Activated Immunobead® Matrix - Irvine Scientific
Activated Immunobead® Matrix - Irvine Scientific
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<strong>Activated</strong> Immunobead ® <strong>Matrix</strong><br />
Catalog No. 15391 200 mg<br />
All testing results are provided on a lot-specific Certificate of Analysis.<br />
Alle resultate werden auf einem los spezifischen Analysenzertifikat zur<br />
Verfuegung gestellt.<br />
Tutti i risultati sono riportati in un Certificato di Analisi specifico per lotto.<br />
Todos los resultados están descritos en el Certificado de Análisis<br />
específico de cada lote.<br />
Les résultats de ces tests sont fournis dans un certificat d’analyses<br />
spécifique à chaque lot.<br />
Todos os resultados estão descritos no Certificado de Análise<br />
específico de cada lote.
INTENDED USE<br />
200 mg of Immunobead matrix is supplied lyophilized and contains<br />
0.01% NaN 3 . Re-hydration with 20 mL of distilled water produces a 10<br />
mg/mL suspension in the recommended coupling buffer. Do not freeze<br />
after hydration. Store at 4°C.<br />
Antibody coupling is done at pH 6.3; however, coupling of other types of<br />
proteins is done at a pH close to the isoelectric point of the protein. For<br />
example, human serum albumin (isoelectric point = 4.8) is coupled to<br />
the Immunobead matrix in 0.01 M pyridine buffer, pH 4.8. It is essential<br />
that the coupling be run at low ionic strength (conductivity 1,000 µohms).<br />
DIRECTIONS FOR USE<br />
A. Buffers<br />
1. Coupling buffer (0.003 M phosphate, pH 6.3).<br />
Prepare a 0.3 M stock solution of monobasic potassium phosphate<br />
(KH 2 PO 4 anhydrous, m.w. = 136.1) by dissolving 40.8 g of KH 2 PO 4<br />
in 1 liter H 2 O. Dilute 10mL stock 0.3 M KH 2 PO 4 with 800 mL water.<br />
Adjust pH to 6.3 with 0.1 M KOH. Dilute to 1.0 liter.<br />
2. Phosphate buffered saline (PBS) (0.01 M KH 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, pH<br />
7.2 with KOH).<br />
Dissolve 478 g sodium chloride (NaCl) and 0.1 g NaN 3 in 500 mL<br />
water. Add 33.3 mL of a 0.3 M KH 2 PO 4 stock solution. Adjust to pH<br />
7.2 with 1 M KOH. Dilute to 1.0 liter with water<br />
3. 1.4 M sodium chloride (NaCl) – PBS.<br />
Dissolve 73.22 g NaCl in 700 mL PBS. Dilute to 1.0 liter with PBS<br />
and adjust pH to 7.2.<br />
If high background becomes a problem, the following buffer is<br />
suggested in place of 1.4 M NaCl – PBS: 5M guanidine hydrochloride<br />
(GuHCl) – PBS.<br />
English 1/6
Dissolve 478 g GuHCl and 8.77 g NaCl in 700 mL water. Add 33.3<br />
mL of stock 0.3 M KH 2 PO 4 and adjust to pH 7.2. Filter (if necessary)<br />
and dilute to 1.0 liter with water.<br />
4. 0.005 M phosphate buffer, pH 7.2 (a low ionic strength buffer utilized<br />
for lyophilization of bead reagents).<br />
Dilute 16.7 mL of stock 0.3 M KH 2 PO 4 with 800 mL water. Adjust to<br />
pH 7.2 with 1 M KOH. Dilute to 1.0 liter<br />
0.005 M phosphate buffer – 1% BSA (used to block any non-specific<br />
absorption on final Immunobead reagents). If BSA is undesirable, a<br />
similar reagent should be prepared using another “carrier” protein).<br />
Dissolve 5 g of a high quality of BSA (I.S. Cat #1092) in 500 mL of<br />
the preceding buffer.<br />
B. Immunobead <strong>Matrix</strong> Preparation with Globulin<br />
Fraction Antibody<br />
1. Globulin fractions of antisera should be completely soluble in PBS.<br />
Centrifuge to remove insoluble material.<br />
2. Using a value for OD196 of 14 for rabbit globulin and 13, for goat<br />
280<br />
globulin, determine the concentration of your preparation. Dialyze<br />
a volume of your preparation containing 8-10 mg protein against<br />
coupling buffer.<br />
Add the dialyzed antibody preparation, including any material that<br />
precipitates in the coupling buffer, to the Immunobead reagents.<br />
If more than 1 mL of dialyzed antibody is required to yield the requisite<br />
8 mg of protein, the Immunobead suspension should be centrifuged<br />
and decanted prior to addition of antibody. After addition of the<br />
dialyzed antibody preparation, adjust the total volume to 20 mL with<br />
the coupling buffer. Re-suspend the beads and adjust the pH to 6.3,<br />
if necessary.<br />
English 2/6
3. Incubate at 4°C for 1 hour.<br />
4. Add 40.0 mg EDAC (1-ethyl-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide-<br />
HCl) to the reaction mixture. Mix vigorously and completely.<br />
5. Store at 4° C for at least 3 hours. The reaction mixture may be stored<br />
overnight at this point, but if your protein is unstable, centrifuge and<br />
wash at least once with PBS.<br />
6. Proceed with the wash procedure (Section D).<br />
C. Immunobead Preparation with Whole Antisera<br />
Note: This procedure produces a lower specific activity than the<br />
globulin procedure.<br />
1. Centrifuge 200 µL of antisera at 5,000 x g to remove any insoluble<br />
material.<br />
2. Centrifuge the Immunobead suspension and discard the supernatant.<br />
3. Add 100 µL antisera and 6.5 mL coupling buffer to Immunobead<br />
pellet from Step 2. Re-suspend and mix well.<br />
4. Incubate at 40° C for 1 hour.<br />
5. Add 20.0 mg EDAC and mix vigorously. Maintain at 4° C for at least<br />
3 hours.<br />
6. Proceed with the wash sequence (Section D).<br />
English 3/6
IMMUNOBEAD REAGENT PREPARATION<br />
WITH WHOLE ANTISERA<br />
µL antisera/200mg<br />
Antisera titer* Immunobead Reagent<br />
A:1,000 ......................................................... (A)<br />
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)<br />
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100<br />
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50<br />
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25<br />
>1:100,000 (C) ............................................. 10<br />
*For antisera used in radioimmunoassay procedures the titer is expressed<br />
as the greatest dilution that will allow use of a 100 µL aliquot and<br />
produce quantitative data. Since the Immunobead reagents will slowly<br />
settle over long periods, titers should be based on a 2 hour incubation<br />
of optimum results.<br />
A. Titer is too low to be useful for quantitative analysis. May be useful<br />
for cell labeling.<br />
B. Preparation lgG Fraction and use procedure in Section B.<br />
C. Aliquots as small as 50 µg of Immunobead reagent can be<br />
quantitatively separated and washed, even though the pellet is<br />
invisible. Immunobead rabbit gamma globulin or goat gamma<br />
globulin may be added as diluents to bring the total amount of<br />
Immunobead reagents up to 100-200 µg to give an easily visible<br />
pellet.<br />
D. Wash Sequence<br />
This sequence will completely remove non-covalently bound material<br />
with minimum loss activity. All steps are important and should be<br />
followed rigorously. Buffers should be maintained at 4° C. Once<br />
the high salt step is started, the remaining steps should be carried<br />
through to completion in minimal time.<br />
English 4/6
1. Divide the material into equal portions in centrifuge tubes. A wash<br />
volume of at least 80 mL/200 mg Immunobead reagent is required.<br />
2. Fill tubes to capacity and balance the tubes with PBS. Centrifuge<br />
at a minimum of 1,000 x g for at least 10 minutes.<br />
