Activated Immunobead® Matrix - Irvine Scientific

Activated Immunobead ® Matrix
Catalog No. 15391 200 mg
All testing results are provided on a lot-specific Certificate of Analysis.
Alle resultate werden auf einem los spezifischen Analysenzertifikat zur
Verfuegung gestellt.
Tutti i risultati sono riportati in un Certificato di Analisi specifico per lotto.
Todos los resultados están descritos en el Certificado de Análisis
específico de cada lote.
Les résultats de ces tests sont fournis dans un certificat d’analyses
spécifique à chaque lot.
Todos os resultados estão descritos no Certificado de Análise
específico de cada lote.

INTENDED USE
200 mg of Immunobead matrix is supplied lyophilized and contains
0.01% NaN 3 . Re-hydration with 20 mL of distilled water produces a 10
mg/mL suspension in the recommended coupling buffer. Do not freeze
after hydration. Store at 4°C.
Antibody coupling is done at pH 6.3; however, coupling of other types of
proteins is done at a pH close to the isoelectric point of the protein. For
example, human serum albumin (isoelectric point = 4.8) is coupled to
the Immunobead matrix in 0.01 M pyridine buffer, pH 4.8. It is essential
that the coupling be run at low ionic strength (conductivity 1,000 µohms).
DIRECTIONS FOR USE
A. Buffers
1. Coupling buffer (0.003 M phosphate, pH 6.3).
Prepare a 0.3 M stock solution of monobasic potassium phosphate
(KH 2 PO 4 anhydrous, m.w. = 136.1) by dissolving 40.8 g of KH 2 PO 4
in 1 liter H 2 O. Dilute 10mL stock 0.3 M KH 2 PO 4 with 800 mL water.
Adjust pH to 6.3 with 0.1 M KOH. Dilute to 1.0 liter.
2. Phosphate buffered saline (PBS) (0.01 M KH 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, pH
7.2 with KOH).
Dissolve 478 g sodium chloride (NaCl) and 0.1 g NaN 3 in 500 mL
water. Add 33.3 mL of a 0.3 M KH 2 PO 4 stock solution. Adjust to pH
7.2 with 1 M KOH. Dilute to 1.0 liter with water
3. 1.4 M sodium chloride (NaCl) – PBS.
Dissolve 73.22 g NaCl in 700 mL PBS. Dilute to 1.0 liter with PBS
and adjust pH to 7.2.
If high background becomes a problem, the following buffer is
suggested in place of 1.4 M NaCl – PBS: 5M guanidine hydrochloride
(GuHCl) – PBS.
English 1/6

Dissolve 478 g GuHCl and 8.77 g NaCl in 700 mL water. Add 33.3
mL of stock 0.3 M KH 2 PO 4 and adjust to pH 7.2. Filter (if necessary)
and dilute to 1.0 liter with water.
4. 0.005 M phosphate buffer, pH 7.2 (a low ionic strength buffer utilized
for lyophilization of bead reagents).
Dilute 16.7 mL of stock 0.3 M KH 2 PO 4 with 800 mL water. Adjust to
pH 7.2 with 1 M KOH. Dilute to 1.0 liter
0.005 M phosphate buffer – 1% BSA (used to block any non-specific
absorption on final Immunobead reagents). If BSA is undesirable, a
similar reagent should be prepared using another “carrier” protein).
Dissolve 5 g of a high quality of BSA (I.S. Cat #1092) in 500 mL of
the preceding buffer.
B. Immunobead Matrix Preparation with Globulin
Fraction Antibody
1. Globulin fractions of antisera should be completely soluble in PBS.
Centrifuge to remove insoluble material.
2. Using a value for OD196 of 14 for rabbit globulin and 13, for goat
280
globulin, determine the concentration of your preparation. Dialyze
a volume of your preparation containing 8-10 mg protein against
coupling buffer.
Add the dialyzed antibody preparation, including any material that
precipitates in the coupling buffer, to the Immunobead reagents.
If more than 1 mL of dialyzed antibody is required to yield the requisite
8 mg of protein, the Immunobead suspension should be centrifuged
and decanted prior to addition of antibody. After addition of the
dialyzed antibody preparation, adjust the total volume to 20 mL with
the coupling buffer. Re-suspend the beads and adjust the pH to 6.3,
if necessary.
English 2/6

3. Incubate at 4°C for 1 hour.
4. Add 40.0 mg EDAC (1-ethyl-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide-
HCl) to the reaction mixture. Mix vigorously and completely.
5. Store at 4° C for at least 3 hours. The reaction mixture may be stored
overnight at this point, but if your protein is unstable, centrifuge and
wash at least once with PBS.
6. Proceed with the wash procedure (Section D).
C. Immunobead Preparation with Whole Antisera
Note: This procedure produces a lower specific activity than the
globulin procedure.
1. Centrifuge 200 µL of antisera at 5,000 x g to remove any insoluble
material.
2. Centrifuge the Immunobead suspension and discard the supernatant.
3. Add 100 µL antisera and 6.5 mL coupling buffer to Immunobead
pellet from Step 2. Re-suspend and mix well.
4. Incubate at 40° C for 1 hour.
5. Add 20.0 mg EDAC and mix vigorously. Maintain at 4° C for at least
3 hours.
6. Proceed with the wash sequence (Section D).
English 3/6

