Seminario 2 - Departamento de Ciencias Biológicas

1Bioquímica ICurso 2010Seminario 2Ácidos nucleicosClase I: Actividad a desarrollar por los alumnosTemáticas a abordar: Estructura de bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos. Tipos de ácidos nucleicos,ocurrencia (dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA). Reactividad química diferencial de DNA y RNA. Estructura dedsDNA (B, A, Z). Estabilidad de la estructura: complementariedad y apilamiento de bases. Estructura secundariay niveles estructurales superiores: superenrollamiento. Desnaturalización (variables que afectan la ) y cinética derenaturalización de ácidos nucleicos. Efecto hipercrómico. Repaso de la metodología de ultracentrifugacióndescripta en el seminario que hemos denominado GeneralidadesBibliografíaBIOQUÍMICA. Quinta/Sexta Edición Stryer / Berg / Tymoczko (Editorial Reverté)LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA Cox, M.M. - Nelson, D.L. (Editorial Omega)BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA Bruce Alberts.Voet, Voet: Biochemistry, 3rd Edition -Problema 1Ud se encuentra en el laboratorio donde normalmente realiza sus tareas de investigación. En este momentoen particular Ud recibe una muestra de un laboratorio extranjero con la sola información de que se trataría deuna muestra que contiene ácidos nucleicos. Se trata de una muestra translucida y un poco viscosa.1. Primeramente decide repasar algunas propiedades de los ácidos nucleicos de manera que luego puedadiseñar nuevos experimentos que le permitan avanzar en la caracterización de la muestra. En dicho repaso secontesta las siguientes preguntas:1.1 ¿Qué fuerzas estabilizan la estructura de los ácidos nucleicos?1.2 ¿Por qué el DNA pierde estructura a pHs bajos y altos?¿por qué es estable en soluciones salinasdiluidas cercanas a la neutralidad?1.3 ¿Por qué el DNA no es hidrolizado en las condiciones (NaOH 0,3 N a 37° C por 16 horas) que elRNA si ? Esquematice el mecanismo de la reacción química.1.4 ¿Qué entiende por desnaturalización térmica? ¿Qué es el Tm?1.5 ¿Qué efectos tienen los siguientes reactivos sobre el valor de la Tm de un dsDNA y sobre dsDNA?a) Agua desionizadab) 1M NaClc) Urea 7 Md) Formamida 90%1.6 Describa algún método físico que puedan ser utilizado para estimar la composición nucleotídica delDNA. Como será los resultados en caso de tener dos muestras de ADN de igual concentración pero una deellas con alto contenido de GC y la otra con alto contenido de AT.2. Habiendo respondido las preguntas anteriores diseñe al menos un experimento que le permita verificar querealmente la muestra enviada contiene ácidos nucleicos.

23. Una vez verificado que se trata de una muestra conteniendo ácidos nucleicos usted diseña una serie deexperimentos que se describen a continuación con el objetivo de determinar la naturaleza de la muestra enviaday encuentra lo siguiente:a) Una transición abrupta de la absorbancia con el aumento de la temperatura, siendo lahipercromicidad del 30 %. Con un enfriamiento rápido se observa una pequeña disminución de laDO.b) El material no desnaturalizado forma una sola banda en un gradiente de densidad de CsCl a 1,77g/ml. Al recuperarse el material del sobrenadante del gradiente se determinó que la cantidad delmismo fue aproximadamente 100 µg de ácido nucleico por ml (5 veces más diluído que las muestrasoriginales).c) Luego de desnaturalizarlo por calentamiento y enfriado rápido se ultracentrífuga nuevamente, con locual desaparece la banda original y aparece una a 1,72 g/cm3. Dicha banda contiene la mitad delmaterial capaz de absorber UV respecto de la anterior.d) Si el contenido del tubo se mezcla, luego de lo cual se mantiene a una temperatura intermedia (quepermitiría la renaturalización) y se vuelve a centrifugar, la banda de 1,72 g/cm3 desaparece, yreaparece la banda original de 1,77 g/cm3, conteniendo todo el material capaz de absorber UVobservado la primera vez.e) Se ultracentrifuga el material como se describe en el inciso (b) excepto que antes de laultracentrifugación el material es tratado durante 1 hora a pH 12, y luego llevado a pH 7. El resultadode la ultracentriugación es igual al de (c), pero al aplicar el procedimiento (d) la banda de densidad1,72 g/cm3 permanece.En base a los resultados obtenidos prediga la naturaleza de la muestra enviadaClase II: Primera ParteTemario: Desnaturalización y cinética de renaturalización de ácidos nucleicos. Complejidad