3. Immediately after the centrifuge stops, decant and discard the<br />
supernatant by completely inverting the tubes.<br />
4. Add a small volume of PBS to each tube. Re-suspend the pellet by<br />
using a vortex mixer or vigorous mixing.<br />
5. Repeat steps 2 and 3.<br />
6. Re-suspend the pellet in a small volume of 1.4 M NaCl-PBS. Fill the<br />
tube(s) to capacity and balance with 1.4 M NaCl-PBS.<br />
7. Centrifuge at 1,000 x g for 10 minutes.<br />
8. Immediately after the centrifuge stops, decant the supernatant with<br />
a single complete inversion of the tubes. Drain briefly.<br />
9. Repeat steps 6, 7, and 8.<br />
10. Wash twice with PBS. (Repeat twice Steps 4, 2, and 3.)<br />
11. Re-suspend in PBS and allow to stand on ice (4°C) for at least 3<br />
hours to allow complete renaturation of bound antibody.<br />
12 a.) At this point, the reagent may be used. Wash twice as above<br />
and combine to a final volume of 20 mL (10 mg/mL of Immunobead<br />
reagent).<br />
OR<br />
English 5/6
.) It is usually beneficial to absorb the finished reagent with BSA<br />
before use in an analytical system. Wash twice with 0.005 M<br />
phosphate, pH 7.2, and re-suspend in 0.005 M phosphate – 1%<br />
BSA buffer.<br />
13. The reagent may be washed by centrifugation into other buffers for<br />
use. If stored without lyophilization, add 1 mL of 2% (2 g/100 mL)<br />
NaN 3 solution as a preservative. Immunobead reagent preserved<br />
with sodium azide is generally stable for at least 180 days at 4°C.<br />
APPLICATIONS OF IMMUNOBEAD REAGENT<br />
Fluorolmmunoassay 1,2 – 0.1 to 1.0 mg Immunobead regents per point<br />
Cell Labeling 3,4 – 0.1 to 0.2 mg Immunobead reagents per 10 6 cells<br />
Radiolmmunoassay 5,6 – 0.1 to 2.0 mg Imunobead reagents per point<br />
PRECAUTIONS AND WARNINGS<br />
This device is intended to be used by staff trained in procedures that<br />
include the indicated application for which the device is intended.<br />
Immunobead ® is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories.<br />
English 6/6
VERWENDUNGSZWECK<br />
200 mg lyophilisiertes Immunobead <strong>Matrix</strong> wird beliefert. Das<br />
Immunobead <strong>Matrix</strong> beinhaltet 0,01% NaN 3 . Die Wiederhydration mit 20<br />
ml destilliertem Wasser stellt eine 10 mg/ml Suspension im empfohlenen<br />
Kupplungspuffer her. Das Produkt nicht nach der Hydration einfrieren.<br />
Bei 4ºC lagern.<br />
Antikörper-Kupplung wird bei einem pH-Wert von 6,3 ausgeführt; aber,<br />
die Kupplung von anderen Arten von Proteinen wird bei einem pH-Wert<br />
ausgeführt, der nahe am isoelektrischen Punkt des Proteins ist. Zum<br />
Beispiel, Human Serum Albumin (isoelektrischer Punkt = 4,8) wird zum<br />
Immunobead <strong>Matrix</strong> in 0,01 M Pyridine-Puffer (pH-Werd 4,8) verkoppelt.<br />
Es ist notwendig, dass die Kupplung bei niedrigem Ionenstärke<br />
(Leitfähigkeit 1.000 µohm) ausgeführt wird.<br />
GEBRAUCHSANWEISUNG<br />
A. Puffer<br />
1. Kupplungspuffer (0,003 M Phosphat, pH-Wert 6,3).<br />
40,8 g KH 2 PO 4 in 1 Liter H 2 O auflösen, um eine 0,3 M Stammlösung<br />
von monobasischem Kaliumphosphat (KH 2 PO 4 wasserfrei,<br />
Molekulargewicht = 136,1) vorzubereiten. 10 ml 0,3 M KH 2 PO 4 mit<br />
800 ml Wasser verdünnen. Den pH-Wert bis zu 6,3 mit 0,1 M KOH<br />
bringen. Das Produkt zu 1,0 Liter verdünnen.<br />
2. Phosphate buffered saline (PBS) (0,01 M KH 2 PO 4 , 0,15 M NaCl,<br />
pH-Wert 7,2 mit KOH).<br />
478 g Natriumchlorid und 0,1 g NaN 3 in 500 mL Wasser auflösen. 33,3<br />
ml einer 0,3 M KH 2 PO 4 Stammlösung hinzufügen. Den pH-Wert bis<br />
zu 7,2 mit 1 M KOH bringen. Bis zu 1,0 Liter mit Wasser verdünnen.<br />
3. 1,4 M Natriumchlorid (NaCl) – PBS.<br />
73,22 g NaCl in 700 ml PBS auflösen. Bis zu 1,0 Liter mit PBS<br />
verdünnen und den pH-Wert bis zu 7,2 bringen.<br />
Deutsch 1/7
Falls hoher Hintergrund ein Problem ist, der folgende Puffer wird statt<br />
1,4 M NaCl – PBS empfohlen: 5M Guanidinhydrochlorid (GuHCl) –<br />
PBS.<br />
478 g GuHCl und 8,77 g NaCl in 700 ml Wasser auflösen. 33,3 ml<br />
0,3 M KH 2 PO 4 hinzufügen und den pH-Wert bis zu 7,2 bringen. Filtern<br />
(falls nötig) und bis zu 1,0 Liter mit Wasser verdünnen.<br />
4. 0,005 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,2 (Puffer die von niedriger<br />
Ionenstärke sind, und die zum Gebrauch in der Lyophilisierung von<br />
Perlen-Reagenzien bestimmt sind).<br />
16,7 ml 0,3 M KH 2 PO 4 mit 800 ml Wasser verdünnen. Den pH-Wert<br />
bis zu 7,2 mit 1 M KOH bringen. Bis zu 1,0 Liter verdünnen.<br />
5. 0,005 M Phosphatpuffer – 1% BSA (Verhindert unspezifische<br />
Aufsaugung mit endgültige Immunobead-Reagenzien). Falls BSA<br />
nicht wünschenswert ist, ein ähnliches Reagenz soll mit einem<br />
anderen Carrierprotein vorbereitet werden. 5 g eines hochwertigen<br />
BSA (I.S. Katalog # 1092) in 500 ml des vorhergehenden Puffers<br />
auflösen.<br />
B. Vorbereitung des Immunobead <strong>Matrix</strong> mit Globulin<br />
Fraction Antibody (Globulinbruchteil Antikörper)<br />
1. Globulinbruchteile der Heilsera sollen in PBS total löslich sein.<br />
Zentrifugieren, um unlöslichen Stoff wegzunehmen.<br />
2. Mit einem Wert für OD196 von 14 für Kaninchenglobulin und 13 für<br />
280<br />
Ziegenglobulin, die Konzentration Ihrer Vorbereitung bestimmen.<br />
Ein Volumen (Proteininhalt: 8-10 mg) Ihrer Vorbereitung gegen den<br />
Kupplungspuffer dialysieren.<br />
Die dialysierte Antikörpervorbereitung zu den Immunobead-<br />
Reagenzen hinzufügen, einschliesslich Stoff, der im Kupplungspuffer<br />
präzipitiert.<br />
Deutsch 2/7
Falls mehr als 1 ml dialysiertes Antikörper nötig ist, um die<br />
notwendigen 8 mg Protein zu ergeben, die Suspension zentrifugieren<br />
und dekantieren, vor der Hinzufügung des Antikörpers. Nach der<br />
Hinzufügung des dialysierten Antikörpers das Volumen mit dem<br />
Kupplungspuffer zu einem Endvolumen von 20 ml bringen. Die Perlen<br />
wieder suspendieren und bis zu einem von 6,3 bringen, falls nötig.<br />
3. Für 1 Stunde bei 4ºC bebrüten.<br />
4. 40,0 mg EDAC (1-ethyl-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide-HCl)<br />
zur Reaktionsmischung hinzufügen. Vollständig und energisch<br />
mischen.<br />
5. Für mindestens 3 Stunden bei 4ºC lagern. Die Reaktionsmischung<br />
kann an diesem Punkt über Nacht gelagert werden, aber falls Ihr<br />
Protein nicht stabil ist, das Protein zentrifugieren und mindestens<br />
einmal mit PBS waschen.<br />
6. Das Waschverfahren (Abteilung D) fortühren.<br />
C. Vorbereitung des Immunobead-Reagenzes mit<br />
Whole Antisera (ganzen Heilsera)<br />
Hinweis: Dieses Verfahren ergibt eine niedrigere spezifische Aktivität<br />
als das Globulinverfahren.<br />
1. 200 µL Heilsera bei 5.000 x g zentrifugieren, um unlöslichen Stoff<br />
wegzunehmen.<br />
2. Die Immunobead-Suspension zentrifugieren und den Überstand<br />
wegwerfen.<br />
3. 100 µL Heilsera und 6,5 ml Kupplungspuffer zum Immunobead-<br />
Niederschlag von Schritt 2 hinzufügen. Wieder suspendieren und<br />
gründlich mischen.<br />
Deutsch 3/7
4. Für 1 Stunde be 40ºC bebrüten.<br />
5. 20,0 mg EDAC hinzufügen und gründlich mischen. Mindestens 3<br />
Stunden bei 4ºC lagern. Die Reaktionsmischung kann an diesem<br />
Punkt über Nacht gelagert werden, aber falls Ihr Protein nicht stabil<br />
ist, das Protein zentrifugieren und mindestens einmal mit PBS<br />