IMMUNOBEAD REAGENT PREPARATION
WITH WHOLE ANTISERA
µL antisera/200mg
Antisera titer* Immunobead Reagent
A:1,000 ......................................................... (A)
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25
>1:100,000 (C) ............................................. 10
*For antisera used in radioimmunoassay procedures the titer is expressed
as the greatest dilution that will allow use of a 100 µL aliquot and
produce quantitative data. Since the Immunobead reagents will slowly
settle over long periods, titers should be based on a 2 hour incubation
of optimum results.
A. Titer is too low to be useful for quantitative analysis. May be useful
for cell labeling.
B. Preparation lgG Fraction and use procedure in Section B.
C. Aliquots as small as 50 µg of Immunobead reagent can be
quantitatively separated and washed, even though the pellet is
invisible. Immunobead rabbit gamma globulin or goat gamma
globulin may be added as diluents to bring the total amount of
Immunobead reagents up to 100-200 µg to give an easily visible
pellet.
D. Wash Sequence
This sequence will completely remove non-covalently bound material
with minimum loss activity. All steps are important and should be
followed rigorously. Buffers should be maintained at 4° C. Once
the high salt step is started, the remaining steps should be carried
through to completion in minimal time.
English 4/6

1. Divide the material into equal portions in centrifuge tubes. A wash
volume of at least 80 mL/200 mg Immunobead reagent is required.
2. Fill tubes to capacity and balance the tubes with PBS. Centrifuge
at a minimum of 1,000 x g for at least 10 minutes.
3. Immediately after the centrifuge stops, decant and discard the
supernatant by completely inverting the tubes.
4. Add a small volume of PBS to each tube. Re-suspend the pellet by
using a vortex mixer or vigorous mixing.
5. Repeat steps 2 and 3.
6. Re-suspend the pellet in a small volume of 1.4 M NaCl-PBS. Fill the
tube(s) to capacity and balance with 1.4 M NaCl-PBS.
7. Centrifuge at 1,000 x g for 10 minutes.
8. Immediately after the centrifuge stops, decant the supernatant with
a single complete inversion of the tubes. Drain briefly.
9. Repeat steps 6, 7, and 8.
10. Wash twice with PBS. (Repeat twice Steps 4, 2, and 3.)
11. Re-suspend in PBS and allow to stand on ice (4°C) for at least 3
hours to allow complete renaturation of bound antibody.
12 a.) At this point, the reagent may be used. Wash twice as above
and combine to a final volume of 20 mL (10 mg/mL of Immunobead
reagent).
OR
English 5/6

.) It is usually beneficial to absorb the finished reagent with BSA
before use in an analytical system. Wash twice with 0.005 M
phosphate, pH 7.2, and re-suspend in 0.005 M phosphate – 1%
BSA buffer.
13. The reagent may be washed by centrifugation into other buffers for
use. If stored without lyophilization, add 1 mL of 2% (2 g/100 mL)
NaN 3 solution as a preservative. Immunobead reagent preserved
with sodium azide is generally stable for at least 180 days at 4°C.
APPLICATIONS OF IMMUNOBEAD REAGENT
Fluorolmmunoassay 1,2 – 0.1 to 1.0 mg Immunobead regents per point
Cell Labeling 3,4 – 0.1 to 0.2 mg Immunobead reagents per 10 6 cells
Radiolmmunoassay 5,6 – 0.1 to 2.0 mg Imunobead reagents per point
PRECAUTIONS AND WARNINGS
This device is intended to be used by staff trained in procedures that
include the indicated application for which the device is intended.
Immunobead ® is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories.
English 6/6

VERWENDUNGSZWECK
200 mg lyophilisiertes Immunobead Matrix wird beliefert. Das
Immunobead Matrix beinhaltet 0,01% NaN 3 . Die Wiederhydration mit 20
ml destilliertem Wasser stellt eine 10 mg/ml Suspension im empfohlenen
Kupplungspuffer her. Das Produkt nicht nach der Hydration einfrieren.
Bei 4ºC lagern.
Antikörper-Kupplung wird bei einem pH-Wert von 6,3 ausgeführt; aber,
die Kupplung von anderen Arten von Proteinen wird bei einem pH-Wert
ausgeführt, der nahe am isoelektrischen Punkt des Proteins ist. Zum
Beispiel, Human Serum Albumin (isoelektrischer Punkt = 4,8) wird zum
Immunobead Matrix in 0,01 M Pyridine-Puffer (pH-Werd 4,8) verkoppelt.
Es ist notwendig, dass die Kupplung bei niedrigem Ionenstärke
(Leitfähigkeit 1.000 µohm) ausgeführt wird.
GEBRAUCHSANWEISUNG
A. Puffer
1. Kupplungspuffer (0,003 M Phosphat, pH-Wert 6,3).
40,8 g KH 2 PO 4 in 1 Liter H 2 O auflösen, um eine 0,3 M Stammlösung
von monobasischem Kaliumphosphat (KH 2 PO 4 wasserfrei,
Molekulargewicht = 136,1) vorzubereiten. 10 ml 0,3 M KH 2 PO 4 mit
800 ml Wasser verdünnen. Den pH-Wert bis zu 6,3 mit 0,1 M KOH
bringen. Das Produkt zu 1,0 Liter verdünnen.
2. Phosphate buffered saline (PBS) (0,01 M KH 2 PO 4 , 0,15 M NaCl,
pH-Wert 7,2 mit KOH).
478 g Natriumchlorid und 0,1 g NaN 3 in 500 mL Wasser auflösen. 33,3
ml einer 0,3 M KH 2 PO 4 Stammlösung hinzufügen. Den pH-Wert bis
zu 7,2 mit 1 M KOH bringen. Bis zu 1,0 Liter mit Wasser verdünnen.
3. 1,4 M Natriumchlorid (NaCl) – PBS.
73,22 g NaCl in 700 ml PBS auflösen. Bis zu 1,0 Liter mit PBS
verdünnen und den pH-Wert bis zu 7,2 bringen.
Deutsch 1/7