de genomas (curvasCot). Hibridación de ácidos nucleicos, aplicaciones.Problema 2En los últimos cinco años se ha difundido el uso del término genómica para designar el conjunto deprocedimientos utilizados por una nueva rama de la ciencia dedicada al secuenciamiento completo, análisis, yestudio comparativo de genomas (virales, procariotas, eucariotas). La genómica abre así perspectivas nuevasy de enorme potencialidad tanto para las ciencias básicas como para las disciplinas aplicadas. Uno de losaspectos de mayor interés estará ligado, por ejemplo, a la identificación precisa y a corto plazo de marcadoresgenéticos asociados al desarrollo de enfermedades específicas.Sin embargo, no hemos tenido que esperar el nacimiento de la genómica para conseguir los primeros datosque muestren características importantes de la estructura primaria de genomas completos. Con herramientasmuy sencillas lo invitamos a que se retrotraiga a los años sesenta y haga uso Ud. mismo de conceptossencillos que le permitan evaluar tamaños y características importantes de la estructura primaria desecuencias genómicas completas. Lo invitamos a leer y pensar sobre los siguientes experimentos cuya baseencontrará en los libros de texto que están a su alcance:A) ¿Conoce cuál es el comportamiento de un ADN de doble hebra ante un proceso de calentamiento gradual?¿Por qué? ¿Se le ocurre alguna manera sencilla de poner en evidencia que lo que Ud. dice o leyó escorrecto? Conoce alguna forma sencilla mediante la cual los cambios del ADN inducidos por la temperaturapuedan ser expresados en forma cuantitativa y monitoreados en forma continua?.B)¿Qué sucede con la estructura del ADN si una solución calentada a 80 es posteriormente enfriada? ¿Elresultado es el mismo si el enfriamiento es gradual respecto de un enfriamiento rápido? ¿Por qué? ¿Cómojustifica su respuesta desde el punto de vista mecanístico? ¿Podría dar alguna precisión sobre las etapas

3(cinéticas) mediante las que el ADN cambia su estructura secundaria durante el enfriamiento? ¿Cuál es elorden de reacción de cada una de ellas? ¿Cómo se afecta la cinética de cada etapa ante un enfriamientorápido, o un enfriamiento lento?. ¿Se corresponden sus predicciones con los datos experimentalesdisponibles en la literatura? ¿La situación a la que se llega después de un enfriamiento lento es(completamente) equivalente a la inicial? ¿Por qué?. En base a estas consideraciones anteriores, ¿con queecuación de velocidad podría describir la fracción de ADN que ha modificado su estructura secundaria poracción del enfriamiento? Cuál es la expresión para el tiempo medio ( /2) de reacción del proceso? ¿Depende el/2 de la concentración de ADN inicial? ¿Es eso consistente con la cinética propuesta?C) ¿Sabe que son los experimentos de cinética de reasociación de ADN (y de ácidos nucleicos en general)?¿Podría describir cuáles son las condiciones que hay que controlar en el experimento y cuáles son lasvariables del mismo? ¿Cuál es la razón por la que muestras de ADN cuyas secuencias son de copia únicapresenten valores diferentes de Co /2 en la Figura 1? ¿Puede completar la escala superior del gráfico?Si le resulta complejo contestar esta pregunta considere primero las siguientes cuestiones:¿Cómo define la complejidad de una secuencia de ADN?. Cómo se compara la complejidad (N) con elnúmero de nucleótidos de la secuencia en cuestión?. ¿Podría calcular las complejidades de las muestras deADN cuyas curvas de reasociación se muestran en la Figura 1? ¿Qué datos extrae de la gráfica y comorelaciona los valores de Co /2 con N? ¿Necesita datos adicionales?D) ¿Por que la curva de reasociación que se presenta en la Figura 2 correspondiente a una solución de ADNhumano presenta varias zonas sigmoideas a diferencia de las curvas de la Figura 1? ¿Podría dar algunascaracterísticas cuantitativas de las fracciones de ADN que corresponden a las diferentes zonas de la curva?Piense con optimismo que lo que Ud. está pensando ya lo pensaron quienes generaron los resultados que sepresentan en la Figura 3. ¿Cree que se podría estimar el tamaño de un genoma a partir de estudios decinéticas de reasociación?¿Conoce la llamada paradoja-C referida al tamaño relativo de diferentes genomas? Si no la conoce mire laTabla 1 y nuevamente piense…Aunque ni Ud. ni nadie conoce todavía la secuencia completa del genoma humano, a partir de hoy ya sabealgunas de las características que dicha secuencia debe tener.

