Variación - UNAM

Curso Optativo“Genética de Poblaciones”Facultad de Ciencias, Biología, UNAMEnrique Scheinvar

La VariaciónObjetivo: Comprender el origen y las características de lavariación genética y conocer las herramientas metodológicaspara su análisis2.1.- Importancia de la variación2.2.- Historia del estudio de la variación genética2.3.- Repaso de conceptos2.4.- Métodos experimentales de detección2.5.- Medidas de variación genética2.6.- Algunos patrones de la variación.

Métodos experimetalesde detección de laVariación

Variación contínuaEl primer tipo de variación que se detectó fue la variacióncontínua.La mayoría del polimorfismo fenotípico suele ser de estetipo.Color en el caracolCepaea nemoralis,1 locus varios alelos

Altura en humanosVarios loci (“genes”)(Genética cuantitativa)

La media define la variable y su variación se mide con lasmedidas típicas de dispersión alrededor de la media(VARIANZA) o su raíz cuadrada (desviación estandard) osu raiz estandarizada por la media (coef. de variación)Media.Medidas de variaciónDesviaciónestándard.VarianzaCoef.Var.-3 -2 -1 0 1 2 3Desviaciones estandard68.2% de los datos95.5% de los datos99.7% de los datos

Mex.5Variación MorfológicaCorrelacionesInglaterraTexasIntro. 1850'sMinnesotaa USAHawaiiPasserdomesticus(GorriónInglés)

6Cambio frecuencias...en el tiempo...Heredables?Silva-Montllano y Eguiarte L. 2003.American Journal of Botany 90(3): 377–387.

Lemma = hojita especializada de la avenaCambios en frecuencia alélica en metros!3 metros entre cada una! Cambio entre años y sitios...

1Sin embargo...Fuentes de variación fenotípica:Diferencias en genotipoDiferencias en el ambienteDiferencias por efecto maternoDiferencias filogenéticasGenéticas - No genéticasPara la evoluciónDEBE SER HEREDABLE !!!(Principio de la genéticaCUANTITATIVA)

2Distinguir entre variación ambiental/efectomaterno (plasticidad fenotípica) yvariación genética:Cruzas experimentales buscandoproporciones mendelianas.Correlación entre fenotipo de hijos y padres,eliminando efecto materno y efecto ambiental:–- Varios padres,–- Trasplantes recíprocos,–- Jardines comunes, etc....–GENÉTICA CUANTITATIVA !!!

Cuando observamos un caracter contínuo:La mejor medida de variación es la varianzaVarianzaFenotípicaVtot=VarianzaGenéticaVg+VarianzaAmbientalVaHeredabilidad (h 2 ) =Varianza entredistintos genotiposVgVtotVarianza entreindividuosdel mismo genotipo

Variación cuantitativa en Nicotiana tabacum

7Variación en cariotipos

8Cruzas.proporciones de genotipos yfenotipos + cariotipos

9Nùmero de cromosomasVariación genética en la viabilidadExisten genotipos que afectan la viabilidad (sobrevivenciade huevo a adulto)Viabilidad

10De hecho, sucede con las mutaciones.....Puede haber algunas variantes que sean letales, aunquela mayoría sean neutras y muy pocas sean ventajosas

11Variación en proteínasGenetics 1966. 54: 577-594.ALOENZIMAS!!!!Promedio: H= 0.12 y P 30% en 18 loci de D.pseudoobscuravalores similares en la mayoria de los organismos!!!

MarcadoresMoleculares

12¿¿¿ y el DNA ???Vamos a revisar: 15 ediciones completas de “El Quijote” (con notashistoriográficas y todo) para buscar variación entre las ediciones !!!!!Ponernos a Leer:- Leer todoUsar marcadores de “lectura”:- Leer el párafo inicial de cada capítulo- Sacar párrafos con la palabra “Sancho” y compararlos- Sacar párrafos al azar y compararlos.

