ecologia cualitativa - Departamento de Ciencias Biológicas

AutoecologíaSinecología Basada en el aislamiento ycultivo de losmicroorganismos puros. El comportamiento de lacomunidad se infiere apartir de los poblacionespredominantes. Porción ecológicamenterelevante de la comunidadbacteriana del suelo (Ellisy col. 2003). Basada en el análisis directode la comunidad microbiana. La comunidad = la unidadecológica básica. Análisis funcional Análisis de la estructura11/09/2006 2

?Comunidad microbiana = “caja negra”Con las distintas metodologíasabrimos distintas ventanas de la“caja negra”Ninguna técnica por sí sola puede abarcar el total de losmicroorganismos de una comunidad y su abundanciarelativa= adecuada selección de diferentes técnicas.11/09/2006 3

Estrategia cultivo dependiente:Aislamiento y caracterización• Se toman al azar un número representativo del conjuntode colonias desarrolladas en medios de cultivos sólidos.• Aislamiento en medios de cultivos sólidos.• Caracterización e identificación: Características macro y microscópicas Características bioquímicas Perfiles de utilización de sustratos Caracterización molecular: FAME, ARDRA, RAPD-PCR,etc. Secuenciación, Hibridización11/09/2006 4

FAMEAnálisis de la fracción lipídica de la membranacitoplasmática, específicamente los ácidos grasos bajo laforma de metil-ester de ácidos grasos.Las diferentes poblaciones microbianas se caracterizan porposeer determinados ácidos grasos.• Gram positivas: ácidos grasos saturados de cadena largay ramificados.• Gram negativas: ácidos grasos monoinsaturados decadena más corta.• Eucariotas: esteroles.11/09/2006 5

Esterificación de los lípidos y la inyección, separación,identificación y cuantificación por cromatografía gaseosa.Identificación por comparación de los tiempos de retencióncon patrones de referencia.Cuantificación mediante la calibración de las áreas de lospicos11/09/2006 6

RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNAfingerprints)Obtención del DNA bacteriano, PCR con primers arbitraroscortos y un primer ciclo de amplificación contemperaturas de annealing no restrictiva (42ºC).11/09/2006 7

Interpretación de resultados403530Abundancia (%) 2520151050API-10%API-5%API-2,5%Suelo controlPseudomonasChryseomonasBrevundimonasBurkholderiaComamonasSphingomonasAgrobacteriumWeeksella v.MoraxellaAlcalígenesStenotrophomonasB. RegularesB.pleomorficosB. filamentososB. esporuladosCocosStreptomyces11/09/2006 8

API-10%ControlAPI-2,5%CP-1 (23% de variaciónexplicada): glucosa,malato, caprato, fenilacetatoy citrato.CP-2 (16% de lavariación explicada):asimilación de maltosa,manosa, glucosa, N-acetil-glucosamina,arabinosa y manitol.API-5%Relación entre las poblaciones Gram-negativas representativas de lossistemas API-2,5%; API-5%; API-10% y el sistema Control a los 360 días deltratamiento, aplicando el análisis de los Componentes Principales. Laselipses representan el porcentaje bivariado del valor medio de la muestra(centroide) con un 95% de confianza.Referencias: ∗ Sistema Control; sistema API-2,5%; sistema API-5% y sistema API-10%.11/09/2006 9

Diversidad promedio: el promedio de la distanciataxonómica entre todos los pares de aislamientos.Dpromedio0,500,400,300,200,10Control API-2,5% API-5% API-10%21dias360 díasD promedio( , )= ∑ d i jS(S+ 1)/2d(i,j) es la distancia taxonómicaentre el i -mo y el j –moaislamiento y S es el número totalde aislamientos.Comparación entre los Indices D normalizadosdel Control ysistemas contaminados, en la población Gramnegativa,luego del tratamiento.11/09/2006 10

SpCoeficiente de similitud (S p).Sx + Sy=2= xyyi=NNxySx∑qSy∑qS x, mide la similitud de la población x en la población y.S y, mide la similitud de la población y en la población xN x, N y, es el número total de aislamientos muestreados en lapoblación x y en la población y, respectivamente.p xi, es la proporción de aislamientos idénticos a i en la población x.p yi, es la proporción de aislamientos idénticos a i en la población y.q xi, es el cociente entre la proporción del aislamiento-i en lapoblación x respecto de lapproporción del aislamiento-i en la población y ,xiqxi=pyiLa letra i, representa el número de aislamiento en cada sistema ytoma valores desde 1 hasta N xy N y, respectivamente.11/09/2006 11