Falls hoher Hintergrund ein Problem ist, der folgende Puffer wird statt
1,4 M NaCl – PBS empfohlen: 5M Guanidinhydrochlorid (GuHCl) –
PBS.
478 g GuHCl und 8,77 g NaCl in 700 ml Wasser auflösen. 33,3 ml
0,3 M KH 2 PO 4 hinzufügen und den pH-Wert bis zu 7,2 bringen. Filtern
(falls nötig) und bis zu 1,0 Liter mit Wasser verdünnen.
4. 0,005 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,2 (Puffer die von niedriger
Ionenstärke sind, und die zum Gebrauch in der Lyophilisierung von
Perlen-Reagenzien bestimmt sind).
16,7 ml 0,3 M KH 2 PO 4 mit 800 ml Wasser verdünnen. Den pH-Wert
bis zu 7,2 mit 1 M KOH bringen. Bis zu 1,0 Liter verdünnen.
5. 0,005 M Phosphatpuffer – 1% BSA (Verhindert unspezifische
Aufsaugung mit endgültige Immunobead-Reagenzien). Falls BSA
nicht wünschenswert ist, ein ähnliches Reagenz soll mit einem
anderen Carrierprotein vorbereitet werden. 5 g eines hochwertigen
BSA (I.S. Katalog # 1092) in 500 ml des vorhergehenden Puffers
auflösen.
B. Vorbereitung des Immunobead Matrix mit Globulin
Fraction Antibody (Globulinbruchteil Antikörper)
1. Globulinbruchteile der Heilsera sollen in PBS total löslich sein.
Zentrifugieren, um unlöslichen Stoff wegzunehmen.
2. Mit einem Wert für OD196 von 14 für Kaninchenglobulin und 13 für
280
Ziegenglobulin, die Konzentration Ihrer Vorbereitung bestimmen.
Ein Volumen (Proteininhalt: 8-10 mg) Ihrer Vorbereitung gegen den
Kupplungspuffer dialysieren.
Die dialysierte Antikörpervorbereitung zu den Immunobead-
Reagenzen hinzufügen, einschliesslich Stoff, der im Kupplungspuffer
präzipitiert.
Deutsch 2/7

Falls mehr als 1 ml dialysiertes Antikörper nötig ist, um die
notwendigen 8 mg Protein zu ergeben, die Suspension zentrifugieren
und dekantieren, vor der Hinzufügung des Antikörpers. Nach der
Hinzufügung des dialysierten Antikörpers das Volumen mit dem
Kupplungspuffer zu einem Endvolumen von 20 ml bringen. Die Perlen
wieder suspendieren und bis zu einem von 6,3 bringen, falls nötig.
3. Für 1 Stunde bei 4ºC bebrüten.
4. 40,0 mg EDAC (1-ethyl-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide-HCl)
zur Reaktionsmischung hinzufügen. Vollständig und energisch
mischen.
5. Für mindestens 3 Stunden bei 4ºC lagern. Die Reaktionsmischung
kann an diesem Punkt über Nacht gelagert werden, aber falls Ihr
Protein nicht stabil ist, das Protein zentrifugieren und mindestens
einmal mit PBS waschen.
6. Das Waschverfahren (Abteilung D) fortühren.
C. Vorbereitung des Immunobead-Reagenzes mit
Whole Antisera (ganzen Heilsera)
Hinweis: Dieses Verfahren ergibt eine niedrigere spezifische Aktivität
als das Globulinverfahren.
1. 200 µL Heilsera bei 5.000 x g zentrifugieren, um unlöslichen Stoff
wegzunehmen.
2. Die Immunobead-Suspension zentrifugieren und den Überstand
wegwerfen.
3. 100 µL Heilsera und 6,5 ml Kupplungspuffer zum Immunobead-
Niederschlag von Schritt 2 hinzufügen. Wieder suspendieren und
gründlich mischen.
Deutsch 3/7

4. Für 1 Stunde be 40ºC bebrüten.
5. 20,0 mg EDAC hinzufügen und gründlich mischen. Mindestens 3
Stunden bei 4ºC lagern. Die Reaktionsmischung kann an diesem
Punkt über Nacht gelagert werden, aber falls Ihr Protein nicht stabil
ist, das Protein zentrifugieren und mindestens einmal mit PBS
waschen.
6. Das Waschverfahren (Abteilung D) fortführen.
VORBEREITUNG DES IMMUNOBEAD-REAGENZES
MIT WHOLE ANTISERA (GANZEN HEILSERA)
µL heilsera/200mg
Heilsera titer* Immunobead Reagenz
A:1,000 ......................................................... (A)
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25
>1:100,000 (C) ............................................. 10
*Für Heilsera, die in Radioimmunoassay-Verfahren gebraucht werden,
ist der Titer die grösste Verdünnung, die das Gebrauch von einem 100
µL Aliquot ermöglicht und die quantitative Daten ergeben wird. Weil die
Zutaten der Immunobead-Reagenzien über einen langen Zeitraum sich
langsam trennen können, sollen Titer für optimale Ergebnisse auf eine
Bebrütung von 2 Stunden basiert sein.
A. Titer ist zu niedrig, für quantitative Analyse gebraucht zu werden.
Kann für Zellenetikettierung gebraucht werden.
B. Vorbereitung IgG Bruchteil und in Abteilung B gebrauchen.
Deutsch 4/7

