Actualització en tècniques de laboratori - Centre de Recerca en ...

I JORNADA
D’ACTUALITZACIÓ PER A
PROFESSORAT DE
CIÈNCIES

ACTUALITZACIÓ EN
TÈCNIQUES DE LABORATORI

TÈCNIQUES DE LABORATORI AL
CReSA
• Estudis d’immunologia
•
Mesurament de la resposta humoral o
d’anticossos, innata i adquirida
– ELISA
– Neutralització
– Lisi per complement
• Mesurament de la resposta cel·lular
– ELISPOT per a mesurar citoquines
– ELISA per a mesurar citoquines
– Limfoproliferació
– Estudis de citometria de flux
• Estudi de marcadors de superfície
cel·lulars
• Estudi de citoquines
intracel·lularment
– Assajos CTL (cèl·lules T-CD8 citotòxiques)
no radioactius
– Obtenció i purificació de subpoblacions
cel·lulars del sistema immunològic
(macròfags, cèl·lules dendrítiques, cèl·lules
T…) per citometria de flux (sorting)
• Producció d’anticossos monoclonals
• Estudis bacteriològics
• Aïllament, cultiu i titulació de bactèries en
mostres biològiques
• Genotipatge
• Desenvolupament de microarrays específics de
patògen
• Estudis de resistència/sensibilitat a
antimicrobians
• Anàlisi de microbiota intestinal mitjançant
tècniques moleculars
• Altres estudis moleculars
– Seqüenciació de patògens
– Anàlisi molecular de mecanismes de
resistència a antimicrobians
– Anàlisis filogenètics de soques bacterianes
– Anàlisi molecular de marcadors de
virulència bacterians
• Estudis d’anatomia patològica en
animals de granja
Histopatologia
• Immunohistoquímica
• Hibridació in situ

TÈCNIQUES DE LABORATORI AL
CReSA
• Desenvolupament i posta a punt de
tècniques de diagnòstic
•
Tècniques serològiques
– ELISA
– Western blot
– ELISPOT
– Microscopia (òptica, fluorescència)
• Tècniques moleculars
– Extracció de DNA i desenvolupament de
PCR
– Extracció de RNA i desenvolupament de
RT-PCR
– PCR a temps real
• Hibridació in situ
• Estudis virològics
Aïllament, identificació, cultiu i titulació de virus
animals
• Estudis moleculars
– Seqüenciació de virus i comparacions
filogenètiques
• Estudi i desenvolupament de noves
estratègies vaccíniques
Desenvolupament de vacunes d’utilitat en sanitat
animal
– Atenuades
• Mitjançant pas en cultiu cel·lular
• Per mètodes moleculars (manipulació
genòmica)
– Inactivades
– Recombinants
• Valoració de possibles adjuvants i
immunomoduladors vaccínics en models in vitro i in
vivo
• Clonació i expressió de proteïnes recombinants
amb ús diagnòstic i/o vaccínic en sistemes
d’expressió procariòtics i eucariòtics
• Construcció de mutants bacterians
• Clonació i construcció de variants de virus
• Desenvolupament de models de recombinants com
a vectors immunològics

TÈCNIQUES
MOLECULARS
1. EXTRACCIÓ DE DNA O RNA
2. DESENVOLUPAMENTS DE LA PCR O RT-
PCR
3. PCR A TIEMPO REAL QUANTITATIVA

1. EXTRACCIÓ DE DNA O RNA
TIPUS DE MOSTRES:
FEMTES, SEMEN, ETC. POT HAVER MOSTRES DE SANG, TEIXIT,
HISOP RECTAL, HISOP NASAL,ETC

PROTOCOL D’EXTRACCIÓ DE
DNA/RNA
1. Afegim la mostra amb el buffer de lisis (Buffer comercial,
HCL, dodecil sulfato sódic (SDS) i NaCL, varia segons la casa
comercial )
2. Afegim la proteïnasa k
3. Agitem i incubem 10min a 70ºC
4. Afegim etanol de 96ºC (precipitem la mostra)
5. Passem la mostra a la columna amb filtre i centrifuguem
6. Afegim un buffer de rentat i centrifuguem(el DNA queda
enganchat al filtre i les proteïnes i demes metabòlits son
eliminats amb el buffer)
7. Afegim el segon buffer de rentat i centrifuguem
8. Afegim el buffer de elució (fa que es desprengui el DNA de
la membrana i caigui al tub nou) i centrifuguem
9. Ja tenim el DNA

2. PCR O RT-PCR
• ORIGEN DE LA PCR:
La tècnica de PCR va ser descoberta en el any
1983 per Kary Mullis i per ella li van concedir
el premi Nobel de químiques en el 1993.
Anys desprès va vendre la patent a Roche per
300.000.000 milions de dòlars .

