IgE TOTALI IEMA WELL REF - Radim S.p.A.

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Procedimiento A (menos sensible): Calibrador: 0, 5, 25, 100, 300 e 1000 IU/mL Incubación 30 minutos. Muestras no diluidas Procedimiento B (más sensible): Calibrador: 0, 1, 5, 25, 100 e 300 IU/mL Incubación 60 minutos. Muestras no diluidas Procedimiento C Calibrador: 0, 5, 25, 100, 300 e 1000 IU/mL Incubación 30 minutos. Muestras diluidas 1:5 7.1 Preparar los pocillos para: Blanco, Calibradores, Suero de Control y Muestras. 7.2 Dispensar 10 µL de cada Calibrador, del Suero de Control y de las muestras no diluidas (Procedimiento A y Procedimiento B) o diluidas 1:5 (Procedimiento C) en los respectivos pocillos. 7.3 Dispensar 200 µL de Conjugado Enzimático en todos los pocillos excepto el correspondiente al Blanco. 7.4 Cubir la microplaca con la hoja adhesiva y agitar delicamente. 7.5 Incubar durante 30±2 minutos (Procedimiento A y Procedimiento C), o 60±5 minutos (Procedimiento B) a temperatura ambiente (18-25°C) en agitación obital (1200 r.p.m.). 7.6 Retirar la hoja adhesiva y aspirar cuidadosamente la mezcla de incubación de todos los pocillos. 7.7 Lavar los pocillos 4 veces con 350 µL (por pocillo) de Solución de Lavado diluida. Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos. 7.8 Dispensar 200 µL de Solución Sustrato-Cromógeno en todos los pocillos (ver parágrafo reactivos). 7.9 Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (18-25°C) en agitación orbital (1200 rpm) al resguardo de la luz. 7.10 Dispensar 100 µL de Reactivo de Parada en todos los pocillos. 7.11 Leer la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro bicromático con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del instrumento con el blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), leer a 405 nm. Leer en los primeros 20 minutos después de terminar el ensayo. *En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, ver el manual correspondiente. 8. ESQUEMA DEL ENSAYO: ver p. 14 9. CÁLCULO DE RESULTADOS Para obtener una mejor sensibilidad, este método utiliza una lectura espectrofotométrica a dos longitudes de onda (450 y 405 nm). Para las muestras con concentraciones de IgE comprendidas entre 0 y 100 IU/mL, se debe utilizar la lectura a 450 nm; para muestras con niveles de IgE superiores 100 IU/mL, leer a 405 nm. KP21IW – IgE Totali Iema Well M145.es – Rev. 9 – 06/2006 – Pag. 8/14
Trazar la curva de calibración sobre papel milimetrado, registrando sobre el eje de las abscisas las concentraciones de los calibradores y en el eje de las ordenadas, la absorbancia obtenida para cada uno de los calibradores. Al interpolar sobre la curva de calibración las absorbancias relativas a cada muestra, se obtienen las concentraciones correspondientes de IgE expresadas en IU/mL, en caso de muestras diluidas multiplicar por el factor de dilución. Si para el procedimiento se utiliza un instrumento automático para microplacas RADIM y/o SEAC, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente a 3 diferentes longitudes de onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo así la ampliación del rango de lectura. 9.1 Ejemplo de cálculo Los valores que se indican a continuación son simplemente ilustrativos y no deben emplearse en lugar de los datos obtenidos. Procedimiento A: Descripción Absorbancia IgE Absorbancia IgE 450 nm 405 nm Calibrador 0 IU/mL 0.018 0.006 Calibrador 5 IU/mL 0.147 0.051 Calibrador 25 IU/mL 0.520 0.179 Calibrador 100 IU/mL 1.667 0.574 Calibrador 300 IU/mL >3.000 1.117 Calibrador 1000 IU/mL >3.000 1.623 Muestra 1 0.865 46 IU/mL 0.298 Muestra 2 >3.000 1.252 490 IU/mL Procedimiento B: Descripción Absorbancia IgE Absorbancia IgE 450 nm 405 nm Calibrador 0 IU/mL 0.020 0.007 Calibrador 1 IU/mL 0.070 0.024 Calibrador 5 IU/mL 0.269 0.093 Calibrador 25 IU/mL 1.084 0.373 Calibrador 100 IU/mL 2.800 0.990 Calibrador 300 IU/mL >3.000 1.670 Muestra 1 0.313 6.5 IU/mL 0.108 Muestra 2 >3.000 1.206 165 IU/mL Procedimiento C: Para obtener el ejempo de cálculo relativo al señal analítico de la curva de calibración, referirse a lo descrito en el procedimiento A. Las muestras deben multiplicarse por el Factor de dilución: 5 KP21IW – IgE Totali Iema Well M145.es – Rev. 9 – 06/2006 – Pag. 9/14
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