IgE TOTALI IEMA WELL REF - Radim S.p.A.

IgE TOTALI
REF KP21IW
IEMA WELL
96
Español
M145.es – Rev. 9 – 06/2006

REACTIVOS DEL KIT
Reactivos Cantidad
MTP
CAL
CONJ
DIL CONJ
CTR
WASH
TMB
SUBS
STOP
1 x 96 Listo para usar
1 x 2 mL
6 x 1 mL
Liofilizados
1 x 2.7 mL Concentrado
2 x 12 mL Listo para usar
1 x 1 mL Liofilizado
1 x 50 mL Concentrado
1 x 15 mL
Listo para usar
1 x 15 mL Listo para usar
1 x 14 mL Listo para usar
KP21IW – IgE Totali Iema Well
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ENSAYO INMUNOENZIMOMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA
DE LAS IgE TOTALES EN SUERO HUMANO.
PARA USO DIAGNÓSTICO “IN VITRO”
1. APLICACIONES CLÍNICAS
Las inmunoglobulinas E (IgE) aisladas por primera vez (1968) por Bennich y Johansson
en Uppsala, constituyen la quinta clase de las Inmunoglobulinas. La forma monómera
de las IgE está formada por dos cadenas livianas (K, lambda) unidas por puentes de
sulfuro y dos cadenas pesadas (ε) capaces de fijar el complemento. Las IgE tienen
peso molecular comprendido entre 188.000 y 196.000, contienen el 12% de
carbohidratos y tienen una constante de sedimentación de 7,925 S.
La actividad reactiva de las IgE se debe a la notable afinidad que las cadenas E, tienen
con receptores específicos presentes en la membrana de los mastocitos y de los
polinucleares basófilos. La liberación de mediadores farmacológicos (ejemplo:
Histamina) está determinada por la interacción de las IgE, ligadas a los receptores de
membranas, con alérgenos inhalados o absorbidos.
En los sujetos atópicos (alta concentración de IgE) los receptores están saturados al
100%. En sujetos no atópicos (bajas concentraciones de IgE), la saturación alcanza un
máximo de un 20%. En los sujetos normales la concentración de IgE es
extremadamente baja. Sujetos con patologías alérgicas (asma, alergia al polen,
eczemas) presentan elevadas concentraciones de IgE. Tal concentración es correlativa
al grado de inmunoestimulación. Cuantos más son los alérgenos a los cuales el
paciente es alérgico y expuesto y cuanto más graves son los síntomas, tanto más
elevado es el nivel de IgE. La concentración de las IgE puede estar sujeta a variaciones
circadianas además de presentar una notable variación entre un individuo y otro.
Los niveles de IgE tienden a aumentar desde el nacimiento hasta los 60-65 años,
después de lo cual pueden sufrir un decrecimiento.
No siempre bajos niveles de IgE excluyen una etiología de tipo alérgico. Raras veces,
en efecto, alergias monovalentes (sensibilidad a un solo alérgeno) se caracterizan por
tener bajos niveles de IgE. En estos casos el diagnóstico se puede hacer sólo con
ensayos muy sensibles para las IgE específicas.
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
El presente kit se basa en el método inmunoenzimométrico (IEMA). Se utilizan dos
anticuerpos distintos anti-IgE, uno absorbido en los pocillos y el otro conjugado con
peroxidasa de rábano (HRPO). Durante la incubación, las IgE presentes en los
calibradores y en las muestras se une al mismo tiempo con ambos anticuerpos,
formando un "sándwich". Al final de la incubación el material que no se haya unido se
elimina mediante aspiración y lavado. La actividad enzimática que quede fijada a la fase
sólida será directamente proporcional a la concentración de IgE en los calibradores y en
las muestras, y se manifiesta añadiendo a los pocillos una solución de cromógeno
(tetrametilbencidina, TMB) y un tampón substrato. La intensidad del color desarrollado
se mide mediante un espectrofotómetro a 450 y a 405 nm.
