estudios de expresión transitoriaDesventajas• Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén ydel vector en varios sitios del genoma de las células transformadas• Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de rearreglos en lostransgenes

La biobalística puede utilizarse con diversos fines experimentales- Transferencia de genes a células, tejidos y órganosvegetales- Transferencia de genes a microorganismos yorganelas- Estudio de expresión transitoria- Análisis de promotores y de delección de genes- Estudio de mecanismos de expresión y regulaciónde genes- Estudio de infecciones virales- Transferencia de ARN viral- Estudio de vías metabólicas- Estudio del desarrollo de plantas

Aceleración de micropartículasAcelerador de micropartículas PDS 1000/He ®por descarga de helio a alta presiónModelo comercial actualMedidor de presión de helioTubo de aceleración de gasInterruptores de controlMedidor de vacíoPortador del discode rupturaPortador delmacroproyectilEnsamblaje del propulsorde microproyectilesCámara debombardeoCélulas blancoSoporte del blancoVálvula de mediciónde helioControles del flujode aire y de vacío

1. Adsorción de ADN a micropartículasAuW2. DisparoAdaptado de: Hagio, JARQ,1994.

Promotores constitutivos usados en transformación decereales por biobalísticaPromotor35S35S-Adh1intrón 1EmuAct1-Act1intrón 1Ubi1-Ubi1intrón 1Actividad relativa encélulas de cerealesBajaBajaModeradaModeradaAltaUso en cerealestransgénicosArrozMaízPasturasMaízAvenaTrigoCaña deazúcarArrozArrozTrigoCebadaArroz• La transformación porbiobalística no requiereconstrucciones genéticasespeciales. En algunos casos, seha obtenido mayor eficiencia detansformación cuando losplásmidos son linealizados.• El promotor constitutivo másampliamente utilizado para inducirla expresión de genes endicotiledóneas es el promotor 35Sdel Cauliflower Mosaic Virus(CaMV). En monocotiledóneas seutilizan promotores como el delgen ubi1 (ubiquitina) de maíz y eldel gen act1 (actina) de arroz.Adapatado de: Christou. Plant Molecular Biology Manual, 1995.

Expresión transitoria del gen reportero uidA en explantos bombardeadoscon micropartículaspiel de cebollahojas

Tipos de explantos utilizados para experimentos de transformaciónA B CD E FMPAdaptado de: Hansen and Wright, Trends in Plant Science, 1999A y B: callos de maíz. C: brotes de maíz. D y E: callos y brotesde soja. F: ápice de una plántula de algodón de 4 días (M:meristema apical y P: primordio foliar)

QTLs

Variación cuantitativaUn carácter cuantitativo es aquel para el que la diferencia fenotípicamedia entre genotipos es pequeña comparada con la variación entreindividuos dentro decada genotipo.V P =V G +V E