Sp= 10,5API-2,5% 21 díasAPI-5% 21 díasAPI-10% 21 díasControl 21 díasControl añoAPI-2,5% añoAPI-5% añoAPI-10% añoDendrograma derivado del ligamiento promedio no ponderado delos coeficientes de similitud S p obtenidos por comparaciónentre los aislamientos representativos de los sistemas de suelocontaminados al día 21 y 360, y los sistemas control en losmismos períodos.11/09/2006 12

Estrategias basadas en análisis directo dela comunidadDeterminación del espectro de asimilación desustratos de la comunidad (ECOplate®).• Determinación del perfil fisiológico de la comunidad.• Se inocula un volumen de suspensión de la muestra enpocillos de una microplaca. Cada pocillo contiene un mediobase suplementado con un sustrato ecológicamenterelevante como única fuente de carbono y energía y unindicador redox.11/09/2006 13

Incubar durante48-72hs.A 590nmLos perfiles de asimilación de sustratos de lascomunidades reflejan las diferenciasestructurales entre las comunidades.11/09/2006 14

AWTC1,81,61,41,210,80,60,40,2021 59 151DaysF2000+IF2000ControlFactor 1(32.7%): L-Arginina,αCiclodextrina, L-Treonina,Glicyl-L-Ácido Glutámico,D-Lactosa, D,L-α-GlicerolFosfatoFactor 2 (12.1%)(cargadonegativamente): Erytritol, N-Acetil-D-Glucosamina11/09/2006 15

• Método rápido y relativamente económico.• Se fundamenta en respuestas fenotípicas sujetas a lascondiciones de cultivo.Determinación de la respuesta respiratoria inducidapor el sustrato (SIR)• Incremento inicial (4 a 6hs.) en la velocidad de respiracióndebido a la mineralización de un sustrato agregado.• Medida de la producción de CO 2 : Biometers, cromatografíagaseosa.• Evalúo la capacidad catabólica de la comunidad microbianaincubando porciones con diferentes sustratos y midiendo la SIRen cada caso.11/09/2006 16

Campbell C. y col., 2003Appl. Environ. Microbiol.11/09/2006 17

11/09/2006 18

Métodos molecularesAnalizan la estructura de la comunidad a través deindicadores moleculares extraídos directamentede las muestras ambientales.• No presentan las limitaciones de los métodoscultivables (cultivo-independientes).• Aportan una información relativamente escasarespecto a la función de los microorganismos.11/09/2006 19

Determinación del contenido de ácidos grasosde la comunidad• El análisis de estos perfiles provee informaciónno solo de la composición y abundancia relativade cada población de la comunidad sino tambiéndel estado fisiológicos de las poblaciones.11/09/2006 20

Shi W. y col., 2003Appl. Environ. Microbiol.11/09/2006 21

• En la comparación de los perfiles lipídicosentre muestras pueden pasar desapercibidosciertos cambios en determinados gruposespecíficos ya que muchas especies puedenpresentar el mismo patrón de lípidos.• No se puede obtener una estructuradetallada de las comunidades microbianasdel suelo11/09/2006 22

Determinación del perfil de ácidos nucleicos dela comunidad.• Los microorganismos son detectados, identificados ycuantificados a través del análisis de sus genes.• En principio cualquier gen podría ser empleado, los másampliamente utilizados son el 16S rRNA y el 23S rRNA. Están presentes en todos los organismos. Tienen secuencias altamente conservadas a través de laevolución y porciones que cambian relativamente a unamayor velocidad (regiones variables). Están presentes en numerosas copias por célula, lo quefacilita su detección.• Separación física de fragmentos de ácidos nucleicos através de un soporte sólido que puede ser de agarosa oacrilamida. El perfil de bandas obtenido es consideradouna “huella digital” y permite hacer comparaciones entrediferentes comunidades a través del análisis comparativo11/09/2006 entre los perfiles.23

• Inicialmente es necesario extraer los ácidos nucleicosde la muestra ambiental. Este paso usualmenteconsiste en una exhaustiva purificación para eliminarproteínas, ácidos húmicos, y otros compuestos quepudieran interferir con el posterior análisis de losácidos nucleicos. Se utilizan generalmente dosprocedimientos para la recuperación del RNA o elDNA de la muestra: La extracción de las células microbianas seguida de lalisis celular y purificación de los ácidos nucleicos. Lisis directa de las células en la matriz ambientalseguida de la purificación de los ácidos nucleicos .• Entre las técnicas que permiten generar un perfil deácidos nucleicos las más utilizadas son: ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) T-RFLP (Terminal Restriction Fragment LengthPolymorphism) DGGE/TGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) .11/09/2006 24