13Leer todoSecuenciar el genoma completo de todos los individuos deuna población y buscar variaciónGENÓMICA !!y ahora...METAGENÓMICA !!!!!1 Mb = 1'000,000 pb

14Secuenciación454ilumina/solexaLife/apg - ligaciónPirosecuenciaciónHelicosetc...Nature Reviews, Genetics. 2010. 11:31-46

genes en uno o dos díasGENÓMAS en una semana (!!dos días!!)PROTEOMASy ahora..... METAGENOMAS !!!!

ASI_ES_LADRAN15Leer toooooodos los libros !!!!Escogemos una palabra a comparar (primer, cebador, iniciador ó marcador) :“LADRANSANCHO”Leer las frases / Comparar tamañosASI_ES_LADRAN_SANCHO_SEÑAL_DEASI_ES_LADRANLADRANASI_FUE_LADRANASI_ES_LADRARONMIENTRAS LADRANSANCHO_SEÑAL_DEMI_SANCHO_SEÑAL_DESANCHO_ES_PORQUESANCHO_SEÑAL_DESANCHO_SEÑAL_DEASI-->SANCHOSANCHO_SEÑAL_DEASI_ES_LADRAN_EN_SEÑAL_DE_SANCHOASI_FUE_COMO_LADRARON,_SANCHOASI_ES_LADRAN_MI_ESTIMADO_SANCHOASI_SE_FUERON_Y_DIJO: ASI_ES_LADRAN_SANCHOLADRANSANCHOLa selección de la palabra a leerdetermina el resultado.La selección del marcador moleculardepende del tipo de estudio ycomparación que se requiere hacer.

16Enzimas de restricciónComparar tamaños de losElectroforesisEcoRI3'CTTAAG5'GAATTCPCRReacción en cadenade la polimerasaBamHI 5'GGATCC3'CCTAGGHindIII5'AAGCTT3'TTCGAATaqINotI5'GCGGCCGC3'CGCCGGCG5'TCGA3'AGCTLeer todo óLeer los cachitosSECUENCIACIÓNHinfISau3A 5'GATC5'GANTC3'CTNAG3'CTAGLocus / Alelo

17 Marcador DominanteDNAbicho 1DNAbicho 2PCRde“rojo”azulazulDNAbicho 3homoplasia !

17DNAbicho 1Marcador CodominanteDNAbicho 2PCRde“rojo”azulazulDNAbicho 3A TC GA TC GA TC GA TC G

18Marcador molecular:Pequeña región (loci) variables (2 o + alelos) del genomaque se utilizan para comparar (homólogos) organismos otaxa.

21Variación genéticaSilva-Montllano y Eguiarte L. 2003.American Journal of Botany 90(5): 700-706.

19MarcadoresMolecularesProteínaDNASecuenciaespecíficaSecuenciaaleatoriaCodificanteNo codificanteVariableConservadaBasados en PCRBasados en IsoenzimasBasados en ambosGeneralmentevariableSecuenciadorElectroforesis(Visualizar)ALOENZIMASExtracción de proteína, electroforesisRAPD (Randomly Amplified Polimorphyc DNA)DNA. Primer aleatorio (20pb), PCR,electroforesisRFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphisms)DNA. Enzimas restricción, electroforesis.AFLP (Amplified Framgent LenghtPolymorphismDNA. Enzimas Restricción, PCR de losfragmentos, PCR, electroforesis.ISSR (Inter Simple SequenceRepeated)DNA. Stock de primers dedinucleótido repetido, PCR,electroforesis.Microsatélites ó SSR (SimpleSequence Repeated)DNA. Diseña primer para micro(núcleo, mito,cloro), PCR,electroforesis/secuenciador.Genes específicos.Diseña primer para el gen, PCR,secuenciador / electroforesis?Intrones – espaciadores

MicrosatélitesSSR (Simple Sequence Repeated)Regiones de di, tri, tetra o poli nucleótidos repetidos en tandem.CTAGAGAGAGAGAGAGAGATTGA (GA)8CTAGAGAGAGAGAGA----TTGA (GA)6CTAGAGAGAGA--------TTGA (GA)4CTATCAGTCAGTCAGTCAGTCAGACA(TCAG)5Regiones específicas de DNA nocodificantes.Presentes en todos los genomas (-proc.)Segregan de manera codominante.Altamente variables (µ -> 10 -5 , 10 -6 )stoterFormación? Homoplasia?

