García y otrosagitados, aunque más débil <strong>de</strong>bido a que la pared celulares más <strong>de</strong>lgada, <strong>de</strong> tal manera que son menos resistentesa las condiciones adversas <strong>de</strong>l ambiente, comolos rayos ultravioletas <strong>de</strong>l sol y a la tecnología <strong>de</strong> aplicación,ya que se pue<strong>de</strong> romper más rápidamente ydañarse antes <strong>de</strong> realizar su efecto <strong>de</strong> biocontrol.Sin embargo, la producción <strong>de</strong> Tricho<strong>de</strong>rma líquido representauna alternativa para cuando la <strong>de</strong>manda es alta,ya que <strong>de</strong> esta manera se acelera el proceso <strong>de</strong> producciónmasiva y se obtiene el producto en un tiempo máscorto, con mayor cantidad y variedad <strong>de</strong> propágalos, locual indiscutiblemente aumenta su eficiencia.Por otro lado, una <strong>de</strong> las formas <strong>de</strong> acelerar el proceso <strong>de</strong>producción es el uso <strong>de</strong> métodos combinados, es <strong>de</strong>cir, através <strong>de</strong> fermentación bifásica, en que se utiliza un proceso<strong>de</strong> fermentación líquida para la obtención <strong>de</strong> un bueninóculo que luego se inocula sobre sustratos sólidos.Estudios realizados por Wei Lin et al. (2006) <strong>de</strong>muestranque en el proceso <strong>de</strong> fermentación líquida <strong>de</strong> T. harzianumse obtienen sustancias promotoras <strong>de</strong> crecimiento(ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas yvitaminas), las cuales son una clase <strong>de</strong> péptido. Cuandoaplicaron T. harzianum sobre la rizósfera <strong>de</strong> plantasinoculadas con bacterias fijadoras <strong>de</strong> nitrógeno selogró un aumento <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong> los nódulos radicularesy se produjo un incremento en la eficiencia <strong>de</strong> la fijación<strong>de</strong> nitrógeno.El método más comúnmente utilizado en Venezuelapara la producción masiva <strong>de</strong>l hongo Tricho<strong>de</strong>rma espor fermentación sólida monobásica, con el uso <strong>de</strong>sustrato alimenticio sólido tanto para la producción <strong>de</strong>inóculo como para la obtención final <strong>de</strong>l biopreparado.En otros casos se obtienen formulaciones líquidas porresuspensión <strong>de</strong> los conidios proveniente <strong>de</strong> una fermentaciónsólida [Zambrano, 2005].El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar la metodología<strong>de</strong> producción líquida estática en formaartesanal mediante el uso <strong>de</strong> melaza <strong>de</strong> caña panelera,obtenida en la zona (estado <strong>de</strong> Mérida), más levadurapana<strong>de</strong>ra como sustrato alimenticio líquido para la obtención<strong>de</strong>l inóculo <strong>de</strong>l hongo T. harzianum, a fin <strong>de</strong>mejorar la eficiencia en tiempo y producción <strong>de</strong> biomasa<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l proceso <strong>de</strong> producción masiva.MATERIALES Y MÉTODOSSe utilizaron 10 cepas <strong>de</strong> T. harzianum pertenecientes ala Colección <strong>de</strong> Hongos Antagonistas <strong>de</strong>l Laboratorio<strong>de</strong> Fitopatología <strong>de</strong>l <strong>Instituto</strong> Nacional <strong>de</strong> <strong>Investigaciones</strong>Agrícolas <strong>de</strong>l estado <strong>de</strong> Mérida (INIA-Mérida).Para iniciar el trabajo se hizo una reactivación <strong>de</strong> lascepas; se sembró por duplicado en el medio <strong>de</strong> cultivoagar papa <strong>de</strong>xtrosa (PDA) y se incubaron a 27 o C <strong>de</strong>tres a cinco días. Las cepas <strong>de</strong> T. harzianum utilizadasfueron siete no comerciales (T 1, T 2, T , T , T , T ,3 8 11 12IUTE) y tres comerciales (Natibiol, Inprodica yBioagrícola). La producción <strong>de</strong>l inóculo <strong>de</strong>l hongo enforma líquida se realizó a partir <strong>de</strong> una solución <strong>de</strong> 100 mL<strong>de</strong> melaza a 5%, que se aforó a 2000 mL con agua <strong>de</strong>stilada,y se ajustó a pH 5,5. La solución se dispensó enfrascos <strong>de</strong> vidrio <strong>de</strong> 500 mL, en una cantidad <strong>de</strong> 200 mLpor frasco y se esterilizó en autoclave a 121ºC y 15 PSIpor 20 min, se <strong>de</strong>jaron reposar 24 h y entonces se leañadió 5% <strong>de</strong> levadura (Saccharomyces cerevisiae) enforma aséptica bajo la cámara <strong>de</strong> flujo laminar.La producción <strong>de</strong>l hongo en forma líquida se llevó a caboa partir <strong>de</strong> una solución <strong>de</strong> 100 mL <strong>de</strong> melaza <strong>de</strong> trapiche<strong>de</strong> caña panelera fresca a 5% que se diluyó a 2000 mL<strong>de</strong> agua <strong>de</strong>stilada y se ajustó el pH a 5,5. La solución sedispensó en frascos <strong>de</strong> vidrio <strong>de</strong> 500 mL, a razón <strong>de</strong> 200mL por frasco, se esterilizó en autoclave a 121 o C, 15 PSIpor 20 min y se <strong>de</strong>jaron reposar 24 h; luego se le añadió5% <strong>de</strong> levadura (Saccharomyces cerevisiae) en formaaséptica bajo la cámara <strong>de</strong> flujo laminar.A las placas <strong>de</strong> Petri con los cultivos <strong>de</strong> Tricho<strong>de</strong>rma seles agregaron 10 mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>stilada estéril, se agitóun poco, se tomaron 5 mL <strong>de</strong> suspensiones <strong>de</strong> conidios<strong>de</strong> cada cepa (1 x 10 10 ufc) y se inoculó en cada frascoque contenía la solución <strong>de</strong> melaza más levadura.Una vez inoculados los frascos con la melaza se taparoncon algodón y papel aluminio, y sellaron con parafilmpara proporcionarles condiciones asépticas. Se sometierona agitación y se incubaron en forma estática inclinadadurante 14 días hasta obtener la produccióncompleta <strong>de</strong> conidios. Cada tratamiento se repitió diezveces. Las observaciones se hicieron todos los días para<strong>de</strong>tectar tipo <strong>de</strong> estructuras producidas y luego medirlas cantida<strong>de</strong>s.La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> conidios pormililitros se realizó en cámara <strong>de</strong> Newbauer por medio<strong>de</strong>l microscopio óptico y un objetivo <strong>de</strong> 40X, en una dilución<strong>de</strong> 10 2 , y se calculó por la fórmula [Lecuona, 1996]:Concentración (ufc.mL = Número <strong>de</strong> conidios x 4 x 10 6 x dilución)Se realizaron observaciones directas al microscopio óptico<strong>de</strong> muestras tomadas a las 24 h <strong>de</strong> incubación <strong>de</strong>296/fitosanidad