waschen.<br />
6. Das Waschverfahren (Abteilung D) fortführen.<br />
VORBEREITUNG DES IMMUNOBEAD-REAGENZES<br />
MIT WHOLE ANTISERA (GANZEN HEILSERA)<br />
µL heilsera/200mg<br />
Heilsera titer* Immunobead Reagenz<br />
A:1,000 ......................................................... (A)<br />
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)<br />
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100<br />
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50<br />
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25<br />
>1:100,000 (C) ............................................. 10<br />
*Für Heilsera, die in Radioimmunoassay-Verfahren gebraucht werden,<br />
ist der Titer die grösste Verdünnung, die das Gebrauch von einem 100<br />
µL Aliquot ermöglicht und die quantitative Daten ergeben wird. Weil die<br />
Zutaten der Immunobead-Reagenzien über einen langen Zeitraum sich<br />
langsam trennen können, sollen Titer für optimale Ergebnisse auf eine<br />
Bebrütung von 2 Stunden basiert sein.<br />
A. Titer ist zu niedrig, für quantitative Analyse gebraucht zu werden.<br />
Kann für Zellenetikettierung gebraucht werden.<br />
B. Vorbereitung IgG Bruchteil und in Abteilung B gebrauchen.<br />
Deutsch 4/7
C. Aliquoten so klein wie 50 µg Immunobead-Reagenz können<br />
quantitativ getrennt und gewaschen werden, obwohl der<br />
Niederschlag unsichtbar ist. Immunobead Rabbit Gamma Globulin<br />
(Kaninchen-Gamma-Globulin) oder Goat Gamma Globulin (Ziegen-<br />
Gamma-Globulin) können als Verdünnungsmitteln hinzugefügt<br />
werden, um die Totalanzahl zu 100-200 µg zu bringen, um einen<br />
leicht sichtbaren Niederschlag zu ergeben.<br />
D. Waschsequenz<br />
Diese Sequenz wird allen nicht kovalent gebundenen Stoff mit<br />
minimale Schadenaktivität total wegnehmen. Alle Schritte sind wichtig<br />
und sollen streng befolgt werden. Puffer sollen bei 4ºC beibehaltet<br />
werden. Sobald der Hochsalz-Schritt angefangen worden ist, sollen<br />
die restlichen Schritte in minimalem Zeitraum ausgeführt werden.<br />
1. Den Stoff in gleiche Mengen in Zentrifugenbecher aufteilen. Ein<br />
Waschvolumen von mindestens 80 ml/200 mg Immunobead-<br />
Reazenz ist notwendig.<br />
2. Die Becher zu voller Kapazität auffüllen und mit PBS aufwiegen. Für<br />
mindestens 10 Minuten bei mindestens 1.000 g zentrifugieren.<br />
3. Sofort nachdem die Zentrifuge stillsteht, dekantieren und den<br />
Überstand durch Umkehrung der Becher wegwerfen.<br />
4. Ein kleines Volumen PBS zu jedem Becher hinzufügen. Den<br />
Niederschlag entweder mit einem Wirbelmischer oder durch<br />
energische Mischung wieder suspendieren.<br />
5. Schritte 2 und 3 wieder ausführen.<br />
6. Den Niederschlag in einem kleinen Volumen von 1,4 M NaCl-PBS<br />
wieder suspendieren. Den/die Becher zu voller Kapazität auffüllen<br />
und mit 1,4 M NaCl-PBS aufwiegen.<br />
Deutsch 5/7
7. Für 10 Minuten bei 1.000 x g zentrifugieren.<br />
8. Sofort nach die Zentrifuge stillsteht, den Niederschlag durch eine<br />
einzelne vollständige Umkehrung der Becher dekantieren. Den<br />
Becher kurz leeren.<br />
9. Schritte 6, 7, und 8 wieder ausführen.<br />
10. Zweimal mit PBS waschen. (Schritte 4, 2, und 3 wieder ausführen.)<br />
11. In PBS wieder suspendieren und für mindestens 3 Stunden auf Eis<br />
(4ºC) stehen lassen, um vollständige Renaturierung des gebundenen<br />
Antikörpers zu ermöglichen.<br />
12. a.) An diesem Punkt kann das Reagenz gebraucht werden. Zweimal<br />
wie angewiesen waschen und zu einem Endvolumen von 20 ml (10<br />
mg/ml Immunobead-Reagenz) kombinieren.<br />
ODER<br />
b.) Gewöhnlich ist es günstig, das fertige Reagenz vor dem Gebrauch<br />
in einem analytischen System mit BSA aufzusaugen. Zweimal mit<br />
0,005 M Phosphat (pH-Wert 7,2) waschen und in 0,005 M Phosphat<br />
– 1% BSA Puffer wieder suspendieren.<br />
13. Das Reagenz kann durch Zentrifugierung in andere Puffer gewascht<br />
werden. Falls ohne Lyophilisierung gelagert, 1 ml 2% (2 g/100 ml)<br />
NaN 3 als Konservierungsmittel hinzufügen. Immunobead-Reagenz,<br />
das mit Natriumazid konserviert wird, ist gewöhnlich für mindestens<br />
180 Tage bei 4ºC stabil.<br />
Deutsch 6/7
VERWENDUNGEN DES IMMUNOBEAD-REAGENZES<br />
Fluorolmmunoassay 1,2 – 0,1 bis 1,0 mg Immunobead-Reagenzien<br />
pro Punkt<br />
Cell Labeling 3,4 (Zellenetikettierung) – 0,1 bis 0,2 mg Immunobead-<br />
Reagenzien pro 10 6 Zellen<br />
Radiolmmunoassay 5,6 – 0,1 bis 2,0 mg Imunobead-Reagenzien pro Punkt<br />
VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNUNGEN<br />
Diese Vorrichtung ist für die Anwendung durch Personal vorgesehen,<br />
das in Verfahren ausgebildet wurde, welche die für diese Vorrichtung<br />
angegebene zugelassene Anwendung beinhalten.<br />
Immunobead ® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Bio-Rad<br />
Laboratories.<br />
Deutsch 7/7
DESTINAZIONE D’USO<br />
200 mg di matrice Immunobead è fornita liofilizzata e contiene 0,01%<br />
di NaN 3 . La re-idratazione con 20 mL di acqua distillata produce una<br />
sospensione di 10 mg/mL nel tampone di accoppiamento consigliato.<br />
Non congelare dopo l’idratazione. Conservare a 4° C.<br />
L’accoppiamento con l’anticorpo è fatto ad un pH di 6,3; nonostante ciò,<br />
l’accoppiamento di altri tipi di proteine è fatto a un pH vicino al punto<br />
isoelettrico della proteina. Per esempio, la sieroalbumina umana (punto<br />
isoelettrico= 4,8) è accoppiata alla matrice Immunobead in un tampone<br />
di piridina 0,01M, ad un pH di 4,8. E’ essenziale che l’accoppiamento<br />
avvenga ad una forza ionica bassa (conduttività 1000 µohms).<br />
ISTRUZIONI PER L’USO<br />
A. Tamponi<br />
1. Tampone per l’accoppiamento (0,003 M fosfato, pH 6,3).<br />
Preparare una soluzione standard di 0,3 M di fosfato di potassio<br />
monobasico (KH 2 PO 4 anidro, m.w. = 136,1) dissolvendo 40,8 g di<br />
KH 2 PO 4 in un litro di H 2 O. Diluire 10 mL di 0,3 M di KH 2 PO 4 standard<br />
in 800 mL di acqua. Regolare il pH a 6,3 con 0,1 M di KOH. Diluire<br />
a 1,0 litri.<br />
2. Tampone fosfato salino (PBS) (0,1 M di KH 2 PO 4 , 0,15 M di NaCl, ad<br />
un pH di 7,2 con KOH).<br />
Dissolvere 478 g di cloruro di sodio (NaCl) e 0,1 g di NaN 3 in 500<br />
mL di acqua. Aggiungere 33,3 mL di una soluzione standard 0,3 M<br />
di KH 2 PO 4 . Regolare il pH a 7,2 con un M di KOH. Diluire a un litro<br />
con acqua.<br />
3. 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl) - PBS.<br />
Dissolvere 73,22 g di NaCl in 700 mL di PBS. Diluire a un litro con<br />
PBS e regolare il pH a 7,2. Se uno sfondo alto diventa un problema<br />
si consiglia il seguente tampone al posto di 1,4 M di NaCl - PBS: 5 M<br />
Italiano 1/6
di cloruro di guanidina (GuHCl) - PBS. Dissolvere 478 g di GuHCl<br />
e 8,77 g di NaCl in 700 mL d’acqua. Aggiungere 33,3 mL della<br />
soluzione standard 0,3 M di KH 2 PO 4 e regolare il pH a 7,2. Filtrare<br />
(se necessario) e diluire a 1,0 litri con acqua.<br />
4. 0,005 M di tampone fosfato, ad un pH di 7,2 (un tampone a forza<br />
ionica bassa utilizzato per la liofilizzazione di reagenti bead). Diluire<br />
16,7 mL di soluzione standard 0,3 M di KH 2 PO 4 con 800 mL di acqua.<br />
Regolare il pH a 7,2 con un M di KOH. Diluire a 1,0 litri.<br />
5. 0,005 M di tampone fosfato - 1% di BSA (usato per bloccare ogni<br />
assorbimento non specifico sui reagenti Immunobead finali). Se<br />