C. Aliquoten so klein wie 50 µg Immunobead-Reagenz können
quantitativ getrennt und gewaschen werden, obwohl der
Niederschlag unsichtbar ist. Immunobead Rabbit Gamma Globulin
(Kaninchen-Gamma-Globulin) oder Goat Gamma Globulin (Ziegen-
Gamma-Globulin) können als Verdünnungsmitteln hinzugefügt
werden, um die Totalanzahl zu 100-200 µg zu bringen, um einen
leicht sichtbaren Niederschlag zu ergeben.
D. Waschsequenz
Diese Sequenz wird allen nicht kovalent gebundenen Stoff mit
minimale Schadenaktivität total wegnehmen. Alle Schritte sind wichtig
und sollen streng befolgt werden. Puffer sollen bei 4ºC beibehaltet
werden. Sobald der Hochsalz-Schritt angefangen worden ist, sollen
die restlichen Schritte in minimalem Zeitraum ausgeführt werden.
1. Den Stoff in gleiche Mengen in Zentrifugenbecher aufteilen. Ein
Waschvolumen von mindestens 80 ml/200 mg Immunobead-
Reazenz ist notwendig.
2. Die Becher zu voller Kapazität auffüllen und mit PBS aufwiegen. Für
mindestens 10 Minuten bei mindestens 1.000 g zentrifugieren.
3. Sofort nachdem die Zentrifuge stillsteht, dekantieren und den
Überstand durch Umkehrung der Becher wegwerfen.
4. Ein kleines Volumen PBS zu jedem Becher hinzufügen. Den
Niederschlag entweder mit einem Wirbelmischer oder durch
energische Mischung wieder suspendieren.
5. Schritte 2 und 3 wieder ausführen.
6. Den Niederschlag in einem kleinen Volumen von 1,4 M NaCl-PBS
wieder suspendieren. Den/die Becher zu voller Kapazität auffüllen
und mit 1,4 M NaCl-PBS aufwiegen.
Deutsch 5/7

7. Für 10 Minuten bei 1.000 x g zentrifugieren.
8. Sofort nach die Zentrifuge stillsteht, den Niederschlag durch eine
einzelne vollständige Umkehrung der Becher dekantieren. Den
Becher kurz leeren.
9. Schritte 6, 7, und 8 wieder ausführen.
10. Zweimal mit PBS waschen. (Schritte 4, 2, und 3 wieder ausführen.)
11. In PBS wieder suspendieren und für mindestens 3 Stunden auf Eis
(4ºC) stehen lassen, um vollständige Renaturierung des gebundenen
Antikörpers zu ermöglichen.
12. a.) An diesem Punkt kann das Reagenz gebraucht werden. Zweimal
wie angewiesen waschen und zu einem Endvolumen von 20 ml (10
mg/ml Immunobead-Reagenz) kombinieren.
ODER
b.) Gewöhnlich ist es günstig, das fertige Reagenz vor dem Gebrauch
in einem analytischen System mit BSA aufzusaugen. Zweimal mit
0,005 M Phosphat (pH-Wert 7,2) waschen und in 0,005 M Phosphat
– 1% BSA Puffer wieder suspendieren.
13. Das Reagenz kann durch Zentrifugierung in andere Puffer gewascht
werden. Falls ohne Lyophilisierung gelagert, 1 ml 2% (2 g/100 ml)
NaN 3 als Konservierungsmittel hinzufügen. Immunobead-Reagenz,
das mit Natriumazid konserviert wird, ist gewöhnlich für mindestens
180 Tage bei 4ºC stabil.
Deutsch 6/7

VERWENDUNGEN DES IMMUNOBEAD-REAGENZES
Fluorolmmunoassay 1,2 – 0,1 bis 1,0 mg Immunobead-Reagenzien
pro Punkt
Cell Labeling 3,4 (Zellenetikettierung) – 0,1 bis 0,2 mg Immunobead-
Reagenzien pro 10 6 Zellen
Radiolmmunoassay 5,6 – 0,1 bis 2,0 mg Imunobead-Reagenzien pro Punkt
VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNUNGEN
Diese Vorrichtung ist für die Anwendung durch Personal vorgesehen,
das in Verfahren ausgebildet wurde, welche die für diese Vorrichtung
angegebene zugelassene Anwendung beinhalten.
Immunobead ® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Bio-Rad
Laboratories.
Deutsch 7/7

