Activated Immunobead® Matrix - Irvine Scientific

Disuelva 478 g de GuHCl y 8.77g NaCl en 700mL de agua. Añada
33.3 mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 y ajuste el pH a 7.2. Filtre (si es
necesario) y enrase a 1L con agua.
4. Tampón fosfato 0.005M, pH 7.2 (un tampón de baja fuerza iónica
utilizado para la liofilización de los reactivos de esferas).
Diluya 16.7mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 en 800 mL de agua. Ajuste
el pH a 7.2 con 1M de KOH. Enrase a 1L.
5. Tampón fosfato 0.005M – 1% BSA (utilizado para bloquear cualquier
unión inespecífica con los reactivos Immunobead finales). Si la BSA
no es conveniente, debe preparar otro reactivo similar utilizando
otra proteína “transportadora”. Disuelva 5g de BSA de alta calidad
(IS Nº Cat. 1092) en 500 mL del tampón anterior.
B. Preparación de la Matriz Immunobead con la fracción
de globulinas de los anticuerpos.
1. La fracción de globulinas del antisuero debe ser completamente
soluble en PBS. Centrifugue para eliminar el material insoluble.
2. Utilizando un valor de DO196 de 14 para las globulinas de conejo
280
y de 13 para las de cabra, determine la concentración de su
preparación. Dialice un volumen de su preparación que contenga
8-10mg de proteína contra el tampón de unión.
Añada la preparación dializada del anticuerpo, incluyendo cualquier
material que precipite en el tampón de unión, con los reactivos
Immunobead.
Si se necesita más de 1mL de anticuerpo dializado para conseguir 8
mg de proteína, la suspensión de Immunobead se debe centrifugar
y decantar antes de añadir el anticuerpo. Después de la adición del
anticuerpo dializado, ajuste el volumen total a 20 mL con el tampón
de unión. Resuspenda las esferas y ajuste el pH a 6.3 si fuera
necesario.
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