la BSA non è desiderata, un reagente simile dev’essere preparato<br />
usando un’altra “portatrice” proteica. Dissolvere 5 g di BSA di alta<br />
qualità (I.S. Cat. #1092) con 500 mL del precedente tampone.<br />
B. Preparazione della matrice Immunobead con<br />
l’Anticorpo Frazione Globulina<br />
1. Le frazioni globuline di antisieri devono essere completamente solubili<br />
in PBS. Centrifugare per rimuovere il materiale insolubile.<br />
2. Usando un valore per OD196 di 14 per globulina di coniglio e di<br />
280<br />
13 per globulina di capra si può determinare la concentrazione<br />
della propria preparazione. Dializzare un volume della propria<br />
preparazione contenente 8 - 10 mg di proteina dal tampone<br />
accoppiato.<br />
Aggiungere la preparazione di anticorpo dializzato, includendo ogni<br />
materiale che precipita nel tampone per l’accoppiamento, ai reagenti<br />
Immunobead.<br />
Se più di un mL di anticorpo dializzato è necessario per ottenere<br />
i richiesti 8 mg di proteina, la sospensione Immunobead deve<br />
essere centrifugata e decantata prima di aggiungere l’anticorpo.<br />
Dopo l’aggiunta della preparazione di anticorpo dializzato, regolare<br />
Italiano 2/6
il volume totale a 20 mL col tampone per l’accoppiamento.<br />
Risospendere i beads e regolare il pH a 6,3 se necessario.<br />
3. Incubare a 4° C per 1 ora.<br />
4. Aggiungere 40,0 mg di EDAC (1-etile-3 [3-dimetetilpropile]<br />
carbidimiide-HCl) alla miscela di reazione. Mescolare vigorosamente<br />
e completamente.<br />
5. Conservare a 4° C per almeno 3 ore. La miscela di reazione può<br />
essere conservata per una notte a questo punto, ma se la propria<br />
proteina non è stabile, centrifugare e lavare almeno una volta con<br />
PBS.<br />
6. Procedere con la procedura di sciacquo (Sezione D).<br />
C. Preparazione di Immunobead con Antisieri Interi<br />
Nota: Questa procedura produce un’attività specifica più bassa<br />
rispetto alla procedura con globulina.<br />
1. Centrifugare 200 µL di antisieri a 5.000 x g per rimuovere il materiale<br />
insolubile.<br />
2. Centrifugare la sospensione Immunobead e gettare il supernatante.<br />
3. Aggiungere 100 µL di antisieri e 6,5 mL del tampone per<br />
l’accoppiamento alla pallottola di Immunobead ottenuta dalla fase<br />
2. Risospendere e mescolare bene.<br />
4. Incubare a 40° C per un’ora.<br />
5. Aggiungere 20,0 mg di EDAC e mescolare vigorosamente.<br />
Conservare a 4°C per almeno 3 ore.<br />
6. Procedere con la sequenza di sciacquo (sezione D).<br />
Italiano 3/6
PREPARAZIONE DEL REAGENTE IMMUNOBEAD<br />
CON ANTISIERI INTERI<br />
µL antisieri/200mg<br />
Titolo degli antisieri* del reagente Immunobead<br />
A:1,000 (A)<br />
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)<br />
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100<br />
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50<br />
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25<br />
>1:100,000 (C) ............................................. 10<br />
* Per antisieri usati in procedure di radioimmunoanalisi il titolo è espresso<br />
come la massima diluizione che permette l’uso di un’aliquota di 100 µL e<br />
produce dati quantitativi. Siccome i reagenti Immunobead si depositano<br />
lentamente sui lunghi periodi, i titoli si devono basare su un’incubazione<br />
di 2 ore a risultati ottimi.<br />
A. Il titolo è troppo basso per essere utile per analisi quantitative. Può<br />
essere utile come tracciante isotopico di cellule.<br />
B. Preparazione di IgG Frazione e procedura d’uso nella Sezione B.<br />
C. Aliquote a partire da 50 µg di reagente Immunobead possono essere<br />
separate quantitivamente e sciacquate, anche se la pallottola è<br />
invisibile. L’Immunobead rabbit globulina gamma o goat globulina<br />
gamma possono essere aggiunte come diluenti per portare la totale<br />
quantità dei reagenti Immunobead fino a 100-200 µg per ottenere<br />
una pallottola facilmente visibile.<br />
D. Sequenza di Sciacquo<br />
Questa sequenza rimuoverà completamente il materiale legato non<br />
covalentemente con una perdita di attività minima. Tutte le fasi<br />
sono importanti e devono essere seguite rigorosamente. I tamponi<br />
devono essere conservati a 4°C. Una volta che la fase ricca di sale<br />
Italiano 4/6
è iniziata, le fasi rimanenti devono essere portate a termine in tempi<br />
brevi.<br />
1. Dividere il materiale in porzioni uguali in tubi centrifughi. E’ necessario<br />
un volume di sciacquo almeno pari a 80 mL/200 mg di reagente<br />
Immunobead.<br />
2. Riempire i tubi a capacità ed equilibrare i tubi con PBS. Centrifugare<br />
ad un minimo di 1.000 x g per almeno 10 minuti.<br />
3. Appena dopo l’arresto della centrifuga, decantare ed eliminare il<br />
supernatante invertendo i tubi completamente.<br />
4. Aggiungere una piccolo volume di PBS ad ogni tubo. Risospendere<br />
la pallottola usando un mescolatore a vortice o mescolando<br />
vigorosamente.<br />
5. Ripetere i punti 2 e 3.<br />
6. Risospendere la pallottola in un piccolo volume di 1,4 M di NaCl-<br />
PBS. Riempire il tubo (tubi) a capacità ed equilibrare con 1,4 M di<br />
NaCl-PBS.<br />
7. Centrifugare a 1.000 x g per 10 minuti.<br />
8. Appena dopo l’arresto della centrifuga, decantare il supernatante<br />
con una singola inversione completa dei tubi. Filtrare brevemente.<br />
9. Ripetere punti 6, 7 e 8.<br />
10. Lavare due volte con PBS. (Ripetere due volte i punti 4, 2 e 3.)<br />
11. Risospendere in PBS e porre su ghiaccio (4°C) per almeno 3 ore<br />
per permettere la completa renaturazione del anticorpo accoppiato.<br />
Italiano 5/6
12. a.) A questo punto, il reagente può essere usato. Sciacquare due<br />
volte come sopra e combinare fino ad un volume totale di 20 mL (10<br />
mg/mL di reagente Immunobead).<br />
OPPURE<br />
b.) In genere è di beneficio far assorbire il reagente finito con BSA<br />
prima dell’uso in un sistema analitico. Sciacquare due volte con<br />
0,005 M di fosfato, ad un pH di 7,2, e risospendere in 0,005 M di<br />
fosfato - 1% di tampone BSA.<br />
13. Il reagente può essere sciacquato centrifugando in altri tamponi<br />
per l’uso. Se conservato non liofilizzato, aggiungere 1 mL di 2%<br />
(2 g/100 mL) di soluzione di NaN 3 come conservante. Il reagente<br />
Immunobead conservato con azotidrato di sodio generalmente è<br />
stabile per almeno 180 giorni a 4°C.<br />
APPLICAZIONI DEL REAGENTE IMMUNOBEAD<br />
FluoroImmunoanalisi 1,2 - da 0,1 a 1,0 mg di reagenti Immunobead<br />
per punto<br />
Tracciante Isotopico di Cellule 3,4 - da 0,1 a 0,2 mg di reagenti<br />
Immunobead per 10 6 cellule<br />
RadioImmunoanalisi 5,6 - da 0,1 a 2,0 mg di reagenti Immunobead per point<br />
PRECAUZIONI E AVVERTIMENTI<br />
Questo dispositivo è previsto per l’uso da parte di personale addestrato<br />
nelle procedure che comprendono le applicazioni indicate per le quali<br />
il dispositivo è previsto.<br />
Immunobead ® è una marca registrata dei laboratori Bio-Rad.<br />
Italiano 6/6
USO PREVISTO<br />
Incluye 200 mg de matriz Immunobead liofilizada con 0.01% NaN 3 . La<br />
rehidratación con 20mL de agua destilada da lugar a una suspensión de<br />
10mg/mL en el tampón de unión recomendado. No congelar después de<br />
la rehidratación. Conserve a 4ºC.<br />
