0123 CITOMEGALOVIRUS IgG AVIDITY EIA WELL ... - Radim S.p.A.

0123
CITOMEGALOVIRUS
IgG AVIDITY
REF K3CGA
EIA WELL
96
45 Determinaciones
Español
M169.es – Rev.8 – 02/2006

REACTIVOS DEL KIT
Reactivos Cantidad Estado Físico
MTP 1 x 96 Listo para usar
WASH 1 x 50 mL Concentrada
DIL 1 x 20 mL Concentrado
CTR BA 1 x 2 mL Liofilizado
CTR AA 1 x 2 mL Liofilizado
DISS 1 x 10 mL Listo para usar
CONJ 1 x 14 mL Listo para usar
TMB 2 x 15 mL Listo para usar
STOP 1 x 14 mL Listo para usar
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ENSAYO INMUNOENZIMATICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA AVIDEZ
DE LOS ANTICUERPOS IgG ANTI-CITOMEGALOVIRUS EN SUERO O
PLASMA HUMANO.
PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO
1. APLICACIONES CLÍNICAS
El citomegalovirus (CMV) es un virus de estructura icosaédrica con un diámetro de 180 – 250
nm, perteneciente a la familia de los Herpes virus. El virus tiene efectos citopatológicos con
engrosamiento de las células huespedes con inclusiones citoplasmáticas y nucleares.
El CMV está considerado como uno de los factores biológicos más importantes causantes de
anomalias congénitas como consecuencia de infecciones imtrauterinas. Aproximadamente el
2% de las mujeres embarazadas contraen una infección primaria o una reinfección, mientras el
10 –20% de los neonatos con infecciones congénitas causadas por CMV presentan daños
significativos en el sistema nervioso central. Actualmente se considera que el daño fetal se
debe principalmente a una infección primaria, y no tanto a una reinfección.
El CMV es también una importante causa de complicaciones en el transplante de órganos,
especialmente de riñón. También en estos casos la infección primaria tiene un impacto clínico
mucho mayor que la reinfección.
El diagnóstico de una infección primaria de reciente adquisición mediante el ensayo de las IgM
específicas resulta difícil dada la presencia de esta clase de anticuerpos también en casos de
infecciones recurrentes; de hecho las IgM pueden encontrarse en la circulación durante varios
meses, y en pacientes inmunodeprimidos, hasta durante 2 años. La medida de la avidez de los
anticuerpos IgG específicos es particularmente útil para el diagnóstico de una infección
primaria, ya que la primera respuesta anticorpal IgG a la infección esta formada por anticuerpos
de baja avidez, cuya unión con el antígeno específico puede disociarse fácilmente.
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
El presente kit se basa en el método inmunoenzimático (ELISA), en el cual el suero del
paciente se hace reaccionar en duplicado con el antígeno CMV adherido a los pocillos de una
microplaca. Tras la primera incubación, seguida de un lavado de la microplaca, los duplicados
de cada suero se incuban con dos soluciones tampón distintas, una de las cuales contiene
urea. Este último reactivo provoca la disociación de la unión antígeno-anticuerpo formado
precedentemente, en distinta medida según la avidez de los anticuerpos. Tras un nuevo lavado,
los anticuerpos que queden unidos a la fase sólida se evidencian mediante sucesivas
reacciones con un anticuerpo anti-IgG humanas, marcado con peroxidasa (HRPO), y con un
cromógeno (TMB) en tampón substrato. La relación entre las densidades ópticas de los dos
pocillos, medidas a 450 y/o 405 nm, se calcula y expresa como porcentaje de avidez.
3. REACTIVOS CONTENIDOS EN EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD
- Los reactivos son suficientes para 96 pocillos, que corresponden a 45 determinaciones.
- El kit debe conservarse a 2-8ºC.
- La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en su etiqueta.
- Una vez abierto el kit es estable 2 meses a 2-8ºC.
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3.1 Reactivos específicos
MTP Microplaca sensibilizada: 1 microplaca de 96 pocillos divisibles
CTR BA
individualmente, sensibilizados con el antígeno CMV. Los pocillos no utilizados
deben conservarse a 2-8°C en la bolsa de plástico suministrada, cerrada
herméticamente.