5A260 relativa1.41.31.21.1Problema 3.Las curvas a la izquierda corresponden a experimentos dedesnaturalización térmica de ácidos nucleicos distintos. ¿Quéinformación puede obtenerse de la estructura secundaria ycomposición de bases de estos ácidos nucleicos?1.030 40 50 60 70 80 90 100Temperatura (º C)Problema 4.La figura muestra las curvas Cot de dosDNAs aislados de dos virus diferentes.La curva de la izquierda (gris)representa la renaturalizaión del DNAdel fago λ la de la derecha (negra)muestra la renaturalización del DNA deun virus de la poliedrosis nuclear(AcNPV), un baculovirus que infectauna oruga.a) ¿Cuáles son los valores de /2 de losdos DNAs?b) ¿Qué unidades tienen esos valores ycómo se determinan los valores de lasconcentraciones que se usan paraobtener los valores /2 para cada punto de la curva?c) Por un método independiente (cite algunas alternativas) se determinó que el tamaño del DNA del fagolambda es 50 kb. En función de este dato, estime el tamaño del DNA de NPV DNA. ¿Qué suposicionesdeberían ser ciertas para poder usar estas curvas?Clase II: Segunda ParteTemario: Métodos de separación y purificación. Empleo de solventes orgánicos. Columnas. Sílica.Precipitación alcohólica. Repaso Ultracentrifugación, centrifugación en gradientes de densidad (métodos develocidad y de equilibrio), intercalación de bromuro de etidio y densidad de flotación. Corridas electroforéticas.Geles de agarosa y poliacrilamida. Métodos de detección. Geles nativos y desnaturalizantes.Detección de secuencias específicas. Southern blot. Northern blot. Sondas. Métodos de cuantificación de ácidosnucleicos. Secuenciamiento de DNA, métodos. Escalas de secuenciamiento. PCRBibliografíaBIOQUÍMICA. Quinta/Sexta Edición Stryer / Berg / Tymoczko (Editorial Reverté)LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA Cox, M.M. - Nelson, D.L. (Editorial Omega)BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA Bruce Alberts.Voet, Voet: Biochemistry, 3rd Edition -

6Problema 5. El DNA duplex lineal puede unir más bromuro de etidio que una doble cadena circular de igual pesomolecular. Explique por qué. ¿Cómo el bromuro de etidio puede ser utilizado para separar estas dos formas deADN en una ultracentrifugación en gradiente de CsCl?Problema 6. Ud ha realizado un protocolo para purificar un plásmido pk18 mob de 3,7 kb de E. coli. Cómoverificaría que 1- realmente usted ha alcanzado su objetivo de obtener plásmido2- que el plásmido obtenido se trata realmente de un plásmido cuyo tamaño es 3,7 kb3- que el plásmido obtenido es el pk18mobProblema 7. En la figura se muestra el resultado de la secuencia de un fragmento de ADN de Escherichiacoli. El procedimiento empleado fue el de Sanger.a- Indique cada uno de los pasos seguidos para la determinación dela secuencia.b- Indique las 30 primeras bases de la secuencia de laautoradiografía.Problema 8. En el experimento de Meselson y Stahl una muestra de DNAobtenida de bacterias luego de una marcación in vivo con , seguida por unageneración cultivada en un medio con , fue desnaturalizada por calor antesde centrifugar en un gradiente de densidad de CsCl. ¿Qué resultados vieronver luego de llegar al equilibrio? ¿Para qué sirven estos resultados?Clase III: Actividad a desarrollar por los alumnosProblema 9.En un hospital de esta ciudad se han obtenido 10 aislamientos deEscherichia coli de pacientes que presentaban fuertes dolores abdominalesy vómitos. Se ha reportado una sintomatología similar en ciudades de Chiley Brasil. Los investigadores de estos países relacionaron la patogenicidadde los aislamientos con la expresión de una toxina que denominaronShigatoxina I. Los investigadores observaron que la secuencia codificantede Shigatoxina I puede tener localización tanto cromosomal, comoplasmídica. Se determinó la secuencia completa del gen shigatox I quecodifica para Shigatoxina I (una proteína monomérica).a. ¿Qué experimentos realizaría para determinar si los nuevos aislamientosargentinos presentan secuencias homólogas a la de la toxina Shigatoxina I?