La unión del anticuerpo se lleva a cabo a pH 6.3; sin embargo, la<br />
unión de otros tipos de proteínas se produce a un pH cercano al punto<br />
isoeléctrico de la proteína. Por ejemplo, la albúmina sérica humana<br />
(punto isoeléctrico= 4.8) se une a la matriz Immunobead en un tampón<br />
de piridina 0.01M, pH=4.8. Es muy importante que la unión tenga lugar<br />
en un entorno de baja fuerza iónica (conductividad 1,000 µohms).<br />
INDICACIONES DE USO<br />
A. Tampones<br />
1. Tampón de unión (fosfato 0.003M, pH 6.3)<br />
Prepare una solución stock de fosfato potásico monobase (KH 2 PO 4<br />
anhidro, MW= 136.1) disolviendo 40.8g de KH 2 PO 4 en 1 L de agua.<br />
Diluya 10mL de la solución stock KH 2 PO 4 0.3M en 800 mL de agua.<br />
Ajuste el pH a 6.3 con KOH 0.1M. Enrasar a 1L).<br />
2. Tampón fosfato salino (PBS) (0.01M KH 2 PO 4 , 0.15M NaCl, ajuste a<br />
pH 7.2 con KOH).<br />
Disuelva 478 g de NaCl y 0.1g de NaN 3 en 500mL de agua. Añada<br />
33.3mL de la solución stock 0.3M KH 2 PO 4 . Ajuste el pH a 7.2 con<br />
KOH 1M. Añada agua hasta 1L.<br />
3. Cloruro sódico (NaCl) 1.4M - PBS<br />
Disuelva 73.22g de NaCl en 700mL de PBS. Enrase a 1L con PBS<br />
y ajuste el pH a 7.2.<br />
Si aparecen problemas de fondo por uniones inespecíficas, es<br />
preferible el siguiente tampón en vez del 1.4M NaCl-PBS: 5M<br />
hidrocloruro de guanidina (GuHCl)-PBS.<br />
Español 1/6
Disuelva 478 g de GuHCl y 8.77g NaCl en 700mL de agua. Añada<br />
33.3 mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 y ajuste el pH a 7.2. Filtre (si es<br />
necesario) y enrase a 1L con agua.<br />
4. Tampón fosfato 0.005M, pH 7.2 (un tampón de baja fuerza iónica<br />
utilizado para la liofilización de los reactivos de esferas).<br />
Diluya 16.7mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 en 800 mL de agua. Ajuste<br />
el pH a 7.2 con 1M de KOH. Enrase a 1L.<br />
5. Tampón fosfato 0.005M – 1% BSA (utilizado para bloquear cualquier<br />
unión inespecífica con los reactivos Immunobead finales). Si la BSA<br />
no es conveniente, debe preparar otro reactivo similar utilizando<br />
otra proteína “transportadora”. Disuelva 5g de BSA de alta calidad<br />
(IS Nº Cat. 1092) en 500 mL del tampón anterior.<br />
B. Preparación de la Matriz Immunobead con la fracción<br />
de globulinas de los anticuerpos.<br />
1. La fracción de globulinas del antisuero debe ser completamente<br />
soluble en PBS. Centrifugue para eliminar el material insoluble.<br />
2. Utilizando un valor de DO196 de 14 para las globulinas de conejo<br />
280<br />
y de 13 para las de cabra, determine la concentración de su<br />
preparación. Dialice un volumen de su preparación que contenga<br />
8-10mg de proteína contra el tampón de unión.<br />
Añada la preparación dializada del anticuerpo, incluyendo cualquier<br />
material que precipite en el tampón de unión, con los reactivos<br />
Immunobead.<br />
Si se necesita más de 1mL de anticuerpo dializado para conseguir 8<br />
mg de proteína, la suspensión de Immunobead se debe centrifugar<br />
y decantar antes de añadir el anticuerpo. Después de la adición del<br />
anticuerpo dializado, ajuste el volumen total a 20 mL con el tampón<br />
de unión. Resuspenda las esferas y ajuste el pH a 6.3 si fuera<br />
necesario.<br />
Español 2/6
3. Incube a 4º C 1hora.<br />
4. Añada 40.0 mg de EDAC (1-etil-3 [3-dimetilaminopropil] carbodiimida-<br />
HCl) a la mezcla de reacción. Agite fuerte y completamente.<br />
5. Mantenga a 4 ºC al menos 3horas. En este punto la mezcla de<br />
reacción se puede guardar toda la noche, pero si su proteína es<br />
inestable, centrifugue y lave al menos una vez con PBS.<br />
6. Prosiga con el protocolo de lavado (Sección D).<br />
C. Preparación de Immunobead con Antisuero<br />
Completo<br />
Nota: Este protocolo da lugar a una actividad específica inferior a la<br />
del protocolo de las globulinas.<br />
1. Centrifugue 200 µL de antisuero a 5000 x g para eliminar cualquier<br />
material insoluble.<br />
2. Centrifugue la suspensión de Immunobead y descarte el<br />
sobrenadante.<br />
3. Añada 100 µL de antisuero y 6.5 mL de tampón de unión al<br />
precipitado de Immunobead del paso 2. Resuspenda y mezcle bien.<br />
4. Incube a 40ºC 1 hora.<br />
5. Añada 20.0 mg de EDAC y mezcle fuertemente. Mantenga a 4º C<br />
al menos 3 horas.<br />
6. Prosiga con la secuencia de lavado (Sección D).<br />
Español 3/6
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS IMMUNOBEAD<br />
CON ANTISUERO COMPLETO<br />
µL antisuero/200mg<br />
Título del antisuero* Reactivo Immunobead<br />
A:1,000 ......................................................... (A)<br />
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)<br />
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100<br />
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50<br />
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25<br />
>1:100,000 (C) ............................................. 10<br />
*Para antisueros utilizados en técnicas de radioinmunoensayo el título se<br />
expresa como la mayor dilución que permite el uso de alícuotas de 100<br />
µL dando lugar a datos cuantitativos. Dado que en períodos largos los<br />
reactivos Immunobead tienden a precipitar lentamente, los títulos deben<br />
basarse en incubaciones de 2 horas para obtener resultados óptimos.<br />
A. El título es demasiado bajo para análisis cuantitativos. Puede ser<br />
útil para marcaje celular.<br />
B. Preparación de la Fracción IgG y utilización en Sección B.<br />
C. Alícuotas tan pequeñas como 50 µg de reactivos Immunobead se<br />
pueden separar cuantitativamente y lavar, incluso si el precipitado<br />
es invisible. Las Immunobead gamma globulina de conejo o gamma<br />
globulina de cabra se pueden añadir como diluyentes para completar<br />
la cantidad total de reactivos Immunobead hasta 100-200 µg para<br />
obtener un precipitado fácilmente visible.<br />
D. Secuencia de lavado.<br />
Este protocolo elimina completamente el material unido de forma<br />
no covalente con una pérdida mínima de actividad. Todos los pasos<br />
son importantes y se deben seguir estrictamente. Los tampones se<br />
deben conservar a 4ºC. Una vez se ha empezado el paso de alta<br />
Español 4/6
concentración de sales, los pasos siguientes deben llevarse a cabo<br />
hasta el final en el mínimo tiempo posible.<br />
1. Divida el material en partes iguales en tubos de centrífuga. Se<br />
necesita un volumen de lavado de al menos 80mL/200mg de<br />
reactivos Immunobead.<br />
2. Llene los tubos al máximo y equilíbrelos con PBS. Centrifugue<br />
mínimo a 1000 x g durante al menos 10 minutos.<br />
3. Inmediatamente después de la parada de la centrífuga, decante y<br />
descarte el sobrenadante invirtiendo los tubos completamente.<br />
4. Añada un volumen pequeño de PBS a cada tubo. Resuspenda el<br />
precipitado utilizando un vórtex o agitando fuertemente.<br />
5. Repita los pasos 2 y 3.<br />
6. Resuspenda el precipitado en un volumen pequeño de 1.4M NaCl-<br />
PBS. Llene los tubos al máximo y equilibre con 1.4M NaCl-PBS.<br />
7. Centrifugue a 1000 x g 10 minutos.<br />
8. Inmediatamente después de la parada de la centrífuga, el<br />
sobrenadante invirtiendo los tubos una sola vez. Secar ligeramente.<br />
9. Repita los pasos 6, 7 y 8.<br />
10. Lave dos veces con PBS. (Repita dos veces los pasos 4, 2 y 3).<br />