Control de Baja Avidez: 1 vial de matriz sérica con IgG humanas anti-CMV de
baja avidez. Liofilizado y coloreado de rojo. Conservante: NaN3 (

− Espectrofotómetro de precisión para microplacas, capaz de medir la absorbancia en el
intervalo 0-3.0 A con una longitud de onda de 450 y 405 nm.
− H2O destilada.
4.2 Ensayo automático
− El kit puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en microplaca.
− Se garantiza la aplicabilidad en instrumentación RADIM y/o SEAC.
− En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es responsabilidad del
usuario asegurarse de que el kit haya sido oportunamente validado.
5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán observarse las siguientes
normas:
− No mezclar los reactivos específicos (vea 3.1) de lotes diferentes.
− Es posible utilizar reactivos comunes (vea 3.2) de lotes diferentes.
− No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad.
− No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de
contaminación.
− Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones metálicos
o sustancias oxidantes.
− Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente limpios.
− Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable utilizar
pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo.
− No modificar el “Procedimiento Operativo” de ejecución del ensayo. Eventuales alteraciones
de:
• secuencia y cantidades al añadir los reactivos
• tiempos y temperatura de incubación
pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos.
− Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la utilización
de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de datos clínicos
incorrectos.
− En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener una
adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la preparación y
dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y
calibración) de tales instrumentos.
− Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado de las
microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas puede
causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un mantenimiento adecuado
de tales sistemas.
− Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un
espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura errónea de
las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un adecuado
mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos.
− Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La incubación a
temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de sensibilidad y/o
desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un
adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control periódico de la temperatura
registrada.
− Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione perfectamente. La
agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las muestras. Es necesario un
adecuado mantenimiento de tales instrumentos.
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− Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o el
dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de la
indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos).
Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control periódico de la
temperatura registrada.
− Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los
pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del
sistema y resultados clínicos erróneos.
Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las
siguientes normas de seguridad:
− Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente infeccioso
y durante el ensayo.
− No pipetear los reactivos con la boca.
− No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo.
− Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con cuidado.
Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco lavar con
abundante agua.
− Todos los materiales humanos suministrados con el kit han sido sometidos a análisis
resultando negativos a la presencia de HBsAg, anti-HIV y anti-HCV. Sin embargo, los
ensayos mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales responsables
del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis B y C. Por eso todos los
reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse
potencialmente infecciosos.
− Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar
cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el material
utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y
desecharse según las oportunas modalidades.
− La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede reaccionar con el
plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas altamente explosivas. Para
evitar la formación y la acumulación de dichos compuestos deje correr abundantemente el
agua al eliminar los reactivos.
− Los reactivos para los que no se suministra la ficha de seguridad no contienen sustancias
químicas peligrosas o, si las contienen, están por debajo de los límites de concentración
definidos en el D.Lgs.285/98 conforme a la directiva CEE 91/155.
− Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del 05.02.97 y conforme a las directivas de la CEE
(91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos
manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código de
Clasificación CER 180103: como tales, deben eliminarse delegando su recolección y
desecho a empresas especiales autorizadas para ello.
6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El ensayo puede realizarse en muestras de suero o plasma humanos. Las muestras
moderadamente lipémicas no afectan los resultados; las muestras extremadamente lipémicas o
hemolizadas pueden alterar los resultados. La presencia de filamentos de fibrina podría
interferir en el ensayo; asegurarse por lo tanto de que las muestras estén perfectamente
limpias antes de ensayarlas. Las muestras pueden conservarse a 2-8°C durante 1 semana;
para períodos más largos se recomienda conservar las muestras a -20°C. Se aconseja no
congelar y descongelar repetidamente las muestras. Si se quiere comparar distintas
extracciones de un mismo paciente, se aconseja procesarlas en el mismo ensayo.
Antes de su uso, diluir las muestras 1:300 con el diluyente de las muestras ya preparado
(ejemplo: 10 µL de muestra + 2990 µL de diluyente).
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7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO*
− Esperar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente.
− Agitar las muestras por inversión antes de utilizarlas.