DESTINAZIONE D’USO
200 mg di matrice Immunobead è fornita liofilizzata e contiene 0,01%
di NaN 3 . La re-idratazione con 20 mL di acqua distillata produce una
sospensione di 10 mg/mL nel tampone di accoppiamento consigliato.
Non congelare dopo l’idratazione. Conservare a 4° C.
L’accoppiamento con l’anticorpo è fatto ad un pH di 6,3; nonostante ciò,
l’accoppiamento di altri tipi di proteine è fatto a un pH vicino al punto
isoelettrico della proteina. Per esempio, la sieroalbumina umana (punto
isoelettrico= 4,8) è accoppiata alla matrice Immunobead in un tampone
di piridina 0,01M, ad un pH di 4,8. E’ essenziale che l’accoppiamento
avvenga ad una forza ionica bassa (conduttività 1000 µohms).
ISTRUZIONI PER L’USO
A. Tamponi
1. Tampone per l’accoppiamento (0,003 M fosfato, pH 6,3).
Preparare una soluzione standard di 0,3 M di fosfato di potassio
monobasico (KH 2 PO 4 anidro, m.w. = 136,1) dissolvendo 40,8 g di
KH 2 PO 4 in un litro di H 2 O. Diluire 10 mL di 0,3 M di KH 2 PO 4 standard
in 800 mL di acqua. Regolare il pH a 6,3 con 0,1 M di KOH. Diluire
a 1,0 litri.
2. Tampone fosfato salino (PBS) (0,1 M di KH 2 PO 4 , 0,15 M di NaCl, ad
un pH di 7,2 con KOH).
Dissolvere 478 g di cloruro di sodio (NaCl) e 0,1 g di NaN 3 in 500
mL di acqua. Aggiungere 33,3 mL di una soluzione standard 0,3 M
di KH 2 PO 4 . Regolare il pH a 7,2 con un M di KOH. Diluire a un litro
con acqua.
3. 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl) - PBS.
Dissolvere 73,22 g di NaCl in 700 mL di PBS. Diluire a un litro con
PBS e regolare il pH a 7,2. Se uno sfondo alto diventa un problema
si consiglia il seguente tampone al posto di 1,4 M di NaCl - PBS: 5 M
Italiano 1/6

di cloruro di guanidina (GuHCl) - PBS. Dissolvere 478 g di GuHCl
e 8,77 g di NaCl in 700 mL d’acqua. Aggiungere 33,3 mL della
soluzione standard 0,3 M di KH 2 PO 4 e regolare il pH a 7,2. Filtrare
(se necessario) e diluire a 1,0 litri con acqua.
4. 0,005 M di tampone fosfato, ad un pH di 7,2 (un tampone a forza
ionica bassa utilizzato per la liofilizzazione di reagenti bead). Diluire
16,7 mL di soluzione standard 0,3 M di KH 2 PO 4 con 800 mL di acqua.
Regolare il pH a 7,2 con un M di KOH. Diluire a 1,0 litri.
5. 0,005 M di tampone fosfato - 1% di BSA (usato per bloccare ogni
assorbimento non specifico sui reagenti Immunobead finali). Se
la BSA non è desiderata, un reagente simile dev’essere preparato
usando un’altra “portatrice” proteica. Dissolvere 5 g di BSA di alta
qualità (I.S. Cat. #1092) con 500 mL del precedente tampone.
B. Preparazione della matrice Immunobead con
l’Anticorpo Frazione Globulina
1. Le frazioni globuline di antisieri devono essere completamente solubili
in PBS. Centrifugare per rimuovere il materiale insolubile.
2. Usando un valore per OD196 di 14 per globulina di coniglio e di
280
13 per globulina di capra si può determinare la concentrazione
della propria preparazione. Dializzare un volume della propria
preparazione contenente 8 - 10 mg di proteina dal tampone
accoppiato.
Aggiungere la preparazione di anticorpo dializzato, includendo ogni
materiale che precipita nel tampone per l’accoppiamento, ai reagenti
Immunobead.
Se più di un mL di anticorpo dializzato è necessario per ottenere
i richiesti 8 mg di proteina, la sospensione Immunobead deve
essere centrifugata e decantata prima di aggiungere l’anticorpo.
Dopo l’aggiunta della preparazione di anticorpo dializzato, regolare
Italiano 2/6

il volume totale a 20 mL col tampone per l’accoppiamento.
Risospendere i beads e regolare il pH a 6,3 se necessario.
3. Incubare a 4° C per 1 ora.
4. Aggiungere 40,0 mg di EDAC (1-etile-3 [3-dimetetilpropile]
carbidimiide-HCl) alla miscela di reazione. Mescolare vigorosamente
e completamente.
5. Conservare a 4° C per almeno 3 ore. La miscela di reazione può
essere conservata per una notte a questo punto, ma se la propria
proteina non è stabile, centrifugare e lavare almeno una volta con
PBS.
6. Procedere con la procedura di sciacquo (Sezione D).
C. Preparazione di Immunobead con Antisieri Interi
Nota: Questa procedura produce un’attività specifica più bassa
rispetto alla procedura con globulina.
1. Centrifugare 200 µL di antisieri a 5.000 x g per rimuovere il materiale
insolubile.
2. Centrifugare la sospensione Immunobead e gettare il supernatante.
3. Aggiungere 100 µL di antisieri e 6,5 mL del tampone per
l’accoppiamento alla pallottola di Immunobead ottenuta dalla fase
2. Risospendere e mescolare bene.
4. Incubare a 40° C per un’ora.
5. Aggiungere 20,0 mg di EDAC e mescolare vigorosamente.
Conservare a 4°C per almeno 3 ore.
6. Procedere con la sequenza di sciacquo (sezione D).
Italiano 3/6