11. Resuspenda en PBS y mantenga en hielo (4ºC) al menos 3 horas<br />
para permitir la renaturalización completa del anticuerpo unido.<br />
12. a) En este punto, el reactivo puede ser utilizado. Lave dos veces<br />
como se indica arriba y combine hasta un volumen final de 20 mL<br />
(10mg/mL de reactivos Immunobead).<br />
O:<br />
Español 5/6
) Normalmente es beneficioso absorber el reactivo final con BSA<br />
antes de ser utilizado en un sistema analítico. Lave dos veces con<br />
fosfato 0.005 M, pH 7.2 y resuspenda en 0.005M fosfato – 1% BSA.<br />
13. El reactivo se puede lavar por centrifugación con otros tampones<br />
para ser utilizado. Si se va a conservar sin liofilización, añada 1mL de<br />
solución NaN 3 2% (2g/100mL) como conservante. Generalmente, los<br />
reactivos Immunobead conservados con azida sódica son estables<br />
al menos durante 180 días a 4ºC.<br />
APLICACIONES DE LOS REACTIVOS IMMUNOBEAD<br />
Fluoroinmunoensayo 1,2 – 0.1 a 1.0 mg de reactivos Immunobead<br />
por punto<br />
Marcaje celular 3,4 - 0.1 a 0.2 mg de reactivos Immunobead por 10 6 células<br />
Radioinmunoensayo 5,6 - 0.1 a 2.0 mg de reactivos Immunobead por punto<br />
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS<br />
Este dispositivo debe ser utilizado por personal capacitado en<br />
procedimientos que incluyan la aplicación prevista para el mismo.<br />
Immunobead ® es una marca registrada de Laboratorios Bio-Rad.<br />
Español 6/6
FRANÇAIS<br />
200 mg de matrice Immunobead, fourni lyophilisé et contenant 0,01%<br />
NaN 3 . La réhydratation avec 20 ml d’eau distillée produit une suspension<br />
de 10 mg/mL dans le tampon de couplage recommandé. Ne pas congeler<br />
après réhydratation. Conserver à 4° C.<br />
Le couplage aux anticorps est réalisé à pH 6,3; cependant, le couplage<br />
à d’autres protéines est fait à des pH proches des points isoélectriques<br />
de ces protéines. Par exemple, l’albumine sérique humaine (point<br />
isoélectrique = 4,8) est couplée à la matrice Immunobead dans un tampon<br />
0,01 M pyridine à pH 4,8. Il est très important que le couplage soit fait à<br />
faible force ionique (conductivité 1000 µohms)<br />
INSTRUCTIONS POUR L’EMPLOI<br />
A. Tampons<br />
1. Tampons de couplage (tampon phosphate 0,003M, pH 6,3).<br />
Préparer une solution mère 0,3M de phosphate de potassium<br />
monobasique (KH 2 PO 4 anhydre, poids moléculaire = 136,1) en<br />
dissolvant 40,8g de KH 2 PO 4 dans un litre de H 2 O. Diluer 10 ml de<br />
solution mère KH 2 PO 4 0,3M avec 800 ml d’eau. Ajuster le pH à 6,3<br />
avec du KOH 0,1M. Compléter le volume à 1litre.<br />
2. Tampon phosphate salin (PBS) (0,01M KH 2 PO 4 , 0,15M NaCl, pH 7,2<br />
avec du KOH).<br />
Dissoudre 478g de chlorure de sodium (NaCl) et 0,1g de NaN 3 dans<br />
500 ml d’eau. Ajouter 33,3 ml de solution mère KH 2 PO 4 0,3M. Ajuster<br />
le pH à 7,2 avec du KOH 1M. Compléter le volume à 1,0 litres avec<br />
de l’eau.<br />
3. Chlorure de sodium (NaCl) 1,4M – PBS.<br />
Dissoudre 73,22g de NaCl dans 700 ml PBS. Compléter le volume<br />
à 1,0 litres avec du PBS. Ajuster le pH à 7,2.<br />
Français 1/6
Si le bruit de fond devient un problème, le tampon suivant est suggéré<br />
à la place du NaCl 1,4M –PBS: hydrochlorure de guanidine (GuHCl)<br />
5M -PBS.<br />
Dissoudre 478g de GuHCl et 8,77g de NaCl dans 700 ml d’eau.<br />
Ajouter 33 ml de solution mère KH 2 PO 4 0,3M, ajuster le pH à 7,2.<br />
Filtrer (si nécessaire) et compléter le volume à un litre avec de l’eau.<br />
4. Tampon phosphate 0,005M, pH 7,2 (un tampon à faible force ionique<br />
utilisé pour la lyophilisation des réactifs de billes).<br />
Diluer 16,7 ml de solution mère KH 2 PO 4 0,3M avec 800 ml d’eau.<br />
Ajuster le pH à 7,2 avec du KOH 1M. compléter le volume à 1 litre<br />
avec de l’eau.<br />
. Tampon phosphate 0,005M – 1% BSA (utilisé pour bloquer toute<br />
adsorption non spécifique sur le réactif Immunobead final). Si la BSA<br />
est indésirable, un réactif similaire doit être préparé utilisant une autre<br />
protéine “porteuse”). Dissoudre 5g de BSA de grande qualité (<strong>Irvine</strong><br />
<strong>Scientific</strong>, réf. 1092) dans 500ml du tampon si dessus.<br />
B. Préparation de la matrice Immunobead avec la fraction anticorps<br />
des globulines<br />
1. La fraction globuline de l’antisérum doit être complètement soluble<br />
dans le PBS. Centrifuger pour éliminer tout matériel insoluble.<br />
2. Le rapport de densité optique OD196 est de 13 pour les globulines<br />
280<br />
de lapin et 14 pour les globulines de chèvre. En utilisant ce rapport,<br />
déterminer la concentration des globulines dans votre préparation.<br />
Dialyser un volume de cette préparation contenant 8 à 10 mg de<br />
protéines contre le tampon de couplage.<br />
Ajouter la préparation d’anticorps dialysée (en incluant tout matériel<br />
ayant précipité dans le tampon de couplage) au réactif Immunobead.<br />
Français 2/6
Si plus de 1ml de solution d’anticorps dialysée est nécessaire pour<br />
les 8mg de protéines requis, la suspension Immunobead doit alors<br />
être centrifugée et décantée avant l’addition de l’anticorps. Après<br />
l’addition de la préparation d’anticorps dialysée, ajuster le volume<br />
total à 20 ml en utilisant le tampon de couplage. Resuspendre les<br />
billes et ajuster le pH à 6,3 si nécessaire.<br />
3. Incuber à 4°C pendant une heure.<br />
4. Ajouter 40,0 mg d’EDAC (1-ethyl-3 [3-dimethylaminopropyl]<br />
carbodiimide-HCl) au mélange. Mélanger vigoureusement et<br />
complètement.<br />
5. Garder à 4°C pendant au moins 3 heures. A cette étape de la<br />
réaction, le mélange pourrait être conservé jusqu’au lendemain; mais<br />
si votre protéine est instable, centrifuger et laver au moins une fois<br />
avec du PBS.<br />
6. Laver selon le protocole décrit dans la section D.<br />
C. Préparation d’Immunobead avec l’antisérum total<br />
Remarque: Ce protocol produit une activité spécifique plus faible<br />
que celui avec les globulines.<br />
1. Centrifuger 200 µl d‘antisérum à 5000xg pour éliminer tout matériel<br />
insoluble.<br />
2. Centrifuger la suspension Immunobead et éliminer le surnageant.<br />
3. Ajouter 100 µl d‘antisérum et 6,5 ml de tampon de couplage au culot<br />
Immunoead de l’étape 2. Resuspendre et bien mélanger.<br />
4. Incuber à 40°C pendant une heure.<br />
5. Ajouter 20,0 mg d’EDAC et mélanger vigoureusement. Maintenir à<br />
4°C pendant au moins 3 heures.<br />
Français 3/6
6. Laver selon la séquence de lavage décrite dans la section D.<br />
PRÉPARATION DU RÉACTIF IMMUNOBEAD<br />
AVEC DU SÉRUM ENTIER<br />
µL d’antisérum/200mg<br />
Titre d’antisérum* de réactif Immunobead<br />
A:1,000 ......................................................... (A)<br />
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)<br />
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100<br />
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50<br />
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25<br />
>1:100,000 (C) ............................................. 10<br />
**Pour les antisérums utilisés dans les techniques RIA (radioimmunoassay)<br />
le titre est défini comme étant la plus grande dilution permettant l’utilisation<br />
d’une aliquote de 100 µl pour produire un résultat quantitatif. Comme le<br />
réactif Immunobead se fixe sur une longue période de temps, le titre doit<br />