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3. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD
− Los reactivos son suficientes para 96 pocillos.
− Il kit debe conservarse a 2-8°C.
− La fecha de caducidad de cada reactivo está indicata en su etiqueta.
− Una vez abierto el kit es estable durante 2 meses a 2-8°C.
3.1 Reactivos Específicos
MTP Microplaca Sensibilizada: 1 microplaca con 96 pocillos divisibles
singularmente, sensibilizados con anticuerpo monoclonal anti-IgE
(ratón). Los pocillos no utilizados deben conservarse a 2-8°C en la
bolsa de plástico transparente suministrada, cerrada cuidadosamente.
CAL Calibradores: 7 viales de IgE en matriz sérica, fiofilizados, con las
siguientes concentraciones: 0, 1, 5, 25, 100, 300 e 1000 IU/mL.
Conservante: tiomersal (

TMB Crómogeno: 1 vial (15 mL) de tetrametilbencidina con tampón citratofosfato
y DMSO. Listo para usar.
SUBS Tampón sustrato: 1 vial (15 mL) de tampón citrato-fosfato y H2O2.
Listo para usar.
Nota: Para obtener la solución sustrato, mezclar en partes iguales el
Cromógeno con el Tampón Sustrato utilizando un vial de vidrio
oscuro bien limpio; conservar la solución obtenida al resguardo de la
luz. Dispensar la solución dentro de 1 ora desde el momento de la
preparación.
STOP Reactivo de Parada: 1 vial (14 mL) de H2SO4 1N. Listo para usarse.
CPA Cubreplaca adhesivo.
Bolsa de plástico transparente con cierre minigrip.
4. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO
4.1 Ensayo manual
− Micropipetas automáticas con puntas desechables de volumen variable.
− Cilindros graduados para la dilución de los reactivos.
− Agitador para microplacas, regulable a 1200 rpm
− Bomba de aspiración o instrumento automático de lavado de microplaca.
− Espectrofotómetro de precisión para microplacas, capaz de medir la absorbancia en
el intervalo 0-3.0 A con una longitud de onda de 450 y 405 nm.
− Papel milimetrado.
− H2O destilada.
− Diluyente de las muestras
4.2 Ensayo automático
− El kit puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en
microplaca.
− Se garantiza la aplicabilidad en instrumentación RADIM y/o SEAC.
− En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es
responsabilidad del usuario asegurarse de que el kit haya sido oportunamente
validado.
5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán observarse las
siguientes normas:
− No mezclar los reactivos específicos (vea 3.1) de lotes diferentes.
− Es posible utilizar reactivos comunes (vea 3.2) de lotes diferentes.
− No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad.
− No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de
contaminación.
− Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones
metálicos o sustancias oxidantes.
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− Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente
limpios.
− Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable
utilizar pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo.
− No modificar el “Procedimiento Operativo” de ejecución del ensayo. Eventuales
alteraciones de:
• secuencia y cantidades al añadir los reactivos
• tiempos y temperatura de incubación
pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos.
− Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la
utilización de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de
datos clínicos incorrectos.
− En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener
una adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la
preparación y dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado
mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos.
− Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado
de las microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas
puede causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un
mantenimiento adecuado de tales sistemas.
− Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un
espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura
errónea de las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un
adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos.
− Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La
incubación a temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de
sensibilidad y/o desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos).
Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control
periódico de la temperatura registrada.
− Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione
perfectamente. La agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las
muestras. Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos.
− Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o
el dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de
la indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o
reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control
periódico de la temperatura registrada.
− Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los
pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad
del sistema y resultados clínicos erróneos.
Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las
siguientes normas de seguridad:
− Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente
infeccioso y durante el ensayo.
− No pipetear los reactivos con la boca.
− No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo.
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− Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con
cuidado. Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco
lavar con abundante agua.