Extracción de ácidos nucleicos de muestras ambientalesConcentraciónLisis indirectaLisis directaMuestrasLisis celularSeparación decomponentes celularesProteínasPolisacáridosDigestión de DNA/RNAPrecipitación de DNA/RNAPurificación de DNA/RNA11/09/2006 25

Lisis celularTécnicaPrincipioEjemplosDigestión enzimáticaDaños en paredescelularesLisozimas/ bacteriasLiticasa/levadurasMétodo químicoMétodo físicoDetergentes o agentescaotrópicosAgitación o trituradocon sustanciasabrasivasSDS, CTAB, tiocianatode guanidinaPerlas de vidrio,macerado delcongelado en N 2líquido11/09/2006 26

Separación de componentes celularesCompuestoPrincipioEjemplosDetergentesProteínasasDisuelven lípidosproteínas demembranas yasociadas al DNA,inhiben nucleasasDesnaturalización ydegradación deproteínasSDS, CTAB, sarcosilProteínasa KExtracción con fenol/ cloroformopH >8 DNA fase acuosapH= 5-6 RNA fase acuosaDesnaturalización de proteínas.Interfase conteniendo proteínasdesnaturalizadas.Lípidos en fase orgánica11/09/2006 27

Precipitación de ácidos nucleicosSal neutraliza cargas biológicas (fosfatos)+Alcohol deshidrata moléculas de ác. nucleicosCompactación y precipitación de ácidos nucleicosPurificación adicional de ácidos nucleicosCompuestos húmicos:•Sustancias orgánicas heterogéneas de origen natural•Coloración entre amarilla y negra.•Son co-extraídos con los ácidos nucleicos•Interfieren con las reacciones de digestión enzimática, amplificación ehibridización: los grupos fenólicos desnaturalizan moléculas orgánicas.11/09/2006 28

• Remoción de compuestos fenólicos e húmicos: PVP: adsorción de compuestos húmicos por formación depuentes de hidrógeno. Precipitación por centrifugación. CTAB: forma compuestos insolubles con ácidos nucleicos. ClCs, AcK: precita compuestos húmicos• Cromatografía: De fase fija (papel) o móvil (líquida o gaseosa) De adsorción: resinas aniónicas matriz con carga (+)adsorbe ác. nucleicos. Elusión con soluciones con altaconcentración salina. Ej: Sepharosa, hidroxiapatita. De filtración en gel: exclusión molecular, esferasconteniendo poros de tamaño variable. Ej: Sephadex.11/09/2006 29

Reacción en cadena de la polimerasa11/09/2006 30

Reacción en cadena de la polimerasa11/09/2006 31

11/09/2006 32

.ARDRA (AmplifiedRibosomal DNA RestrictionAnalysis)•Amplificación con primers universales:16S rDNA, región espaciadora 16S rDNA23S rDNA, eubacterias, arquebacterias.•Construcción de la librería genética:vectores plasmídicos.•Reamplificación de los clones positivos.•Digestión con enzimas de restricción•Corrida electroforética en geles de agarosa.•Comparación de los patrones derestricción: GelComparWEIDNER y col., 1996Appl. Environ. Microbiol.11/09/2006 33

11/09/2006 34

Aislamiento y clonación de fragmentos de DNAGenoma celularGenotecasMezcla de fragmentos de DNAVectorrecombinanteTransformación o transducción del huespedTransformación otransducción del huespedCultivo del clon11/09/2006 35

t-RFLP (Terminal Restriction Fragment LengthPolymorphism)• Amplificación con primers universales: 16S rDNA, regiónespaciadora 16S rDNA 23S rDNA, eubacterias,arquebacterias. Uno de los primers se marca con una sustanciafluorescente (en el extremo 5´ phosphoramiditefluorochrome 5-carboxyfluorescein (5´6-FAM))• Digestión con enzimas de restricción• Corrida de electroforesis capilar con un detector defluorescencia (secuenciador).11/09/2006 36

MOESENEDER,y col., 1999Appl. EnvironMicrobiol.Refleja la estructura de la comunidad (cada pico es un ribotipo) y unaestimación de la abundancia relativa (área del pico).Mediante la comparación del patrón de bandas rRNA/rDNA puedenestimarse las poblaciones metabólicamente activas.+ actividad: +ribosomas rRNA/rDNA11/09/2006 37