PCR
• La Reacció en cadena de la polimerasa
(PCR: Polymerase Chain Reaction) és un mètode
in vitro de síntesi d’àcids nuclèics mitjançant el
qual un segment particular de DNA pot ser
replicat específicament.
• La PCR es divideix en 3 fases:
-Desnaturalització
-Hibridació
-Extensió

PRODUCTES DE LA PCR
• Components:
• Taq polimerasa: enzima estable a 94ºC, i per tant
activa durant tota la reacció
• “PRIMERS”: DNA monocatenari de 15 a 30 nucleòtids
» Sentit (Forward): 5’-3’
» Antisentido (Reverse): 3’-5’
– Temperatura fusió (melting Tº) : Tº a la que el 50% de les
hebras estan separades. A partir d’aqui obtindrem la Tº
d’ acoplament.
• dNTPs: dATP, dTTP, dCTP. dGTP
• Tampó: Tris-HCl, KCl y MgCl 2 (individual)
• ADN diana: fragment al que flanquean els cebadors

FASES PCR
1. DEANATURALITZACIÓ: Separant-se les dos
cadenes per la ruptura dels enllaços
d'hidrògens a una temperatura de 95ºC.
2. HIBRIDACIÓ : consisteix en la unió
d’aquestes cadenes amb els primers. Per que
aixó succeeixi baixarem la temperatura
3. EXTENSIÓ: La DNA polimerasa s’uneix on hi
ha el primer i mitjançant el magnesis i un
tampó va incorporant les bases nucleotídiques
(dNTPS) necessàries, sempre
complementaries a la cadena ja existent (és a
dir una G amb una C, i una A amb una T). Un
cop acabada l’extensió, la Temperatura
tornarà a pujar i per tan el DNA es tornarà a
desnaturalitzar.

FASES PCR
5'
B
3'
3'
5'
Desnaturalització:
90ºC-94ºC
5'
C
5' 3'
3'
3'
3' 5'
5'
Unió del primers o
hibridació:
54ºC-60ºC
(5ºC

ELECTROFORESIS
• Principis d'electroforesis:
• EL DNA està carregat negativament. Per tan si
el fem passar a través d’una matriu d’agarosa
anirà de càtode a l'ànode.
• Per tal de saber si una mostra es positiva o
negativa, cal posar sempre un marcador de pes
molecular.
• Aquest marcador (comercial) tu saps que te
diferent bandes i en saps la seva longitud.
• Tinció gel d’agarosa amb bromur d’etidi. Aquest
s’intercala en les bases del DNA i amb la llum
ultraviolada dona fluorescència.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
M: marcador de
peso molecular
1-4: mostres
5: control negatiu
8: control negatiu
extracció
9: control positiu

RT-PCR
Extracció mRNA
PCR tradicional
mRNA
37ºC cDNA
Transcriptasa
inversa actúa
L’ADN polimerasa només amplifica DNA. Per tan si parlem RNA,
primer hem de convertir aquest RNA en cDNA (DNA
complementari) mitjançant la reacció de la Transcriptasa
inversa. En aquest cas parlarem d’una RT-PCR.