− Todo el materiale de origen humano utilizado en la preparación del presente kit se
ha sometido a análisis, resultando repetidamente negativos a la presencia de
HBsAg, anti-HIV y anti-HCV. De todos modos ningún test actualmente disponible
garantiza la ausencia de los agentes virales responsables del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y de la Hepatitis B y C. Por eso todos los
reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse
potencialmente infecciosos.
− Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar
cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el
material utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente
infeccioso y desecharse según las oportunas modalidades.
− La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede
reaccionar con el plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas
altamente explosivas. Para evitar la formación y la acumulación de dichos
compuestos deje correr abundantemente el agua al eliminar los reactivos.
− Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del 05.02.97 y conforme a las directivas de
la CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por
procesos manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho
peligroso, código de Clasificación CER 180103: como tales, deben eliminarse
delegando su recolección y desecho a empresas especiales autorizadas para ello.
6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El ensayo puede realizarse en muestras de sueros. Las muestras altamente lipémicas o
hemolizadas deberán descartarse. Las muestras pueden conservarse a 2-8°C durante
1 semana; para períodos más largos conservar las muestras a -20°C. Se aconseja no
congelar y descongelar repetidamente las muestras.
Las muestras con presuntas concentraciones de IgE superiores a 1000 IU/mL deben
diluirse con el Calibrador Cero (Procedimiento A).
En el Procedimiento C diluir las muestras 1:5 con el Diluyente de las Muestras código
KP21IWDC suministrado a petición (es. 10 μl de muestra + 40 μl de Diluyente).
7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO *
− Esperar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente.
− Agitar las muestras por inversión antes del uso.
Nota: Con el presente kit pueden utilizarse 3 distintos procedimientos de ensayo que se
diferencian entre ellos por la sensibilidad, tiempo de incubación, Calibradores utilizados
y dilución de las muestras.
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Procedimiento A (menos sensible): Calibrador: 0, 5, 25, 100, 300 e 1000 IU/mL
Incubación 30 minutos.
Muestras no diluidas
Procedimiento B (más sensible): Calibrador: 0, 1, 5, 25, 100 e 300 IU/mL
Incubación 60 minutos.
Muestras no diluidas
Procedimiento C Calibrador: 0, 5, 25, 100, 300 e 1000 IU/mL
Incubación 30 minutos.
Muestras diluidas 1:5
7.1 Preparar los pocillos para: Blanco, Calibradores, Suero de Control y Muestras.
7.2 Dispensar 10 µL de cada Calibrador, del Suero de Control y de las muestras no
diluidas (Procedimiento A y Procedimiento B) o diluidas 1:5 (Procedimiento C)
en los respectivos pocillos.
7.3 Dispensar 200 µL de Conjugado Enzimático en todos los pocillos excepto el
correspondiente al Blanco.
7.4 Cubir la microplaca con la hoja adhesiva y agitar delicamente.
7.5 Incubar durante 30±2 minutos (Procedimiento A y Procedimiento C), o 60±5
minutos (Procedimiento B) a temperatura ambiente (18-25°C) en agitación
obital (1200 r.p.m.).
7.6 Retirar la hoja adhesiva y aspirar cuidadosamente la mezcla de incubación de
todos los pocillos.
7.7 Lavar los pocillos 4 veces con 350 µL (por pocillo) de Solución de Lavado diluida.
Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos.
7.8 Dispensar 200 µL de Solución Sustrato-Cromógeno en todos los pocillos (ver
parágrafo reactivos).
7.9 Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (18-25°C) en agitación
orbital (1200 rpm) al resguardo de la luz.
7.10 Dispensar 100 µL de Reactivo de Parada en todos los pocillos.
7.11 Leer la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro
bicromático con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del
instrumento con el blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), leer a
405 nm. Leer en los primeros 20 minutos después de terminar el ensayo.
*En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC
para microplacas, ver el manual correspondiente.