¿Es necesario incluir controles? ¿cuáles?b1. En aquellos aislamientos provenientes de nuestra ciudad en los que sepudo confirmar la presencia de Shigatoxina I, indique qué procedimientosrealizaría para determinar si la secuencia shigatox I se encuentra en elplásmido o en el cromosoma.b2. ¿Con qué material de laboratorio debe contar para llevar acabo lametodología anterior?b3. ¿Cuál es la importancia de esta localización diferencial?c. Puede usar los resultados obtenidos para determinar si se trata debacterias relacionadas o se originan de brotes diferentes.Finalmente con el objeto de conocer exactamente la secuencia del gen en cuestión se envió a un centro enKorea el material para su secuenciación.

7d. Explique en qué consiste la metodología de secuenciación de Sanger.e. Describa el método de secuenciación automática. ¿Qué ventaja presenta?f. ¿Qué material debe enviar y cómo lo transportaría?g. Indique qué reactivos se utilizan y para qué se sirve cada uno de ellos.h. ¿Qué tipo de información espera recibir cuando le devuelvan los resultados?Una semana más tarde recibe un mail de la empresa en el cual le informan que al aplicar la metodología deSanger para secuenciar un fragmento de 300 pb del gen shigatoxI se cometió un error en la concentración deddGTP utilizado. La concentración fue 100 μM en lugar de 1 μM. La autorradiografía resultante mostraría:a- mayor espacio entre las bandasb- menor espacio entre las bandasc- una gran zona blanca en la parte inferior.d- sólo una pocas bandas de bajo PM en la mezcla de reacción.e- mayor cantidad de bandas en todo el rango de PMProblema 10Recientemente se ha aislado una nueva especie bacteriana de la superficie de los dientes de pacientes quepadecen Diabetes Mellitus. La misma podría estar asociada a mayor frecuencia de padecer caries en esaspersonas. Usted trabaja en el equipo de investigación encargado de la caracterización molecular delmicroorganismo, desconocido hasta ahora, y su director le encomendó en particular el estudio de losplásmidos que contiene dicho microorganismo. Para esto debe comenzar a trabajar en la obtención de losplásmidos y usted decide realizarla a partir de un crecimiento bacteriano en medio sólido. El1 2producto obtenido luego de la preparación lo analiza mediante corridas electroforéticas engeles de agarosa. A continuación se muestra el resultado obtenidoPreguntas23 -9642,3 -2,15001- Indique los pasos que debe realizar en el laboratorio para poder obtener el o losplásmidos. Fundamente cada paso.2- Describa lo que se observa en el gel ¿Qué puede decir respecto de la preparaciónde plásmido que acaba de realizar? ¿Puede sacar una única conclusión?¿Modificaría algún paso de su protocolo?3- ¿Mediante qué otra metodología distinta a la de una electroforesis podría haberevidenciado la presencia de ADN plasmídico en la preparación? Fundamente.4- La muestra que obtiene con la segunda metodología que Ud. propone, cuando lacorre en un gel como en el de la Figura resulta en una única banda a la altura delmarcador de peso molecular de 6 kpb ¿Con los datos experimentales que dispone,puede inferir el tamaño del plásmido? Justifique.Calle 1: patrón de PM en KpbCalle 2 muestra problema