ISSR (Inter Simple Sequence Repeated)Marcador Dominante !!PrimerSecuencia5’ 3’811 GAG AGA GAG AG|A GAG AC (GA) 8-C841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC (GA) 8-YC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART (CA) 8-RT857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG (AC) 8-YGY=C+T; R=A+GRegiones de DNA (codificantes o no) al azar en el genomaPrimer: microsatélite aleatorio.Segregan de manera dominante.Altamente variables (µ ??)Formación? Homoplasia? Dominancia?

Gel marcador 811 de ISSR en una población de A. cupreata

Cloroplasto

SNPIndels (Insercióndeleción)InversionesMicrosatélitesElementos trasponiblesACGT-TATACGT-TATAGTTATATSecuenciasAlcohol Deshidrogenasa (Adh)

20Podemos ver variación.....En proteínas/RNA:En DNA:

22Variación en las frecuencias alélicas ....Helix aspersa introducida en 1930En poca área, fuertes cambios en lasfrecuencias alélicas.. calles barrerasimportantes...

23Variación en las frecuenciasalélicas ....Ciclos de 3 años, cada generación 6 a 8 semanas,20 generaciones, Lap cambios adaptativos? Otrasenzimas con menos cambios

24Variación filogeográfica en Pinus ayacahuite(Letelier y Piñero, 2009)

25Medidasde variacióngenética

26Agave tequilanaMarcador molecular: RAPDPoblaciónes: 2 cultivos en Tequila, Mpio: Tequila, Jalisco.3 y 3 individuos.Ladder: 100 pbTequila

27Agave cupreataMarcador molecular: ISSR (846)Ladder: 100 pbMezcal Tobalá¿Dónde hay más variación?Etúcuaro, Mich.Ayahualco, Gro.

Proporción de loci polimórficos ( P )Ocurrencia, en la misma población, de doso más alelos en un locus (cada uno conuna frecuencia apreciable).P =x

Gel de Marcador Dominante (Presencia/Ausencia)(Sólo se distingue el dominante, osea: AA=Banda; Aa=NoBanda;aa=NoBanda).Loci 1Loci 2Loci 3Loci 42 alelos: presencia / ausenciaP 100% = 0.75P 99% = 0.75P 95% = 0.75P 90% = 0.50P 80% = 0.50P 50% = 0.00

Ejercicio: Calcula los valores de polimorfismo (80%,85%,90%,95% y 100%) ydetermina qué población presenta mayor variación.Marcador Dominante: 11loci-2 alelos.10 Individuos 2nBichos de población ABichos de población B

Ejercicio: Calcula los valores de polimorfismo (80%,85%,90%,95% y 100%) ydetermina qué población presenta mayor variación.Marcador Codominante: 5loci-2 alelos.10 Individuos 2n

31Heterocigosis (H) o Diversidad génica (h):Proporción de genotipos Heterócigos o probabilidad de encontrarun genotipo heterócigo en una población.Probabilidad de obtener dos alelos idénticos en una población.H E =1−∑ frecuencia degenotiposhomocigosH O=∑ frecuencia degenotiposheterócigosH E: Heterocigosis esperada (si no cambiaran lasfrecuencias alélicas)H O: Heterocigosis observada (en la realidad)

HeterocigocidadHeterocigosis observadanH =∑ Oi 10 = No se observa ningún hetero.1 = Todos se observan hetero.Heterocigosis esperadaDiversidad genica:=H 2NnE2N−1 1− ∑1=1p i2 0.50 = No se espera ningún hetero.1 = Se esperan todos hetero.

