0123 CITOMEGALOVIRUS IgG EIA WELL REF K3CG ... - Radim S.p.A.

0123
CITOMEGALOVIRUS IgG
REF K3CG
EIA WELL
REF K3CGB
96
192
Español
M44.es – Rev.13 – 07/2008

REACTIVOS DEL KIT
REACTIVOS CANTIDAD ESTADO FÍSICO
K1TG K1TGB
MTP 1 x 96 1 x 192 Listo para usar
WASH 1 x 50 mL 2 x 50 mL Concentrada
DIL 1 x 20 mL 2 x 20 mL Concentrado
NEG 1 x 2 mL 1 x 2 mL Listo para usar
CAL
1 x 2.5 mL
4 x 1.5 mL
1 x 2.5 mL
4 x 1.5 mL
Listo para usar
CONJ 1 x 14 mL 2 x 14 mL Listo para usar
TMB 2 x 15 mL 2 x 15 mL Listo para usar
STOP 1 x 14 mL 2 x 14 mL Listo para usar
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ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y/O
CUANTITATIVA DE LOS ANTICUERPOS IgG ANTI-CITOMEGALOVIRUS EN SUERO O
PLASMA HUMANO
PARA USO DIAGNÓSTICO “IN VITRO”
1. APLICACIONES CLÍNICAS
El citomegalovirus (CMV) es un virus de estructura icosaédrica con un diámetro de 180 – 250
nm, perteneciente a la familia de los Herpes virus. El virus tiene efectos citopatológicos con
engrosamiento de las células huespedes con inclusiones citoplasmáticas y nucleares.
El CMV está considerado como uno de los factores biológicos más importantes causantes de
anomalias congénitas como consecuencia de infecciones imtrauterinas. Aproximadamente el
2% de las mujeres embarazadas contraen una infección primaria o una reinfección, mientras
el 10 –20% de los neonatos con infecciones congénitas causadas por CMV presentan daños
significativos en el sistema nervioso central.
Estas infecciones congénitas pueden ser también provocadas por una reactivación endógena
del virus en la madre.
Recientemente se está dando notable importancia al CMV como causa de complicaciones en
el transplante de órganos, especialmente de riñón.
La incidencia de infecciones por CMV tras un transplante renal de un sujeto CMV positivo a
uno CMV negativo se ha estimado alrededor del 52 – 100%.
La infección por CMV está muy difundida: anticuerpos anti-CMV se han encontrado en el 50
– 70% de los individuos de más de 35 años. Por otra parte el CMV ha podido aislarse en la
cérvix uterina del 10% de las mujeres sanas. La infección por CMV más difundida es
normalmente asintomática. Tras una infección primaria por CMV, los anticuerpos IgM, en
individuos inmunocompetentes, persisten entre 2 a 9 meses. En los pacientes sometidos a
transplantes o inmunodeprimidos, los anticuerpos IgM pueden persistir en el organismo
durante más de 2 años.
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
El presente kit se basa en el método inmunoenzimático (ELISA) y utiliza como marcador
enzimático la peroxidasa. Durante la primera incubación los anticuerpos anti-CMV de la clase
IgG eventualmente presentes en la muestra, se unen al antígeno CMV adherido a la
superficie de los pocillos. Mediante un lavado se elimina aquel material que no se haya unido;
en una posterior incubación se hace reaccionar un segundo anticuerpo (anti-IgG humanas),
conjugado con peroxidasa con el complejo ya formado entre antígenos y anticuerpos. Tras un
nuevo lavado, se añade tetrametilbencidina (TMB) incolora que, al reaccionar con la
peroxidasa, produce un compuesto coloreado. La reacción de desarrollo de color se para
añadiendo H2SO4 y la intensidad del color, medida en un espectrofotómetro a 450 nm y a 405
nm, es directamente proporcional a la concentración de los anticuerpos IgG anti-CMV
presentes en los calibradores y en las muestras.
3. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD
− Los reactivos son suficientes para 96 pocillos (REF K3CG) o para 192 pocillos (REF
K3CGB).
− El kit debe conservarse a 2-8°C.
− La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en su etiqueta.
− Una vez abierto el kit es estable 2 meses a 2-8°C.
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3.1 Reactivos específicos
MTP Microplaca sensibilizada: 1 o 2 microplacas de 96 pocillos/cada una divisibles
individualmente, sensibilizados con CMV purificado e inactivado. Los pocillos no
utilizados deben conservarse a 2-8°C en la bolsa de plástico suministrada, cerrada
herméticamente.