8. ESQUEMA DEL ENSAYO: ver p. 14
9. CÁLCULO DE RESULTADOS
Para obtener una mejor sensibilidad, este método utiliza una lectura
espectrofotométrica a dos longitudes de onda (450 y 405 nm). Para las muestras con
concentraciones de IgE comprendidas entre 0 y 100 IU/mL, se debe utilizar la lectura a
450 nm; para muestras con niveles de IgE superiores 100 IU/mL, leer a 405 nm.
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Trazar la curva de calibración sobre papel milimetrado, registrando sobre el eje de las
abscisas las concentraciones de los calibradores y en el eje de las ordenadas, la
absorbancia obtenida para cada uno de los calibradores. Al interpolar sobre la curva de
calibración las absorbancias relativas a cada muestra, se obtienen las concentraciones
correspondientes de IgE expresadas en IU/mL, en caso de muestras diluidas multiplicar
por el factor de dilución.
Si para el procedimiento se utiliza un instrumento automático para microplacas RADIM
y/o SEAC, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente a 3 diferentes
longitudes de onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo así la ampliación del rango de
lectura.
9.1 Ejemplo de cálculo
Los valores que se indican a continuación son simplemente ilustrativos y no deben
emplearse en lugar de los datos obtenidos.
Procedimiento A:
Descripción Absorbancia IgE Absorbancia IgE
450 nm
405 nm
Calibrador 0 IU/mL 0.018 0.006
Calibrador 5 IU/mL 0.147 0.051
Calibrador 25 IU/mL 0.520 0.179
Calibrador 100 IU/mL 1.667 0.574
Calibrador 300 IU/mL >3.000 1.117
Calibrador 1000 IU/mL >3.000 1.623
Muestra 1 0.865 46 IU/mL 0.298
Muestra 2 >3.000 1.252 490 IU/mL
Procedimiento B:
Descripción Absorbancia IgE Absorbancia IgE
450 nm
405 nm
Calibrador 0 IU/mL 0.020 0.007
Calibrador 1 IU/mL 0.070 0.024
Calibrador 5 IU/mL 0.269 0.093
Calibrador 25 IU/mL 1.084 0.373
Calibrador 100 IU/mL 2.800 0.990
Calibrador 300 IU/mL >3.000 1.670
Muestra 1 0.313 6.5 IU/mL 0.108
Muestra 2 >3.000 1.206 165 IU/mL
Procedimiento C:
Para obtener el ejempo de cálculo relativo al señal analítico de la curva de calibración,
referirse a lo descrito en el procedimiento A. Las muestras deben multiplicarse por el
Factor de dilución: 5
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9.2 Valores Normales
Los valores indicados a continuación son sólo indicativos. Se recomienda que cada
laboratorio establezca su propio rango de referencia.
− Menor de 20 IU/mL: génesis alérgica no probable
− Entre 20 y 100 IU/mL: génesis alérgica dudosa
− Mayor de 100 IU/mL: génesis alérgica
9.3 Criterios de aceptación
Antes de proceder al cálculo de los resultados, verifique que la concentración del suero
de control esté dentro del rango de aceptación descrito en la hoja de Control de calidad.
10. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS
10.1 Especificidad
El presente método analítico no ha evidenciado ninguna reacción cruzada con las
siguientes clases de Inmunoglobulias humanas: IgA, IgM, IgG e IgD.
10.2 Sensibilidad
La sensibilidad ha sido calculada sobre la curva de calibración y expresada como la
mínima dosis distinguible significativamente de la respuesta respecto al calibrador cero
(valor medio + 3 D. E.). Tal dosis es de 1 IU/mL para el procedimiento A y C y para el
procedimiento B es de 0.4 IU/mL.
10.3 Precisión
La precisión ha sido evaluada midiendo la variabilidad intra-ensayo e inter-ensayo
utilizando 3 sueros con diferentes concentraciones de IgE.