PREPARAZIONE DEL REAGENTE IMMUNOBEAD
CON ANTISIERI INTERI
µL antisieri/200mg
Titolo degli antisieri* del reagente Immunobead
A:1,000 (A)
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25
>1:100,000 (C) ............................................. 10
* Per antisieri usati in procedure di radioimmunoanalisi il titolo è espresso
come la massima diluizione che permette l’uso di un’aliquota di 100 µL e
produce dati quantitativi. Siccome i reagenti Immunobead si depositano
lentamente sui lunghi periodi, i titoli si devono basare su un’incubazione
di 2 ore a risultati ottimi.
A. Il titolo è troppo basso per essere utile per analisi quantitative. Può
essere utile come tracciante isotopico di cellule.
B. Preparazione di IgG Frazione e procedura d’uso nella Sezione B.
C. Aliquote a partire da 50 µg di reagente Immunobead possono essere
separate quantitivamente e sciacquate, anche se la pallottola è
invisibile. L’Immunobead rabbit globulina gamma o goat globulina
gamma possono essere aggiunte come diluenti per portare la totale
quantità dei reagenti Immunobead fino a 100-200 µg per ottenere
una pallottola facilmente visibile.
D. Sequenza di Sciacquo
Questa sequenza rimuoverà completamente il materiale legato non
covalentemente con una perdita di attività minima. Tutte le fasi
sono importanti e devono essere seguite rigorosamente. I tamponi
devono essere conservati a 4°C. Una volta che la fase ricca di sale
Italiano 4/6

è iniziata, le fasi rimanenti devono essere portate a termine in tempi
brevi.
1. Dividere il materiale in porzioni uguali in tubi centrifughi. E’ necessario
un volume di sciacquo almeno pari a 80 mL/200 mg di reagente
Immunobead.
2. Riempire i tubi a capacità ed equilibrare i tubi con PBS. Centrifugare
ad un minimo di 1.000 x g per almeno 10 minuti.
3. Appena dopo l’arresto della centrifuga, decantare ed eliminare il
supernatante invertendo i tubi completamente.
4. Aggiungere una piccolo volume di PBS ad ogni tubo. Risospendere
la pallottola usando un mescolatore a vortice o mescolando
vigorosamente.
5. Ripetere i punti 2 e 3.
6. Risospendere la pallottola in un piccolo volume di 1,4 M di NaCl-
PBS. Riempire il tubo (tubi) a capacità ed equilibrare con 1,4 M di
NaCl-PBS.
7. Centrifugare a 1.000 x g per 10 minuti.
8. Appena dopo l’arresto della centrifuga, decantare il supernatante
con una singola inversione completa dei tubi. Filtrare brevemente.
9. Ripetere punti 6, 7 e 8.
10. Lavare due volte con PBS. (Ripetere due volte i punti 4, 2 e 3.)
11. Risospendere in PBS e porre su ghiaccio (4°C) per almeno 3 ore
per permettere la completa renaturazione del anticorpo accoppiato.
Italiano 5/6

12. a.) A questo punto, il reagente può essere usato. Sciacquare due
volte come sopra e combinare fino ad un volume totale di 20 mL (10
mg/mL di reagente Immunobead).
OPPURE
b.) In genere è di beneficio far assorbire il reagente finito con BSA
prima dell’uso in un sistema analitico. Sciacquare due volte con
0,005 M di fosfato, ad un pH di 7,2, e risospendere in 0,005 M di
fosfato - 1% di tampone BSA.
13. Il reagente può essere sciacquato centrifugando in altri tamponi
per l’uso. Se conservato non liofilizzato, aggiungere 1 mL di 2%
(2 g/100 mL) di soluzione di NaN 3 come conservante. Il reagente
Immunobead conservato con azotidrato di sodio generalmente è
stabile per almeno 180 giorni a 4°C.
APPLICAZIONI DEL REAGENTE IMMUNOBEAD
FluoroImmunoanalisi 1,2 - da 0,1 a 1,0 mg di reagenti Immunobead
per punto
Tracciante Isotopico di Cellule 3,4 - da 0,1 a 0,2 mg di reagenti
Immunobead per 10 6 cellule
RadioImmunoanalisi 5,6 - da 0,1 a 2,0 mg di reagenti Immunobead per point
PRECAUZIONI E AVVERTIMENTI
Questo dispositivo è previsto per l’uso da parte di personale addestrato
nelle procedure che comprendono le applicazioni indicate per le quali
il dispositivo è previsto.
Immunobead ® è una marca registrata dei laboratori Bio-Rad.
Italiano 6/6

USO PREVISTO
Incluye 200 mg de matriz Immunobead liofilizada con 0.01% NaN 3 . La
rehidratación con 20mL de agua destilada da lugar a una suspensión de
10mg/mL en el tampón de unión recomendado. No congelar después de
la rehidratación. Conserve a 4ºC.
La unión del anticuerpo se lleva a cabo a pH 6.3; sin embargo, la
unión de otros tipos de proteínas se produce a un pH cercano al punto
isoeléctrico de la proteína. Por ejemplo, la albúmina sérica humana
(punto isoeléctrico= 4.8) se une a la matriz Immunobead en un tampón
de piridina 0.01M, pH=4.8. Es muy importante que la unión tenga lugar
en un entorno de baja fuerza iónica (conductividad 1,000 µohms).
INDICACIONES DE USO
A. Tampones
1. Tampón de unión (fosfato 0.003M, pH 6.3)
Prepare una solución stock de fosfato potásico monobase (KH 2 PO 4
anhidro, MW= 136.1) disolviendo 40.8g de KH 2 PO 4 en 1 L de agua.
Diluya 10mL de la solución stock KH 2 PO 4 0.3M en 800 mL de agua.
Ajuste el pH a 6.3 con KOH 0.1M. Enrasar a 1L).
2. Tampón fosfato salino (PBS) (0.01M KH 2 PO 4 , 0.15M NaCl, ajuste a
pH 7.2 con KOH).
Disuelva 478 g de NaCl y 0.1g de NaN 3 en 500mL de agua. Añada
33.3mL de la solución stock 0.3M KH 2 PO 4 . Ajuste el pH a 7.2 con
KOH 1M. Añada agua hasta 1L.
3. Cloruro sódico (NaCl) 1.4M - PBS
Disuelva 73.22g de NaCl en 700mL de PBS. Enrase a 1L con PBS
y ajuste el pH a 7.2.
Si aparecen problemas de fondo por uniones inespecíficas, es
preferible el siguiente tampón en vez del 1.4M NaCl-PBS: 5M
hidrocloruro de guanidina (GuHCl)-PBS.
Español 1/6