CAL Calibradores: IgG anti-CMV en matriz sérica a las siguientes concentraciones: 10,
30, 60, 120 y 240 UR/mL. Conservante: NaN3 (

5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán observarse las
siguientes normas:
− No mezclar los reactivos específicos (vea 3.1) de lotes diferentes.
− Es posible utilizar reactivos comunes (vea 3.2) de lotes diferentes.
− No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad.
− No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de
contaminación.
− Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones
metálicos o sustancias oxidantes.
− Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente limpios.
− Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable utilizar
pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo.
− No modificar el “Procedimiento Operativo” de ejecución del ensayo. Eventuales
alteraciones de:
• secuencia y cantidades al añadir los reactivos
• tiempos y temperatura de incubación
pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos.
− Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la
utilización de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de datos
clínicos incorrectos.
− En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener una
adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la preparación y
dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y
calibración) de tales instrumentos.
− Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado de las
microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas puede
causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un mantenimiento
adecuado de tales sistemas.
− Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un
espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura errónea
de las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un adecuado
mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos.
− Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La incubación a
temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de sensibilidad y/o
desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un
adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control periódico de la temperatura
registrada.
− Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione perfectamente.
La agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las muestras. Es
necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos.
− Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o el
dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de la
indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o
reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control
periódico de la temperatura registrada.
− Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los
pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del
sistema y resultados clínicos erróneos.
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Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las
siguientes normas de seguridad:
− Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente
infeccioso y durante el ensayo.
− No pipetear los reactivos con la boca.
− No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo.
− Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con cuidado.
Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco lavar con
abundante agua.
− Todos los materiales humanos suministrados con el kit han sido sometidos a análisis
resultando negativos a la presencia de HBsAg, anti-HIV y anti-HCV. Sin embargo, los
ensayos mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales responsables
del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis B y C. Por eso todos los
reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse
potencialmente infecciosos.
− Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar
cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el material
utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y
desecharse según las oportunas modalidades.
− La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede reaccionar con
el plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas altamente explosivas.
Para evitar la formación y la acumulación de dichos compuestos deje correr
abundantemente el agua al eliminar los reactivos.
− Los reactivos para los que no se suministra la ficha de seguridad no contienen sustancias
químicas peligrosas o, si las contienen, están por debajo de los límites de concentración
definidos en el D.Lgs.285/98 conforme a la directiva CEE 91/155.
− Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del 05.02.97 y conforme a las directivas de la
CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos
manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código de
Clasificación CER 180103: como tales, deben eliminarse delegando su recolección y
desecho a empresas especiales autorizadas para ello.
6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El ensayo puede realizarse en muestras de suero o plasma humanos. Las muestras
moderadamente lipémicas no afectan los resultados; las muestras extremadamente lipémicas
o hemolizadas pueden alterar los resultados. La presencia de filamentos de fibrina podría
interferir en el ensayo; asegurarse por lo tanto de que las muestras estén perfectamente
limpias antes de ensayarlas. Las muestras pueden conservarse a 2-8°C durante 1 semana;
para períodos más largos se recomienda conservar las muestras a -20°C. Se aconseja no
congelar y descongelar repetidamente las muestras.
Antes de su uso, diluir las muestras 1:300 con el diluyente de las muestras ya preparado
(ejemplo: 10 µL de muestra + 2990 µL de diluyente).
7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO*
− Esperar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente.
− Agitar las muestras por inversión antes de utilizarlas.
7.1 Preparar los pocillos para el Blanco, el Suero de Control o Calibradores y las
muestras.
7.2 Dispensar 100 µL de Suero de Control o Calibradores y muestras ya diluidas en los
respectivos pocillos.
Nota: el Suero de Control y los Calibradores no deben diluirse.
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7.3 Dispensar 100 µL de Diluyente de las Muestras diluido en el pocillo del blanco.
7.4 Incubar durante 60±5 minutos a 37±2°C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva
suministrada con el kit.
7.5 Lavar los pocillos 4 veces con 350 µL (por pocillo) de solución de lavado diluida.
Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos.
7.6 Dispensar 100 µL de Conjugado Enzimático en todos los pocillos.
7.7 Incubar durante 30±2 minutos a 37±2°C cubriendo la microplaca con la hoja
adhesiva suministrada con el kit.