être basé sur une incubation de deux heures pour un résultat optimal.<br />
A. Titre trop bas pour être utilisé pour une analyse quantitative. Pourrait<br />
être utilisé pour un marquage cellulaire.<br />
B. Préparer une fraction IgG et utiliser le protocole<br />
décrit dans la section B.<br />
C. Des aliquotes aussi petit que 50 µg de réactif Immunobead peuvent<br />
être séparées de façon quantitative et lavées bien que le culot soit<br />
invisible. Les Immunobead-gamma globulines de lapin ou de chèvre<br />
pourraient être rajoutés comme diluants pour amener la quantité<br />
totale du réactif immunobead à 100-200 µg et donner un culot<br />
facilement visible.<br />
D. Séquence de lavage<br />
Français 4/6
Cette séquence éliminera complètement tout matériel non lié de façon<br />
covalente avec une perte d’activité minimale. Toutes les étapes sont<br />
importantes et doivent être suivies rigoureusement. Les tampons<br />
doivent être maintenus à 4°C. Une fois l’étape de haute concentration<br />
en sels a commencé, le reste des étapes doit être achevé dans un<br />
temps minimum.<br />
1. Diviser le matériel en portions égales dans des tubes à centrifugation.<br />
Un volume de lavage d’au moins 80ml/200mg de réactif immunobead<br />
est requis.<br />
2. Remplier les tubes selon leurs capacités et les équilibrer avec du<br />
PBS. Centrifuger à 1000xg au minimum et pendant au moins 10<br />
minutes.<br />
3. Immédiatement après l’arrêt de la centrifugeuse, décanter et éliminer<br />
le surnageant en renversant complètement les tubes.<br />
4. Ajouter un petit volume de PBS à chaque tube. Resuspendre le culot<br />
en utilisant un Vortex ou en mélangeant vigoureusement.<br />
5. Répéter les étapes 2 et 3.<br />
6. Resuspendre le culot dans un petit volume de tampon NaCl 1,4M<br />
-PBS. Remplier les tubes selon leurs capacités et les équilibrer avec<br />
du NaCl 1,4M -PBS.<br />
7. Centrifuger à 1000xg pendant 10 minutes.<br />
8. Immédiatement après l’arrêt de la centrifugeuse, décanter le<br />
surnageant avec une seule inversion complète des tubes. Assécher<br />
brièvement.<br />
9. Répéter les étapes 6, 7 et 8.<br />
10. Laver deux fois avec du PBS. (Répéter deux fois les étapes 4, 2 et<br />
3).<br />
Français 5/6
11. Resuspendre dans du PBS et laisser reposer dans de la glace (4°C)<br />
pendant au moins 3 heures pour permettre la “renaturation” totale<br />
des anticorps liés.<br />
12. a.) A ce point, le réactif pourrait être utilisé. Laver deux fois comme<br />
indiqué si-dessus et combiner pour un volume final de 20ml (10mg/<br />
ml de réactif Immunobead).<br />
OU<br />
b.) Il est bénéfique d’incuber le réactif final avec du BSA avant son<br />
utilisation dans un système analytique. Laver deux fois avec du<br />
tampon phosphate 0,005M, pH 7,2 contenant 1% BSA.<br />
13. Le réactif pourrait être lavé par centrifugation avec d’autres tampons<br />
avant son utilisation. S’il le réactif est conservé sans lyophilisation,<br />
ajouter 1 ml d’une solution de 2% NaN3 (2g/100ml) comme<br />
conservateur. Le réactif immunobead conservé avec de l’azoture<br />
de sodium est généralement stable pendant au moins 180 jours à<br />
4°C.<br />
APPLICATIONS OF IMMUNOBEAD REAGENT<br />
Fluorolmmunoassay 1,2 – 0.1 to 1.0 mg de réactif Immunobead par point<br />
Marquage cellulaire 3,4 – 0.1 to 0.2 mg de réactif Immunobead per 10 6 cells<br />
Radiolmmunoassay 5,6 – 0.1 to 2.0 mg de réactif Immunobead per point<br />
PRÉCAUTION ET MISE EN GARDE<br />
Ce dispositif est destiné à une utilisation par un personnel formé aux<br />
procédures comprenant l’application indiquée pour laquelle le dispositif<br />
est destiné.<br />
Immunobead ® est une marque déposée des laboratoires Bio-Rad.<br />
Français 6/6
APLICAÇÃO<br />
Dispõe-se de 200 mg de matriz de imunoesferas liofilizada e com<br />
0.01% de NaN 3 . A re-hidratação com 20 mL de água destilada produz<br />
uma suspensão de 10 mg/mL no tampão de ligação recomendado. Não<br />
refrigerar depois da re-hidratação . Conservar a 4°C.<br />
A ligação de anticorpos é feita a pH 6.3; Não obstante, a ligação de outros<br />
tipos de proteínas é feita a um pH próximo ao ponto isoeléctrico das<br />
proteínas. Por exemplo, a albumina do soro humano (ponto isoeléctrico<br />
=4.8) é ligada à matriz de imunoesferas num tampão de 0.001M de<br />
pirimidina, pH 4.8. Isto é essencial, pois que a ligação será realizada a<br />
uma baixa força iónica. (condutividade 1,000 µohms).<br />
INSTRUÇÕES DE USO<br />
A. Tampões<br />
1. Tampão de ligação (0.003 M fosfato, pH 6.3).<br />
Prepare uma solução stock de 0.3 M de fosfato potássio monobásico<br />
(KH 2 PO 4 anidro, m.w. = 136.1) dissolvendo 40.8 g de KH 2 PO 4 em<br />
1lt de H 2 O. Dilua 10mL stock 0.3 M KH 2 PO 4 com 800 mL de água.<br />
Ajuste o pH a 6.3 com 0.1 M KOH. Diluir a 1.0 litro.<br />
2. Tampão salino de Fosfato (PBS) (0.01 M KH 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, pH<br />
7.2 com KOH).<br />
Dissolva 478 g de cloreto de sódio (NaCl) e 0.1 g NaN 3 em 500 mL<br />
de água. Adicionar 33.3 mL de solução stock 0.3 M KH 2 PO 4 . Ajustar<br />
o pH 7.2 com 1 M KOH. Diluir a 1.0 litro com água<br />
3. 1.4 M cloreto de sódio (NaCl) – PBS.<br />
Dissolva 73.22 g NaCl em 700 mL PBS. Dilua a 1.0 litro com PBS<br />
e ajuste o pH a 7.2.<br />
Se factos anteriores importantes constituem um problema, sugerese<br />
o uso do seguinte tampão em lugar do 1.4 M NaCl – PBS: 5M<br />
Português 1/6
Cloridrato guanidina(GuHCl) – PBS.<br />
Dissolva 478 g GuHCl e 8.77 g NaCl em 700 mL de água. Adicione<br />
33.3 mL de stock 0.3 M KH 2 PO 4 e ajuste a pH 7.2. Filtrar (se<br />
necessário) e diluir a 1.0 litro com água.<br />
4. Tampão de fosfato 0.005 M, pH 7.2 ( é utilizado um tampão de baixa<br />
força iónica para a liofilização das gotas de reagentes).<br />
Diluir 16.7 mL de stock 0.3 M KH 2 PO 4 com 800 mL de água. Ajustar<br />
o pH 7.2 com 1 M KOH. Diluir a 1.0 litro<br />
5. 0.005 M tampão de fosfato– 1% BSA (usado para impedir alguma<br />
absorção não especifica sobre os reagentes Immunobead finais).<br />
Se o BSA é indesejado, um reagente similar deve ser preparado<br />
usando outro transportador de proteínas). Dissolva 5 g de BSA de<br />
alta qualidade (I.S. Cat #1092) em 500 mL do tampão utilizado.<br />
B. Preparação da Matriz Immunobead com anticorpos<br />
de fracções de Globulina<br />
1. Fracções de Globulina de antisoros devem ser completamente<br />
solúveis em PBS. Centrifugue para remover material insolúvel.<br />
2. Usando um valor de OD196 de 14 para Globulina de Coelho e para<br />
280<br />
Globulina de Cabra, determine a concentração da sua preparação.<br />
Dialize um volume da sua preparação contendo 8-10 mg de proteína<br />
contra um Tampão de ligação.<br />
Adicione a preparação de anticorpos dializada, incluindo qualquer<br />
material que precipite no tampão de ligação, aos reagentes<br />
Immunobead.<br />
Se forem requeridos mais de 1 mL de anticorpos dializados<br />
para completar o requisito de 8mg de proteína, a suspensão<br />
deimunoesferas deve ser centrifugada e decantada antes da adição<br />
Português 2/6
de anticorpos. Depois da adição da preparação de anticorpos<br />
dializados, ajustar o volume total a 20 mL com o tampão de ligação.<br />
Ressuspender as gotas e ajustar ao pH de 6.3, se necessário.<br />