7.1 Preparar los pocillos en duplicado para el Blanco, el Control de Baja Avidez, el Control
de Alta Avidez y las muestras.
7.2 Dispensar 100 µL de Control de Baja Avidez en los pocillos C1 y D1; 100 µL de Control
de Alta Avidez en los pocillos E1 y F1; 100 µL de la primera muestra diluida en los
pocillos G1 y H1 y continuar de este modo con las muestras sucesivas.
7.3 Incubar durante 60±5 minutos a 37±2°C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva
suministrada con el kit.
7.4 Aspirar el líquido en los pocillos y lavar los pocillos 4 veces con 350 µL (por pocillo) de
Solución de Lavado diluida. Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos.
7.5 Dispensar 100 µL de Diluyente de las Muestras diluido en los pocillos impares (A1, C1,
E1, G1, etc) y 100 µL de Reactivo Disociante en los pocillos pares (B1, D1, F1, H1 etc).
7.6 Incubar durante 30±2 minutos a 37±2°C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva
suministrada con el kit.
7.7 Aspirar y Lavar los pocillos como en el punto 7.4.
7.8 Dispensar 100 µL de Conjugado Enzimático en todos los pocillos.
7.9 Incubar durante 30±2 minutos a 37±2°C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva
suministrada con el kit.
7.10 Aspirar y Lavar los pocillos como en el punto 7.4.
7.11 Dispensar 100 µL de Cromógeno en todos los pocillos.
7.12 Incubar durante 10 minutos a 37±2°C al resguardo de la luz.
7.13 Dispensar 100 µL de Reactivo de Parada en todos los pocillos.
7.14 Leer la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro bicromático
con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del instrumento con el
blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), leer a 405 nm. Leer en los
primeros 15 minutos después de terminar el ensayo.
*En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC para
microplacas, ver el manual correspondiente.
8. ESQUEMA DEL ENSAYO: Ver pág.12.
9. CALCOLO DEI RISULTATI *
9.a Restar a todos los pocillos el valor del Blanco (media de las densidades ópticas de los
pocillos A1 e B1).
9.b Verificar para cada muestra que la densidad óptica de los pocillos incubados con diluyente
de las muestras sea > 0.300. En caso contrario, las muestras no presentan una
concentración de IgG suficiente para valorar su avidez (pacientes negativos a la infección
por CMV, o infectados pero con una respuesta anticorpal muy débil). En caso sea >0.300,
proceder con el cálculos de los resultados.
9.c Calcular para cada muestra y para los sueros de control la relación porcentual entre la
densidad óptica del pocillo incubado con el reactivo disociante con la del pocillo incubado
con el diluyente de las muestras. Esta relación corresponde al porcentaje de avidez de la
muestra o del suero de control.
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D.O. con R. Disociante
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ x 100 = % de avidez
D.O. con Dil. Muestras
9.d Las muestras que presenten, en uno o ambos pocillo una D.O. > 3.000 a 450 nm deben
leerse a 405 nm. Sobre esta segunda lectura deben calcularse los porcentajes de avidez
como se indica en el punto 9.c.
* En el caso de que se utilice el sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, la
lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente con 3 longitudes de onda: 450, 405 y
620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura.
9.1 Ejemplo de Cálculo
Muestra D.O. con D.O. con % di avidez
Dil. Muestras R. Disociante
C. Baja Avidez 0.947 0.178 18.8
C. Alta Avidez 1.244 0.972 78.1
Muestra 0.565 0.080 14.1
9.2 Criterios de Aceptación
La densidad óptica a 450 nm del Control de Baja Avidez y del Control de Alta Avidez, medida
en los pocillos incubados con el diluyente de las muestras debe ser > a 0.500 para ambos
controles. El porcentaje de avidez calculado como indicado anteriormente, debe resultar < 35%
para el Control de Baja Avidez y > 45% para el Control de Alta Avidez. De todas maneras, los
resultados del ensayo deben convalidarse con valoraciones clínicas y posteriores pruebas
diagnósticas.