11/09/2006 38

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)Cuando el dominio conmenor temperatura dedesnaturalización alcanzadicha temperatura en elgel:Dominios dedesnaturalización: longitudde pares de bases conidéntica temperatura dedesnaturalización.Los fragmentos con diferentes secuencias se frenarán endiferentes posiciones del gradiente desnaturalizante y asípodrán ser separados (Muyzer y col., 1993).11/09/2006 39

11/09/2006 40

similarity [%]406080100GCAHC(C/Co)10 %10 %2.5 %5 %2.5 %2.5 %5 %2.5 %5 %controlsoil5 %5 %2.5 %Days603751803022260303018060*375230180375180375impact onmicrobial communityhighcontaminationfreshcontaminationlow contaminationearly datesunamendedlow contaminationlate dateshighimpactlowimpact11/09/2006* outlier41

Band Similarity Affiliation Firstly isolated from1.1 89% Bacteroides uranium mining waste piles1.2 94% Deferribacterales petroleum12.1 99% Sphingomonas sp. olive-mil-wastewater7.1 98% Sphingomonas sp. olive-mill-wastewater17.1 93% Xanthomonas sp. hydrocarbon-contaminated soils2.1 90% Bradyrhizobium sp. Australian soil sample19.1 90% Halochromatium sp. microbial mats15.1 90% Halochromatium sp microbial mats1.3 95% Sinorhizobium sp. soil8.1 95% Rhodanobacter sp. carbofuran-degrading soil bacteria20.1 91% Actinobacteridae subtropical Australian soil9.1 95% Acidobacterium sp. heavy metal contaminated environment2.2 90% α-Proteobacterium heavy metal contaminated environments15.2 93% Actinomycetes subtropical Australian soil15.3 92% α-Proteobacterium unknown1.4 95% Spirochaetes trichloroethene-dechlorinating culture11/09/2006 42

In-situ Hibridización• Hibridización entre una sonda de AN marcada yuna secuencia blanco específica dentro de lacélula, provocando un mínimo disturbio de lamuestra.• Permite la observación directa de la morfologíade la célula fijada, haciendo permeable lamembrana para lograr la penetración de la sonda(usualmente con paraformaldehido).• Las célulasson fijadasal portaobjetosehibridizadas con una sonda de oligonucleótido, eincubadas en una cámara húmeda.• La sonda puede estar marcada con un colorantefluorescente: fluoresceina (verde), o rodamina(rojo).11/09/2006 43

FISHPermite obtener información sobre:• Número de células específicas.• La morfología y espacial distribución de losmicroorganismos.• Actividad fisiológica directamente en la muestraambiental.11/09/2006 44

11/09/2006 45

Kindaichi, y col., 2004Appl. Environ Microbiol.11/09/2006 46

FISH• La sonda fluorescente DNA, dirijida al rRNA se une al ribosomapresente en células vivas.Se necesita la información previa sobre la secuencia blanco• La señal fluorescente es detectada por epifluorescencia o mediantemicroscopía confocal laser (con mucho más detalle)• Es una excelente técnica para la detección de no-cultivables, comomicroorganismos simbiontes de protozoos.No así en suelo o sedimentos donde predomina el estadodormante.Se necesitan muestras “limpias” y preferentemente células enestado de actividad.• Es muy útil en la identificación de bacterias en ambientescomplejos como biofilm, barros activados.Pueden contarse cultivables y no cultivables al mismo tiempo.11/09/2006 47

• La aplicación de estos métodos permitió interpretar quela mayoría de las células observadas directamente estánvivas pero no son cultivables, concepto introducido porprimera vez por Rita Colwell en 1987.• Permitió demostrar que los microorganismos puedenestar metabólicamente activos y mantener su virulencia.• Con cuidado!!El uso de sondas genes-PCR permite clasificar losno-cultivables, y atribuirles propiedades basándose en loshomólogos cultivables.11/09/2006 48

ResiduoAPIConcentración de residuo API en los sistemas de sueloDías“Es difícil suponer que la vasta diversidad catabólica del grupoPseudomonas o la variedad morfológica y bioquímica de losActinomycetes pudieran ser reconstruidas sobre las bases deinferencias obtenidas mediante el uso de estas sondasmoleculares”.Dr. Palleroni (Prokaryotic diversity and the importance of culturing,1997; Seminario sobre Biodiversidad, 1999)

EcosistemaAsimilación de sustratosEnzimasMétodosmicrobiológicosDNA, RNASondasAcidos grasosAislamiento decultivosMonitoreosMorfología,fisiología,taxonomíaGuía paraaislamientosTécnicasmolecularesInformación molecularBase dedatosGuía para el diseñode sondasUso de información fenotípica,filogenética y de actividad.Estudio de biodiversidad,filogeniay función de las comunidades.