NESTED PCR O PCR ANIDADA
• PCR anidada (nested PCR):
• Doble amplificació del ADN
• Augmenta especificitat y sensibilitat
• Augmenta la possibilitat de contaminació
Exemple: PCR anidada
1era
Reacció
45 cicles
amplificació
Amplicó 649 bp
2na Reacció
45 cicles
amplificació
Amplicó 352 bp

NESTED PCR O PCR ANIDADA
M
1 2 3 4 5 6 7 N
1era
reacció
648 bp
Sensibilitat
10 3 -10 4
Mycop/reacción
2nda
reacció
352 bp
• Sensibilitat
• 80 Mycop/reacción

3. PCR QUANTITATIVA O
TIEMPO REAL
• Termociclador amb un sistema de
detecció per fluorescència y amb un
software incorporat

COMPONENTES REAL TIME
TAQMAN
• Primers
• Sonda:(Reporter-Quencher)
o Fluorocroms
intercalantes (SYBR
Green)
• Master MIX
• Standard: Banc de
dilucions d’una mostra de quantitat
coneguda.
– Amplicó insertat en
un plàsmid
– Dilucions d’un cultiu
quantificat
PCR covencional
• Primers
• TAq polimerasa
• Dntps
• Mgcl2….
• Buffer 10X
• H2O MQ

Sondas
Fragment d’ADN complementari a una part intermèdia
d’ADN que volem amplificar, portant adherida una molècula
fluorescent (5’ reporter) i altre molècula que inhibeix la
fluorescència (3’ quencher)
R
Sonda
Q
Característiques de la Sonda:
• Tm superior en 10ºC a la temperatura dels primers.
• 20 y 80 % de GC
• 13 y 30 pares de bases
• No terminar amb una G en el 5’
• No mes de 3 G seguides

• Sonda TaqMan:
Tipos de sondas
• Reporters: FAM, VIC, JOE, ROX, Cy3, Cy5, HEX, TET….
• Quenchers:
• TAMRA
• MGB (minor binding Grobe)
• Altres tipus de sondes:
– BHQ (black hole quencher)
– …

PROCESO
Transferència d'energia
Cebador
5’ 3’
3’
5’
DNA
Polimerasa
R
Sonda
Q
5’
3’
3’ 5’
Cebador
R (reporter)= FAM
(518nm)
• Q (quencher)= TAMRA
(582 nm)
• “secuestrador”

5
’
Cebador 3’
R
Sonda
Q
3’ 5’
Cebador

R
Cebador 5’ 3’
Sonda
Q
3’ Cebador
5’
• La fluorescència del Reporter (liberació) serà
proporcional al amplicó format

Fluorocromos intercalantes
• SYBR Green: Mitjançant fluorocroms
intercalats detecten tot el DNA produït
durant la reacció de PCR

Como interpretamos los resultados
La gràfica típica consisteix en tres fases:
1. En els primers cicles les quantitats de DNA son inapreciables
2. Fase logarítmica-lineal: son els cicles on la quantitat de DNA creix de forma logarítmica
y sols ser entre 4 y 5 cicles de la reacció de PCR.
3. Fase plateau: son els últims cicles en els que hi ha moltes copies del DNA como per
poder discriminar (el sistema de detecció es satura)

Como interpretamos los resultados
Es defineix el Threshold Cycle (Ct) com el cicle a partir del qual la
fluorescència es estadísticament significativa per sobre del
background (soroll de fons)
Separant les dades del soroll de fons
Determina el cicle inicial d’amplificació
Directament relacionat amb el numero de copies i per tant amb
la quantitat present a la mostra
Ct (cycle thershold)
20 40
Ct bajo
(alt número de
copies)
Ct Alto
(baix número de copies)

Com quantifiquem
10e3
10e4
10e5
10e6
10e7
Muestra con Ct=28
10e 6 mol del Amplicón/ml

Com valorem
10e
3 • Control Calidad
10e
4
• pendiente: (-3.22) - (-3.77)
• R 2: >0.97
10e
5
• NTC (controles internos
intercalados)
10e
6
Cada 3 ciclos
Eficiencia del 100%
10e
7
1 logaritmo

• 3 repliques en la
que una es desvia
de les altres 2.
Aquí la desviació
de les mostres
seria de 1.2
Mostres per
triplicat
Desv. Estàndar

Com treballem

Punts importants

Edifici CReSA. Campus UAB.
08193 Bellaterra (Barcelona) Spain.
Tel. (+34) 93 581 32 84 Fax. (+34) 93 581 44 90
e-mail: cresa@uab.cat - www.cresa.cat