9.3 Interpretación de los Resultados
% avidez > 45% = presencia de IgG anti-CMV de alta avidez
% avidez 35-45% = presencia de IgG anti-CMV de media avidez (zona gris)
% avidez < 35% = presencia de IgG anti-CMV de baja avidez
10. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS
10.1 Especificidad Diagnóstica
La especificidad diagnóstica se ha valorado sobre un panel de 118 muestras con previas
infecciones o infecciones secundarias clínicamente comprobadas, y ha resultado ser del
97.4%.
10.2 Sensibilidad Diagnóstica
La sensibilidad se ha valorado sobre un panel de 33 muestras con infección primaria, y ha
resultado ser del 93.9%.
10.3 Especificidad Analítica
La especificidad analítica, se define como la capacidad del ensayo de revelar de un modo
exacto el analito en presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la
muestra. Estudios controlados sobre factores potencialmente interferentes han demostrado que
las prestaciones del ensayo no se ven influenciadas por anticoagulantes (EDTA y heparina).
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10.5 Precisión
La precisión se ha valorado en instrumentación Radim midiendo la repetitividad y la
reproducibilidad (variabilidad intra-ensayo e inter-ensayo) en 3 sueros con diferentes % de
avidez.
Repetitividad (Intra-ensayo)
Suero Media ± D.E. C.V. Replicados
(% avidez) % n.
a 11.5 ± 0.8 7.1 10
b 53.2 ± 3.6 6.7 10
c 82.9 ± 2.1 2.5 10
Reproducibilidad (Inter-ensayo)
Suero Media ± D.S. C.V. Ensayos
(% avidez) % n.
d 11.15 ± 2.98 26.7 10
e 18.44 ± 2.26 12.3 10
f 76.39 ± 10.64 13.9 10
11. LÍMITES DEL ENSAYO
Un resultado de alta avidez no excluye la possibilidad de una infección reciente. Por otra parte,
debido a la alta especificidad del ensayo un resultado positivo es índice de una infección
contraída en los tres meses anteriores.
12. LEYENDA SÍMBOLOS: ver p. 12
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REF
LOT
IVD
96
RDATE
RCNS
H2O
SÍMBOLOS
EN 980 – EDMA
Código de referencia o número de pedido
Lote
Fecha de caducidad
Para uso diagnóstico in vitro
Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE
Conservar a 2-8°C
Producido por
Riesgo biológico
Consultar las instrucciones de uso
Suficiente para 96 test
Fecha de referencia
Reconstituir con
Agua destilada o desionizada
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BIBLIOGRAFÍA
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Br. Med. J. 2: 268-270.
3 - Doerr MW. (1987). Cytomegalovirus infection in pregnancy. J. Virol. Methods 17: 127-132.
4 - Stagno S., Pass RF., Cloud G., Britt WJ., Henderson RE., Walton PD., Veren DA., Page
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5 - Pass RF., Griffiths PD., August AM (1983). Antibody response to cytomegalovirus after
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6 - Blackburn NK., Besselaar TG., Schoub BD., O'Connell KF. (1991). Differentiation of
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measuring antibody avidity. J. Med. Virol. 33: 6-9.
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cytomegalovirus infection is delayed in immunosuppressed solid organ transplant patients.
J. Med. Virol. 44: 317-322.
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ESQUEMA DEL ENSAYO
Predilución de la muestra: 1:300
Reactivos
Pocillos
A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1
CTR BA ---- ---- 100 µL 100 µL ---- ---- ---- ----
CTR AA ---- ---- ---- ---- 100 µL 100 µL ---- ----
Muestras ---- ---- ---- ---- ---- ---- 100 µL 100 µL
− Incubar: 37±2°C, 60±5 min.
− Aspirar y lavar: 4 x 350 µL
DIL 100 µL ---- 100 µL ---- 100 µL ---- 100 µL ----
DISS ---- 100 µL ---- 100 µL ---- 100 µL ---- 100 µL
− Incubar: 37±2°C, 30±2 min.
− Aspirar y Lavar: 4 x 350 µL
CONJ 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubar: 37±2°C, 30±2 min.
− Aspirar y lavar: 4 x 350 µL
TMB 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubar: 37±2°C, 10'
STOP 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Leer 450-405 nm
RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
Tel.: +39 06 91.249.1 - Fax: +39 06 91.249.443
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