Producción <strong>de</strong> biomasa <strong>de</strong> Tricho<strong>de</strong>rma...las siembras realizadas en placas con PDA para <strong>de</strong>scartarlas posibles contaminaciones. Los datos sobreconcentración <strong>de</strong> conidios se analizaron a través <strong>de</strong>lprograma Estadística 6.0.RESULTADOS Y DISCUSIÓNEn la Tabla 1 se observan los resultados sobre producción<strong>de</strong> biomasa <strong>de</strong> Tricho<strong>de</strong>rma bajo fermentación líquida.Se encontró que todas las cepas lograron producirbiomasa <strong>de</strong>l hongo a partir <strong>de</strong> dos días. La producción<strong>de</strong> conidios se alcanzó entre 8-14 días. Hubo alta producción<strong>de</strong> micelios y clamidosporas, y a<strong>de</strong>más se encontróuna alta concentración <strong>de</strong> conidios que varió<strong>de</strong>s<strong>de</strong> 5,7 x 10 7 en la cepa comercial Bioagrícola hasta1,81 x 10 9 ufc/mL. Se obtuvieron diferencias significativasentre las cepas en cuanto a producción <strong>de</strong> conidios.También se observaron diferencias en forma cualitativasen cuanto a la producción <strong>de</strong> micelios y clamidosporas.De acuerdo con la prueba <strong>de</strong> medias <strong>de</strong> LDS a 5%, todaslas cepas tuvieron diferentes comportamientos encuanto a producción <strong>de</strong> conidios. La que presentó mejorproducción fue T 12, seguida <strong>de</strong> la comercial Inprodica,T 8y IUTE. Se encontraron también diferencias significativasen el tiempo necesario para la obtención final<strong>de</strong> conidios. Estas mismas cepas alcanzaron la producciónen solo ocho días, que fue la más rápida, seguidas<strong>de</strong> T 8, T 2y T 3que lo lograron en diez. Las <strong>de</strong>más necesitaronentre 12 y 14 días.Lo anterior indica que existe una alta variación en cuantoa la obtención final <strong>de</strong> estructuras reproductivas <strong>de</strong>Tricho<strong>de</strong>rma cuando se usa medio líquido, y que elloestá estrechamente relacionado con el comportamiento<strong>de</strong> la cepa a pesar <strong>de</strong> que todas son T. harzianum.Trabajos similares se han realizado en Cuba para laobtención <strong>de</strong> Tricho<strong>de</strong>rma por fermentación líquida conel uso <strong>de</strong> melaza <strong>de</strong> caña <strong>de</strong> azúcar y levadura torula, yse logró producir una concentración <strong>de</strong> 2-3 x 10 8 conid./mL[Fernán<strong>de</strong>z-Larrea, 2002; Fernán<strong>de</strong>z-Larrea et al., 1992;Stefanova et al., 1999].Asimismo Prakash y Lums<strong>de</strong>n (2006), con el objeto <strong>de</strong>obtener un preinóculo líquido <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Tricho<strong>de</strong>rmautilizaron 0,3 g melaza y 0,05 g extracto <strong>de</strong> levaduraen 100 mL <strong>de</strong> agua, y lograron una producción <strong>de</strong>10 3 -10 8 ufc. En tanto, en el proceso <strong>de</strong> producción <strong>de</strong>biomasa, cuando utilizaron 2,5 g <strong>de</strong> extracto <strong>de</strong> levaduray 500 mL <strong>de</strong> melaza en 1 L <strong>de</strong> agua, lograron unaproducción <strong>de</strong> 10 6 a 10 7 clamidosporas/mL.Tabla 1. Producción <strong>de</strong> biomasa y conidios <strong>de</strong> diferentes cepas <strong>de</strong> T. harzianumbajo fermentación líquidaCepasProducción<strong>de</strong> miceliosTiempo(días)Producción <strong>de</strong>clamidosporasTiempo(días)Producción<strong>de</strong> conidiosT 12 +++ 2 ++ 7 1,81 x 10 9 a 8Cepa comercialInprodicaTiempo(días)+ 2 + 8 6,4 x 10 8 b 12T 3 ++ 2 ++ 8 5,8 x 10 8 c 10T 8 +++ 2 ++ 8 5,8 x 10 8 c 10IUTE ++ 2 ++ 8 5,4 x 10 8 d 8Cepa comercialBiogrícolaCepa comercialNatibiol++ 3 + 8 5,0 x 10 7 e 14++ 3 ++ 8 4,2 x 10 8 f 14T 2 +++ 2 + 9 3,0 x 10 8 g 10T 11 ++ 2 + 9 2,8 x 10 8 h 14T 1 ++ 2 + 10 2,6 x 10 8 i 14CV 4,4%Sx 0,378Letras distintas son diferentes en la prueba <strong>de</strong> LSD con probabilidad menor o igual a 5%.fitosanidad/297
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