3. Incube a 4°C por 1 hora.<br />
4. Adicione 40.0 mg EDAC (1-etil-3 [3-dimetilaminopropil] carbodiimida<br />
HCl) a mistura de reacção. Misturar muito bem e vigorosamente.<br />
5. Conservar a 4° C por pelo menos 3 horas. A mistura da reacção<br />
pode guardar-se durante a noite tal qual está, mas se a proteína é<br />
instável centrifugue e lave pelo menos uma vez com PBS.<br />
6. Siga com os procedimentos de lavagem (Secção D).<br />
C. Preparação de Imunoesferas com Antisoro intacto<br />
Nota: Este procedimento produz uma actividade especifica menor<br />
que o procedimento da Globulina<br />
1. Centrifugue 200 µL de antisoro a 5,000 x g para remover qualquer<br />
material insolúvel.<br />
2. Centrifugue a suspensão de imunoesferas e descarte o<br />
sobrenadante.<br />
3. Adicione 100 µL de antisoro e 6.5 mL de tampão de ligação ao pellet<br />
de imunoesferas do passo 2. Ressuspender e agitar muito bem.<br />
4. Incube a 40° C por 1 hora.<br />
5. Adicione 20.0 mg EDAC e agite vigorosamente. Conserve a 4° C<br />
por pelo menos 3 horas.<br />
6. Continue com a sequência de lavagem (Secção D).<br />
Português 3/6
PREPARAÇÃO DO REAGENTE IMMUNOBEAD<br />
COM ANTISORO INTACTO<br />
µL antisoro/200mg<br />
Antisoro titulado* Reagente Immunobead<br />
A:1,000 ......................................................... (A)<br />
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)<br />
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100<br />
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50<br />
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25<br />
>1:100,000 (C) ............................................. 10<br />
*Para antisoro usado em procedimentos de radioimunoensaio , o título<br />
é expresso como a maior diluição que permite o uso duma alíquota de<br />
100 µL e que produz dados quantitativos. Sempre que os reagentes<br />
Immunobead sejam suavemente mantidos em repouso por períodos<br />
longos, os títulos deverão implicar uma incubação de aproximadamente<br />
2 horas para obter bons resultados.<br />
A. Titulo é demasiado baixo para ser usado em análises quantitativas.<br />
Pode ser usado para marcação de células..<br />
B. Preparação da Fracção lgG . Use os procedimentos da secção B<br />
C. Alíquotas tão pequenas como 50 µg de reagentes Immunobead<br />
podem ser separadas quantitativamente e lavadas, embora o pellet<br />
é invisível. Gama Globulinas de coelho Immunobead ou Gama<br />
-globulina de cabra podem ser adicionadas como diluentes para<br />
levar a quantidade total de reagentes Immunobead até 100-200 µg<br />
para permitir um pellet facilmente visível.<br />
D. Sequência de lavagem<br />
Esta sequência removerá completamente o material não ligado<br />
covalentemente, com um mínimo de perda de actividade. Todos<br />
os passos são importantes e devem ser seguidos rigorosamente.<br />
Português 4/6
Os tampões devem ser conservados a a 4° C. Uma vez começado<br />
o high salt step, os restantes passos devem ser completados no<br />
mínimo de tempo.<br />
1. Divida o material colocando quantidades iguais em tubos de<br />
centrifuga . Requer-se de um volume de pelo menos 80 mL/200<br />
mg de reagente Immunobead para a lavagem<br />
2. Encha os tubos na sua capacidade e equilibre os mesmos com PBS.<br />
Centrifugue a um mínimo de 1,000 x g pelo menos, por 10 minutos.<br />
3. Imediatamente depois da centrifuga parar, decante e descarte o<br />
sobrenadante mediante a inversão completa dos tubos.<br />
4. Adicione um pequeno volume de PBS a cada tubo. Ressuspenda<br />
o pellet usando um agitador vortex ou agitador vigoroso.<br />
5. Repita os passos 2 e 3.<br />
6. Resuspenda o pellet num pequeno volume de 1.4 M NaCl-PBS.<br />
Encha os tubos na sua capacidade e equilibre com 1.4 M NaCl-PBS.<br />
7. Centrifugue a 1,000 x g por 10 minutos.<br />
8. Imediatamente depois da centrifuga parar, decante o sobrenadante<br />
com uma única e completa inversão dos tubos. Seque brevemente.<br />
9. Repita os passos 6, 7, e 8.<br />
10. Lave duas vezes com PBS. (Repita duas vezes os passos 4, 2, e<br />
3.)<br />
11. Ressuspenda em PBS e deixe repousar sobre gelo (4°C) pelo menos<br />
por 3 horas para permitir completar a renaturação dos anticorpos<br />
de ligação<br />
Português 5/6
12. a.) Nesta altura , o reagente pode ser usado. Lave duas vezes como<br />
indicado anteriormente e leve a um volume final de 20 mL (10 mg/<br />
mL de reagente Immunobead).<br />
OU<br />
b.) Frequentemente é conveniente absorver o reagente final com<br />
BSA antes de usar –se um sistema analítico. Lave duas vezes<br />
com 0.005 M de fosfato, pH 7.2, e deixe repousar em 0.005 M de<br />
fosfato – 1% tampão BSA .<br />
O reagente pode ser lavado por centrifugação dentro de outros<br />
tampões para uso. Se é conservado sem liofilização, adicione 1 mL<br />
of 2% (2 g/100 mL) de solução NaN 3 como conservante. Reagentes<br />
Immunobead conservados com azida sódica são geralmente<br />
estáveis por pelo menos 180 dias a 4°C.<br />
APLICAÇÕES DOS REAGENTES DE IMMUNOBEAD<br />
Fluorolmunoensaio 1,2 – 0.1 a 1.0 mg reagentes Imunobead por ponto<br />
Marcação de células 3,4 – 0.1a 0.2 mg reagentes Immunobead por<br />
10 6 células<br />
Radiolmunoensaio 5,6 – 0.1 ao 2.0 mg reagentes Imunobead por ponto<br />
PRECAUÇÕES E AVISOS<br />
Este dispositivo deve ser utilizado por funcionários treinados em<br />
procedimentos aos quais se destina.<br />
Immunobead ® é uma marca comercial registada dos Laboratórios<br />
Bio-Rad.<br />
Português 6/6
REFERENCES<br />
1. Burgett, M. W. et al., “Fluorescent Immunoassay for the Quantitation<br />
of C 4 Complement,” J. Immunol. Methods, 16, 211 (1977).<br />
2. Burgett, M. W. et al, “Fluorescent Immunoassay for the Quantitation<br />
of C3 Complement,” Clin. Chim. Acta 78,277 (1977).<br />
3. Chao, W. and Yokoyama, M., “Determination of B Lympocyte<br />
Population, “Clin. Chim. Acta, 78, 79 (1977).<br />
4. Ammann, A. J., Borg, D., Kondo, L. and Ward, D. W. J. Immunol.<br />
Methods, 17, 365 (1977).<br />
5. Cheung, A. H., et al., “Direct Solid Phase Radioimmunoassay for<br />
Chicken Lipoprotein Lipase, “Anal. Biochem, 94, 346(1979).<br />
6. Langone, J. J., “A Solid-Phase Immunoassay for Human Immunoglobulin<br />
E: Use of 125 l-Labeled Protein A as the Tracer” Anal.<br />
Biochem, 93, 207 (1979).<br />
Immunobead ® is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories.<br />
Immunobead ® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Bio-Rad<br />
Laboratories.<br />
Immunobead ® è una marca registrata dei laboratori Bio-Rad.<br />
Immunobead ® es una marca registrada de Laboratorios Bio-Rad.<br />
mmunobead ® est une marque déposée des laboratoires Bio-Rad.<br />
Immunobead ® é uma marca comercial registada dos laboratórios Bio-Rad.
Symbols:<br />
2°C<br />
8°C<br />
European Representative<br />
MPIE<br />
Schutweg 13A<br />
5145 NP Waalwijk, The Netherlands<br />
0050<br />
See instructions<br />
for use.<br />
Expiration:<br />
Year - Month - Day<br />
Catalog Number<br />
Lot Number<br />
Caution: See<br />
instructions for use<br />
Storage<br />
Temperature<br />
MPIE Schutweg 13a<br />
5145 NP Waalwijk,<br />
The Netherlands<br />
CE Mark<br />
2511 Daimler Street, Santa Ana, California 92705-5588<br />
Telephone: 1 949 261 7800 • 1 800 437 5706<br />
Fax: 1 949 261 6522 • www.irvinesci.com<br />
PN 40463 Rev. 5