Calcula la heterocigosis de las siguientes poblacionesSubpob.1 Aa AaAA aa aa AA aa AAAaaap= 9/20 =0.45q= 1-p = 0.55H E=1-(0.45² + 0.55²)Subpob.AA aa aa AA2AA aa aaaaAaAap= D+1/2H= (3/10) + 1/2 (2/10) = 0.4q= 1-p = 0.6H E=1-(0.40² + 0.60²)=H 2NnE2N−1 1− ∑1=1p i2H E= 2222−1 1−0 . 452 0 .55 2 0 .40 2 0 .6 2

Heterocigosis estimada para haplotipos=H N nN −1 1− ∑i=1p i2N = No. inds. pobla.n = No. de loci (i)(Nei, 1978)Heterocigosis promedio para varios lociH = 1 Nm ∑ i= 1N m∑j=1Var H = H 1− H NmH ijN = No. inds. de pobla im = No. de loci j

1 3 0 l o c i d e R A P D s4 0 p l a n t s1 0 p o r s i t i oNo hay variación genética en plantas de tequila!!!!H=0, P=0

Diversidad GenéticaHeterocigosis esperadaPolimorfismo** * * *** * **

E s p e c i e P o b l a c i ó n N H E PA . c u p r e a t a C 3 L a E s p e r a n z a 3 0 0 . 2 9 2 4 ( + 0 . 1 5 3 ) 8 3 . 3C 1 0 M e s o n e s 3 0 0 . 2 4 8 4 ( + 0 . 1 8 7 ) 7 2 . 2C 1 3 L a L a g u n a 2 9 0 . 2 1 2 0 ( + 0 . 1 6 2 ) 7 2 . 2C 1 4 E t ú c u a r o 3 3 0 . 2 5 8 5 ( + 0 . 1 8 5 ) 7 5 . 0C 1 6 T z i t z i o 3 1 0 . 2 7 5 8 ( + 0 . 1 7 4 ) 7 2 . 2H s = 0 . 2 5 7 4 ( + 0 . 0 3 0 )E s p e c i e 1 5 3 H t = 0 . 2 9 4 4 ( + 0 . 1 3 3 ) 8 8 . 8A . p o t a t o r u m P 2 C a m a r ó n 3 9 0 . 2 3 0 1 ( + 0 . 1 8 5 ) 6 1 . 1P 7 M i a h u a t l á n 3 1 0 . 2 3 0 6 ( + 0 . 1 6 5 ) 7 2 . 2P 9 S t a . C a t a r i n a 2 9 0 . 2 6 6 9 ( + 0 . 1 5 7 ) 8 6 . 1P 1 1 Z a p o t i t l á n 4 3 0 . 2 6 8 9 ( + 0 . 1 6 7 ) 7 5P 1 3 A z u m b i l l a 3 7 0 . 2 1 2 5 ( + 0 . 1 8 2 ) 6 3 . 8H s = 0 . 2 4 5 9 ( + 0 . 0 2 5 )E s p e c i e 1 7 9 H t = 0 . 2 6 8 9 ( + 0 . 1 4 9 ) 8 3 . 3En contraste con el tequila, hay altos niveles de variacióngenetica. El uso de estas plantas para hacer mezcal (aún) noha disminuido la variación genética.

Loshumanostenemosbajavariacióngenética

Riqueza alélica (A) óDiversidad alélicaNúmero promedio de alelos observados por locusA= 1 N ∑ i=1a iN= total de locia= Alelos presentesen el locus iActualmente N se estima con métodos de rarefacción (Petit et al., 1998)Número efectivo de alelosInverso de la homosigosis esperadan e= 1 1− H

Diversidad haplotípica (h)Se aplica en haplotipos (haploides o nucleares)[ h]=2n 1− ∑ x i22n −1¡Misma fórmula que heterocigosis!!xi