Disuelva 478 g de GuHCl y 8.77g NaCl en 700mL de agua. Añada
33.3 mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 y ajuste el pH a 7.2. Filtre (si es
necesario) y enrase a 1L con agua.
4. Tampón fosfato 0.005M, pH 7.2 (un tampón de baja fuerza iónica
utilizado para la liofilización de los reactivos de esferas).
Diluya 16.7mL del stock 0.3M KH 2 PO 4 en 800 mL de agua. Ajuste
el pH a 7.2 con 1M de KOH. Enrase a 1L.
5. Tampón fosfato 0.005M – 1% BSA (utilizado para bloquear cualquier
unión inespecífica con los reactivos Immunobead finales). Si la BSA
no es conveniente, debe preparar otro reactivo similar utilizando
otra proteína “transportadora”. Disuelva 5g de BSA de alta calidad
(IS Nº Cat. 1092) en 500 mL del tampón anterior.
B. Preparación de la Matriz Immunobead con la fracción
de globulinas de los anticuerpos.
1. La fracción de globulinas del antisuero debe ser completamente
soluble en PBS. Centrifugue para eliminar el material insoluble.
2. Utilizando un valor de DO196 de 14 para las globulinas de conejo
280
y de 13 para las de cabra, determine la concentración de su
preparación. Dialice un volumen de su preparación que contenga
8-10mg de proteína contra el tampón de unión.
Añada la preparación dializada del anticuerpo, incluyendo cualquier
material que precipite en el tampón de unión, con los reactivos
Immunobead.
Si se necesita más de 1mL de anticuerpo dializado para conseguir 8
mg de proteína, la suspensión de Immunobead se debe centrifugar
y decantar antes de añadir el anticuerpo. Después de la adición del
anticuerpo dializado, ajuste el volumen total a 20 mL con el tampón
de unión. Resuspenda las esferas y ajuste el pH a 6.3 si fuera
necesario.
Español 2/6

3. Incube a 4º C 1hora.
4. Añada 40.0 mg de EDAC (1-etil-3 [3-dimetilaminopropil] carbodiimida-
HCl) a la mezcla de reacción. Agite fuerte y completamente.
5. Mantenga a 4 ºC al menos 3horas. En este punto la mezcla de
reacción se puede guardar toda la noche, pero si su proteína es
inestable, centrifugue y lave al menos una vez con PBS.
6. Prosiga con el protocolo de lavado (Sección D).
C. Preparación de Immunobead con Antisuero
Completo
Nota: Este protocolo da lugar a una actividad específica inferior a la
del protocolo de las globulinas.
1. Centrifugue 200 µL de antisuero a 5000 x g para eliminar cualquier
material insoluble.
2. Centrifugue la suspensión de Immunobead y descarte el
sobrenadante.
3. Añada 100 µL de antisuero y 6.5 mL de tampón de unión al
precipitado de Immunobead del paso 2. Resuspenda y mezcle bien.
4. Incube a 40ºC 1 hora.
5. Añada 20.0 mg de EDAC y mezcle fuertemente. Mantenga a 4º C
al menos 3 horas.
6. Prosiga con la secuencia de lavado (Sección D).
Español 3/6

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS IMMUNOBEAD
CON ANTISUERO COMPLETO
µL antisuero/200mg
Título del antisuero* Reactivo Immunobead
A:1,000 ......................................................... (A)
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25
>1:100,000 (C) ............................................. 10
*Para antisueros utilizados en técnicas de radioinmunoensayo el título se
expresa como la mayor dilución que permite el uso de alícuotas de 100
µL dando lugar a datos cuantitativos. Dado que en períodos largos los
reactivos Immunobead tienden a precipitar lentamente, los títulos deben
basarse en incubaciones de 2 horas para obtener resultados óptimos.
A. El título es demasiado bajo para análisis cuantitativos. Puede ser
útil para marcaje celular.
B. Preparación de la Fracción IgG y utilización en Sección B.
C. Alícuotas tan pequeñas como 50 µg de reactivos Immunobead se
pueden separar cuantitativamente y lavar, incluso si el precipitado
es invisible. Las Immunobead gamma globulina de conejo o gamma
globulina de cabra se pueden añadir como diluyentes para completar
la cantidad total de reactivos Immunobead hasta 100-200 µg para
obtener un precipitado fácilmente visible.
D. Secuencia de lavado.
Este protocolo elimina completamente el material unido de forma
no covalente con una pérdida mínima de actividad. Todos los pasos
son importantes y se deben seguir estrictamente. Los tampones se
deben conservar a 4ºC. Una vez se ha empezado el paso de alta
Español 4/6

