Activated Immunobead® Matrix - Irvine Scientific

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Disuelva 478 g de GuHCl y 8.77g NaCl en 700mL de agua. Añada 33.3 mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 y ajuste el pH a 7.2. Filtre (si es necesario) y enrase a 1L con agua. 4. Tampón fosfato 0.005M, pH 7.2 (un tampón de baja fuerza iónica utilizado para la liofilización de los reactivos de esferas). Diluya 16.7mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 en 800 mL de agua. Ajuste el pH a 7.2 con 1M de KOH. Enrase a 1L. 5. Tampón fosfato 0.005M – 1% BSA (utilizado para bloquear cualquier unión inespecífica con los reactivos Immunobead finales). Si la BSA no es conveniente, debe preparar otro reactivo similar utilizando otra proteína “transportadora”. Disuelva 5g de BSA de alta calidad (IS Nº Cat. 1092) en 500 mL del tampón anterior. B. Preparación de la Matriz Immunobead con la fracción de globulinas de los anticuerpos. 1. La fracción de globulinas del antisuero debe ser completamente soluble en PBS. Centrifugue para eliminar el material insoluble. 2. Utilizando un valor de DO196 de 14 para las globulinas de conejo 280 y de 13 para las de cabra, determine la concentración de su preparación. Dialice un volumen de su preparación que contenga 8-10mg de proteína contra el tampón de unión. Añada la preparación dializada del anticuerpo, incluyendo cualquier material que precipite en el tampón de unión, con los reactivos Immunobead. Si se necesita más de 1mL de anticuerpo dializado para conseguir 8 mg de proteína, la suspensión de Immunobead se debe centrifugar y decantar antes de añadir el anticuerpo. Después de la adición del anticuerpo dializado, ajuste el volumen total a 20 mL con el tampón de unión. Resuspenda las esferas y ajuste el pH a 6.3 si fuera necesario. Español 2/6
3. Incube a 4º C 1hora. 4. Añada 40.0 mg de EDAC (1-etil-3 [3-dimetilaminopropil] carbodiimida- HCl) a la mezcla de reacción. Agite fuerte y completamente. 5. Mantenga a 4 ºC al menos 3horas. En este punto la mezcla de reacción se puede guardar toda la noche, pero si su proteína es inestable, centrifugue y lave al menos una vez con PBS. 6. Prosiga con el protocolo de lavado (Sección D). C. Preparación de Immunobead con Antisuero Completo Nota: Este protocolo da lugar a una actividad específica inferior a la del protocolo de las globulinas. 1. Centrifugue 200 µL de antisuero a 5000 x g para eliminar cualquier material insoluble. 2. Centrifugue la suspensión de Immunobead y descarte el sobrenadante. 3. Añada 100 µL de antisuero y 6.5 mL de tampón de unión al precipitado de Immunobead del paso 2. Resuspenda y mezcle bien. 4. Incube a 40ºC 1 hora. 5. Añada 20.0 mg de EDAC y mezcle fuertemente. Mantenga a 4º C al menos 3 horas. 6. Prosiga con la secuencia de lavado (Sección D). Español 3/6
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