Datos para uno de los 8 microsatélites amplificados en Osos(Peatkau et al., 1997)Pobla.=H N nN −1 1− ∑i=1p i2Escoger dos poblaciones de ososy calcular las H promedio para los8 loci (Artículo de Petkau et al.,1997. Genetics 147:1943-1957)

Medidas de variación nucleotídicaACGT-TATACGT-TATAGTTATATInversiones?Microsatélites?Alcohol Deshidrogenasa (Adh)

Proporción de sitios segregantes óPolimorfismo nucleotídico óSitios segregantes θProporción de sitios nucleotídicos que difieren en la poblaciónE p n = s nm TSn -> No. de sitios pols.mT -> Total de sitiosp i= 0.533

Sitios segregantes θ wde WatersonTheta de waterson:Proporción de sitios nucleotídicos que difieren en la poblaciónK -> No. de sitios pols.Nota parapre-clavados:(Waterson, 1975)Bajo Modelo de sitios infinitos (neutralidad):E p n =4Ne μ[ 1 1 1 2 1 3 .. .1 n−1 ]θ

Diversidad Nucleotídica πProporción de diferencias nucleotídicas entre todos lospares de secuencias valoradas con la frecuencia de lassecuencias.π.=∑ p ip j. πijp i= Frecuencia de secuencia ip j= Frecuencia de secuencia jπ ij= Proporción de nuclótidos diferentesentre i y j2/5 = 0.42/5 = 0.41/5 = 0.2Bajo Modelo de sitios infinitos (neutralidad):Nota parapre-clavados:(Kimura, 1968)E π 4Ne μ14/34Ne μa – b = (0.4) (0.4) (4/15) =a – c =b – a =b – c =π = 0.2133c – a =c – b =

Ej. calcula la proporción de sitios segregantes y ladiversidad nucleotídica (pi)

Ej. calcula la proporción de sitios segregantes y ladiversidad nucleotídica (pi)5/10 = 0.52/10 = 0.21/10 = 0.11/10 = 0.11/10 = 0.1

Medidas de variación,Las distancias genéticas

La distancia genética es la cantidad de diferencias genéticasentre dos o más poblaciones o especies que se midemediante una cantidad numérica (Nei, 1987).Hay muchas:- Distancia de Nei- Distancia Standard- Distancia mínima-Czekanowski- Distancia de Pearson- Distancia de Roger- Distancia de Mahalanobisetc... etc... etc...

Distancia Genética de Nei (1972)Identidad de NeiI= J xy J xJ yDistancia de NeiD=−ln I nJ =∑ xyi= 1np i°xp i°y J =∑ xi=12J y=∑p i°xni=12p i°yDonde:pi -> frecuencia alélica del i vo. alelox -> población xy -> población yn -> total de alelos

Ejercicio: Calcular distancia genética de Nei:Datos de osos de Patkau et al., 1997I= J xyD=−ln I J xJ ynJ =∑ xyi= 1nJ =∑ xi=1nJ =∑ yi=1p i°xp i°y2p i°x2p i°y

Ejercicio: Calcular distancia genética de Nei:Datos de osos de Patkau et al., 1997

Notita....Para hacer un arbolito UPGMA(Método de distancia por promedio)Distancias Genets:A B C D EA - 6 8 4 7B - 5 1 5C - 5 10D - 3E -A (BD) C EA - 6+4/2 5 8 7(BD) - 5+5/25 5+3/24C - 10E -B0.51.5D2.5A (BD)E CA - 5+7/26 8(BD)E - 5+4/24.5C -A (BDE)CA - 6+8/27(BDE)C -22.5E4.5C¿?7A

Dendograma UPGMA basado en distancias de Nei (1972)A. cupreataA. potatorumpotatorum ?cupreatorum ?HeHecupreatorum?Chilapa-torum?A. cupreataHeHe

Agave lechuguilla(Silva y Eguiarte, 2003a y b. Am.Jour.Bot 90(3)lechuDiferenciación geográficaSemélparaAloenzimasMANTEL:r 2 = 0.22; P = 0.11.