7.8 Lavar los pocillos como en el punto 7.5.
7.9 Dispensar 100 µL de Cromogeno en todos los pocillos.
7.10 Incubar durante 10 minutos a 37±2°C o 15 minutos a temperatura ambiente (18-
25°C) al resguardo de la luz.
7.11 Dispensar 100 µL de Reactivo de Parada en todos los pocillos.
7.12 Leer la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro
bicromático con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del
instrumento con el blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), leer a 405
nm. Leer en los primeros 15 minutos después de terminar el ensayo.
*En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC para
microplacas, ver el manual correspondiente.
8. ESQUEMA DEL ENSAYO: Ver pág.12.
9. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS *
9.1 Ensayo cualitativo
Considerar la densidad óptica de cada control negativo y calibrador Cut-off (10 UR/mL: Valor
umbral). Comparando la densidad óptica de las muestras con la densidad óptica del
calibrador Cut-off se determina la reactividad o no reactividad ante los anticuerpos IgG anti-
CMV.
Las muestras con valores de densidad óptica inferiores al valor del calibrador 10 UR/mL
(calibrador Cut-off) deben considerarse no reactivas para los anticuerpos IgG anti-CMV. Las
muestras con valores de densidad óptica superiores al valor del calibrador Cut-off deben
considerarse reactivas para los anticuerpos IgG anti-CMV. Las muestras con valores de
densidad óptica comprendidos en el intervalo de ± 10% del calibrador Cut-off, deben
considerarse de interpretación dudosas y deben volverse a ensayar.
9.2 Ensayo cuantitativo
El control negativo debe considerase como el primer punto de la curva de calibración con un
valor de 0 UR/ml de IgG anti-CMV y por lo tanto hace parte de la misma curva. Dibuje la
curva estándar en un papel milimetrado, poniendo en el eje de las abscisas las
concentraciones de los calibradores y en el de las ordenadas la absorbancia obtenida para
cada calibrador. Interpolando sobre la curva de calibración las absorbancias relativas a cada
muestra se obtienen las correspondientes concentraciones de IgG anti-CMV en UR/mL.
- Muestras con valores de IgG inferiores a 10 UR/mL deben considerarse no reactivas ante
los anticuerpos IgG anti-CMV.
- Muestras con valores de IgG comprendidos entre 1 UR/mL y 30 UR/ml deben
considerarse débilmente reactivas.
- Muestras con valores de IgG superiores a 30 UR/mL deben considerarse reactivas ante
los anticuerpos IgG anti-CMV.
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* En el caso de que se utilice el sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, la
lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente con 3 longitudes de onda: 450, 405 y
620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura.
9.3 Ejemplo de cálculo
Los valores siguientes deben considerarse únicamente como un ejemplo y no deben
emplearse en lugar de los datos experimentales.
Descripción Absorbancia IgG anti-CMV Absorbancia
450 nm
405 nm
Calibrador 0 UR/mL 0.080 0.027
Calibrador 10 UR/mL 0.190 0.060
Calibrador 30 UR/mL 0.463 0.154
Calibrador 60 UR/mL 1.494 0.498
Calibrador 120 UR/mL 2.251 0.750
Calibrador 240 UR/mL 2.800 0.930
Muestra 1.794 80 UR/mL 0.598
Nota: Control Negativo = Calibrador 0 UR/mL.
Interpolando sobre la curva de calibración, la muestra ensayada presenta como resultado un
título de IgG anti-CMV de 80 UR/mL.
9.4 Criterios de aceptación
Antes de proceder al cálculo de los resultados, verificar que las absorbancias de los controles
respeten los siguientes valores:
Descripción Valor esperado
Control Negativo < 0.200
OD Cal 240 UR/mL / OD Cal 10 UR/mL > 7.3
OD Cal 10 UR/mL / OD Cal 0 UR/mL > 3.3
Si los valores obtenidos no concuerdan con los esperados, es necesario repetir el ensayo.
9.5 Interpretación de los resultados
− Las muestras no reactivas deben considerarse negativas a la presencia de anticuerpos
IgG anti-CMV.
− Las muestras reactivas y/o débilmente reactivas deben considerarse positivas a la
presencia de anticuerpos IgG anti-CMV.
Extracciones sucesivas de un mismo paciente pueden compararse entre ellas sólo si se
procesan en el mismo ensayo; en este caso un aumento del 60% de la densidad óptica de la
segunda muestra puede considerarse indicativo de una infección reciente o en curso. En tal
caso se aconseja ensayar las IgM específicas.
10. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS
10.1 Especificidad diagnóstica
La especificidad diagnóstica del método se ha evaluado sobre un grupo de 150 muestras no
inmunes a infecciones causadas por CMV, resultando igual al 97.5%.
10.2 Sensibilidad diagnóstica
La sensibilidad diagnóstica del método se ha evaluado sobre un grupo de 246 muestras con
infección pregresa por CMV, resultando igual al 98.7%.
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10.3 Especificidad analítica
La especificidad analítica se define como la capacidad del ensayo de detectar con precisión
el analito en presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra.
Estudios controlados sobre factores potencialmente interferentes han demostrado que las
prestaciones del ensayo no se ven influenciadas por anticoagulantes (EDTA, citrato y
heparina).
10.4 Sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica puede expresarse también como el límite de detección o sea la
cantidad mínima de analito detectable por el ensayo. El límite de detección es 0.07 mIU/mL al
99% de confianza y se ha calculado como la concentración de analito distinguible del
calibrador cero, es decir tres desviaciones estándar (SD) sobre el cero.
10.5 Precisión
La precisión se ha evaluado en instrumentación Radim midiendo la repetitividad y la
reproducibilidad (variabilidad intra-ensayo e inter-ensayo) en 3 sueros con distintas
concentraciones de IgG anti-CMV.
Repetitividad (intra-ensayo)
Suero Media ± D.S.
C.V.
No. Replicados
(UR/mL)
%
a 112.17 ± 11.48 10.24 10
b 69.38 ± 3.24 4.67 10
c 22.2 ± 1.1 5.1 10
Reproducibilidad (inter-ensayo)
Suero Media ± D.S.
C.V.
No. de Ensayos
(UR/mL)
%
a 232.50 ± 13.20 5.70 10
b 91.85 ± 8.67 9.43 10
c 26.22 ± 1.74 6.64 10
11. LÍMITES DEL ENSAYO
Debe tenerse en cuenta que, para definir el estado inmunitario de un paciente ante el CMV,
la presencia de anticuerpos de clase IgG a cualquier nivel no excluye la posibilidad de una
infección en curso, mientras que el ensayo de los anticuerpos específicos de tipo IgM es de
importancia fundamental para el diagnóstico precoz de la infección aguda. En caso de
enfermedad, una intervención rápida permite reducir considerablemente los riesgos
consiguientes. Sin embargo, los resultados del ensayo deben interpretarse con cautela y
convalidarse con evaluaciones clínicas y ulteriores pruebas diagnósticas.
12. LEYENDA SÍMBOLOS: Ver pág. 10
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SÍMBOLOS
EN 980 – EDMA
REF Código de referencia o número de pedido
LOT Lote
Fecha de caducidad
IVD Para uso diagnóstico in vitro
96
192
Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE
Conservar a 2-8°C
Producido por
Riesgo biológico
Consultar las instrucciones de uso
Suficiente para 96-192 determinaciones
RDATE Fecha de referencia
RCNS Reconstituir con
H2O Agua destilada o desionizada
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BIBLIOGRAFÍA
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infection. Scand. J. Inf. Dis. suppl. 34.
2 - Ho M. (1977). Virus infections after trasplantation in man - A brief review.
Arch. Cirol. 55, 1.
3 - Stern H., Turker S.M. (1973). Prospective study of cytomegalovirus
infection in pregnancy. Br. med. J., 2, 268-270.
4 - Pass R.F., Griffith P.D., August A.M. (1983). Antibody Response to
cytomegalovirus after Renal Transplanation: Comparison of Patients with
Recurrent infections. J. Inf. Dis., 147, 40-46.
5 - Cremer N.E., Delvin V.L., Riggs J.L., Hagens S.J. (1984). Anomalus
antibody responses in viral infection; Specific stimulation or polyclonal
activation. J. Clin. Microbiology, 20, 468-472.
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ESQUEMA DEL ENSAYO
Predilución de la muestra: 1/300
Pocillos Blanco NEG CAL Muestras
Reactivos
NEG ----- 100 µL ----- -----
CAL ----- 100 µL
Muestras ----- ----- 100 µL
DIL 100 µL ----- -----
− Incubar a 37±2°C, 60±5 min.
− Aspirar y Lavar: 4 x 350 µL.
CONJ 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubar a 37±2°C, 30±2 min.
− Aspirar y Lavar: 4 x 350 µL.
TMB 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubar a 37±2°C, 10' o T.A. 15'
STOP 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Leer a 450-405 nm.
RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
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