Repetibilidad (Intra-ensayo)
Procedimiento A Procedimiento B
Suero Media ± D.E. C.V. Media ± D.E. C.V. Replicados
(IU/mL) % (IU/mL) % n.
a 24.2 ± 0.95 3.9 25.8 ± 0.52 2.0 10
b 43.7 ± 1.83 4.2 51.1 ± 0.96 1.9 10
c 77.2 ± 2.93 3.8 87.0 ± 1.94 2.2 10
Reproducibilidad (Inter-ensayo)
Procedimiento A Procedimiento B
Suero Media ± D.E. C.V. Media ± D.E. C.V. Ensayos
(IU/mL) % (IU/mL) % n.
a 21.9 ± 2.96 13.5 25.4 ± 2.33 9.2 10
b 42.9 ± 3.71 8.6 49.0 ± 2.65 5.4 10
c 80.4 ± 6.36 7.9 83.4 ± 2.65 3.2 10
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10.4 Exactitud
La exactitud del método ha sido evaluada mediante el test de recuperación y el test de
paralelismo. Los datos indicados a continuación se obtuvieron mediante el
Procedimiento A.
Test de Recuperación
Cantidades de IgE conocidas se añadieron a un pool de sueros normales y fueron
ensayadas.
Añadido Previsto Medido Recuperación
(IU/mL) (IU/mL) (IU/mL) %
P ---- 7.0 ----
P + 200 207.0 206.5 99.7
P + 100 107.0 104.2 97.4
P + 50 57.0 53.0 93.0
P + 25 32.0 30.4 95.0
P + 12.5 19.5 19.1 97.9
P + 6.25 13.2 13.0 98.5
Test de Paralelismo
Un suero con elevado contenido de IgE se ha ensayado a varias diluciones efectuadas
con el Calibrador Cero.
Dilución Previsto Medido
(IU/mL) (IU/mL)
S no diluido ---- 120.0
1:2 60.0 61.1
1:4 30.0 31.3
1:8 15.0 15.6
1:16 7.5 8.5
1:32 3.7 3.5
1:64 1.9 1.7
10.5 Efecto Gancho
En cualquier muestra con un contenido de antígeno muy elevado que sea valorada no
diluida por un método “sándwich” de incubación unica como el utilizado en el presente
kit, pueden obtenerse por el “Efecto Gancho” valores aparentes de concentración
inferiores al real. El presente kit no da lugar al “Efecto Gancho” hasta valores de
concentración de 10.000 IU/mL en ambos procedimientos.
11. LÍMITES DEL ENSAYO
Los resultados del ensayo deben interpretarse con cautela y convalidarse mediante
evaluaciones clínicas y ulteriores pruebas diagnósticas.
12. LEYENDA SÍIMBOLOS: ver p. 12
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SÍMBOLOS
EN 980 – EDMA
REF Código de referencia o número de pedido
LOT Lote
Fecha de caducidad
IVD Para uso diagnóstico in vitro
96
Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE
Conservar a 2-8°C
Producido por
Riesgo biológico
Consultar las instrucciones de uso
Suficiente para 96 determinaciones
RDATE Fecha de referencia
RCNS Reconstituir con
H2O Agua destilada o desionizada
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BIBLIOGRAFÍA
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ESQUEMA DEL ENSAYO
Reag.
Pocillos
Blanco
CAL CTR Muestras
CAL ---- 10 µL ---- ----
CTR ---- ---- 10 µL ----
Procedimiento A y B muestra sin diluir
Procedimiento C Predilución de la muestra: 1:5
Muestras ---- ---- ---- 10 µL
CONJ ---- 200 µL 200 µL 200 µL
− Incubar:
− Aspirar y lavar: 4 x 350 µL.
Proc. A: T.A. 30±2 min. (1200 rpm)
Proc. B: T.A. 60±5 min. (1200 rpm)
Proc. C: T.A. 30±2 min. (1200 rpm)
TMB -SUBS 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL
− Incubar: T.A. 15' (1200 rpm)
STOP 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Leer: 450-405 nm.
RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
Tel.: +39 06 91.249.1 - Fax: +39 06 91.249.443
National Order Entry: +39 06 91.249.702
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