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活 性 化 型 ゲル - リガンドを 直 接 固 定 化TOYOPEARL AF-Tresyl-650Mはアミノ 基 およびチオール 基に 対 して 強 い 反 応 性 を 示 す 活 性 化 型 ゲルです。この 充 てん 剤 は 乾 燥 ゲルで 提 供 され、タンパク 質 その 他 のリガンドを 含 む 緩 衝 液 で 反 応 します。 固 定 化 反 応 は 中 性 から 弱 アルカリ 性(pH7〜8)の 溶 液 で 行 います。( 図 3)。このような 条 件 下 では 不 安 定 なタンパク 質 でも 固 定 化 させることができます。この 固 定 化 反 応 によって 非 常 に 安 定 性 の 良 い 二 級 アミンまたはチオエーテル 結 合 が 作 られます。トレシル(tresyl-) 基密 度 は 至 適 化 ( 膨 潤 ウェットゲルの 状 態 で 約 20mmol/L)してあり、 多 点 結 合 によるタンパク 質 リガンドの 不 活 化 を 防 ぎながら、 固定 化 が 可 能 です。 代 表 的 データを 表 2にまとめてあります。粒 子 径 10μmのTSKgel Tresyl-5PWにつきましては、「TSK-GEL/ TOYOPEARL 総 合 カタログ」をご 覧 ください。TOYOPEARL AF-Epoxy-650Mは 高 密 度 のエポキシ 基 ( 約800μmol/g)を 持 つ 活 性 型 ゲルであり、 乾 燥 ゲルで 提 供 されます。 低 分 子 量 リガンドを 高 密 度 で 固 定 化 する 場 合 に 特 に 効 果 を 発揮 します( 図 4)。たとえば、 膨 潤 状 態 の 充 てん 剤 にグルタチオンとグリシンは100mmol/Lを 超 える 密 度 で 固 定 化 されます。活 性 化 型 ゲル - リガンド 固 定 化 に 添 加 剤 を 利 用TOYOPEARL AF-Formyl-650Mを 使 用 すれば、 温 和 な 条 件下 で 第 一 級 アミンを 有 するリガンドを 固 定 化 することができます。リガンドは 充 てん 剤 のホルミル 基 (アルデヒド 基 )と 安 定 な 二 級アミン 結 合 によりゲルに 結 合 します( 図 5)。代 表 的 な 固 定 化 例 を 表 2に 示 します。多 種 多 様 な 工 業 用 酵 素 がアルデヒド 基 を 含 む 担 体 を 用 いて 固 定化 されています。TOYOPEARL AF-Formyl-650Mは、 機 械 的 強度 の 優 れた 多 孔 性 充 てん 剤 に、そのまま 使 用 可 能 なアルデヒド 基を 持 つ 担 体 です。図 3 活 性 化 型 AFC 充 てん 剤 を 用 いた 固 定 化 方 法HW-65HW-65-O-R-O-CH 2 CH 2 OSO 2 CH 2 CF 3 H 2 N - LigandTOYOPEARL AF-Tresyl-650MHW-65-O-R-O-CH 2 CH 2 -NH-Ligand CF 3 CH 2 SO 3 HStable secondary amine linage-O-R-O-CH 2 CH 2 OSO 2 CH 2 CF 3 HS-LigandTOYOPEARL AF-Tresyl-650MpH 7.5-825HW-65-O-R-O-CH 2 CH 2- S-Ligand CF 3CH 2 SO 3 HStable sulide linageR hydrophilic polymerpH 7.5-825図 4 活 性 化 型 AFC 充 てん 剤 を 用 いた 固 定 化 方 法HW-65HW-65O-O-R-O-CH 2 -CH-CH 2 H 2 N-LigandTOYOPEARL AF-EpoxyHW-65pH 9-1140-O-R-O-CH 2 -CHOH-CH 2 -NH-LigandStable secondary amine linageO-O-R-O-CH 2 -CH-CH 2 HS-LigandTOYOPEARL AF-EpoxypH 7-825HW- -O-R-O-CH 2 -CHOH-CH 2 -S-Ligand65Stable sulide linageR hydrophilic polymer表 2 活 性 化 型 AFC 充 てん 剤 を 用 いたタンパク 質 の 固 定 化 タンパク 量 (g/L)Soybean trypsin inhibitor 16 3.5 5.8 15Protein A 1.9 ─ ─ ─Concanaalin A 13 ─ ─ ─1-Antitrypsin 12.3 ─ ─ ─-Chymotrypsin 12.5 ─ ─ ─Myoglobin 12.4 ─ ─ ─Oalbumin ─ 2.5 6.7 0.8Boine serum albumin 12.4 14 19.2 3.3Human IgG 10.0 15 6.7 11.7Cytochrome C ─ 5.8 3.3 7.5Lysoyme 60 20 5.8 17.5Coupling agent not required NaCNBH3 NaCNBH3 orCarbodiimideCarbodiimideOptimal pH 7 – 9 6.9 – 9.0 4.5 – 6.0 4.5 – 6.035