concentración de sales, los pasos siguientes deben llevarse a cabo
hasta el final en el mínimo tiempo posible.
1. Divida el material en partes iguales en tubos de centrífuga. Se
necesita un volumen de lavado de al menos 80mL/200mg de
reactivos Immunobead.
2. Llene los tubos al máximo y equilíbrelos con PBS. Centrifugue
mínimo a 1000 x g durante al menos 10 minutos.
3. Inmediatamente después de la parada de la centrífuga, decante y
descarte el sobrenadante invirtiendo los tubos completamente.
4. Añada un volumen pequeño de PBS a cada tubo. Resuspenda el
precipitado utilizando un vórtex o agitando fuertemente.
5. Repita los pasos 2 y 3.
6. Resuspenda el precipitado en un volumen pequeño de 1.4M NaCl-
PBS. Llene los tubos al máximo y equilibre con 1.4M NaCl-PBS.
7. Centrifugue a 1000 x g 10 minutos.
8. Inmediatamente después de la parada de la centrífuga, el
sobrenadante invirtiendo los tubos una sola vez. Secar ligeramente.
9. Repita los pasos 6, 7 y 8.
10. Lave dos veces con PBS. (Repita dos veces los pasos 4, 2 y 3).
11. Resuspenda en PBS y mantenga en hielo (4ºC) al menos 3 horas
para permitir la renaturalización completa del anticuerpo unido.
12. a) En este punto, el reactivo puede ser utilizado. Lave dos veces
como se indica arriba y combine hasta un volumen final de 20 mL
(10mg/mL de reactivos Immunobead).
O:
Español 5/6

) Normalmente es beneficioso absorber el reactivo final con BSA
antes de ser utilizado en un sistema analítico. Lave dos veces con
fosfato 0.005 M, pH 7.2 y resuspenda en 0.005M fosfato – 1% BSA.
13. El reactivo se puede lavar por centrifugación con otros tampones
para ser utilizado. Si se va a conservar sin liofilización, añada 1mL de
solución NaN 3 2% (2g/100mL) como conservante. Generalmente, los
reactivos Immunobead conservados con azida sódica son estables
al menos durante 180 días a 4ºC.
APLICACIONES DE LOS REACTIVOS IMMUNOBEAD
Fluoroinmunoensayo 1,2 – 0.1 a 1.0 mg de reactivos Immunobead
por punto
Marcaje celular 3,4 - 0.1 a 0.2 mg de reactivos Immunobead por 10 6 células
Radioinmunoensayo 5,6 - 0.1 a 2.0 mg de reactivos Immunobead por punto
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
Este dispositivo debe ser utilizado por personal capacitado en
procedimientos que incluyan la aplicación prevista para el mismo.
Immunobead ® es una marca registrada de Laboratorios Bio-Rad.
Español 6/6

FRANÇAIS
200 mg de matrice Immunobead, fourni lyophilisé et contenant 0,01%
NaN 3 . La réhydratation avec 20 ml d’eau distillée produit une suspension
de 10 mg/mL dans le tampon de couplage recommandé. Ne pas congeler
après réhydratation. Conserver à 4° C.
Le couplage aux anticorps est réalisé à pH 6,3; cependant, le couplage
à d’autres protéines est fait à des pH proches des points isoélectriques
de ces protéines. Par exemple, l’albumine sérique humaine (point
isoélectrique = 4,8) est couplée à la matrice Immunobead dans un tampon
0,01 M pyridine à pH 4,8. Il est très important que le couplage soit fait à
faible force ionique (conductivité 1000 µohms)
INSTRUCTIONS POUR L’EMPLOI
A. Tampons
1. Tampons de couplage (tampon phosphate 0,003M, pH 6,3).
Préparer une solution mère 0,3M de phosphate de potassium
monobasique (KH 2 PO 4 anhydre, poids moléculaire = 136,1) en
dissolvant 40,8g de KH 2 PO 4 dans un litre de H 2 O. Diluer 10 ml de
solution mère KH 2 PO 4 0,3M avec 800 ml d’eau. Ajuster le pH à 6,3
avec du KOH 0,1M. Compléter le volume à 1litre.
2. Tampon phosphate salin (PBS) (0,01M KH 2 PO 4 , 0,15M NaCl, pH 7,2
avec du KOH).
Dissoudre 478g de chlorure de sodium (NaCl) et 0,1g de NaN 3 dans
500 ml d’eau. Ajouter 33,3 ml de solution mère KH 2 PO 4 0,3M. Ajuster
le pH à 7,2 avec du KOH 1M. Compléter le volume à 1,0 litres avec
de l’eau.
3. Chlorure de sodium (NaCl) 1,4M – PBS.
Dissoudre 73,22g de NaCl dans 700 ml PBS. Compléter le volume
à 1,0 litres avec du PBS. Ajuster le pH à 7,2.
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Si le bruit de fond devient un problème, le tampon suivant est suggéré
à la place du NaCl 1,4M –PBS: hydrochlorure de guanidine (GuHCl)
5M -PBS.
Dissoudre 478g de GuHCl et 8,77g de NaCl dans 700 ml d’eau.
Ajouter 33 ml de solution mère KH 2 PO 4 0,3M, ajuster le pH à 7,2.
Filtrer (si nécessaire) et compléter le volume à un litre avec de l’eau.
4. Tampon phosphate 0,005M, pH 7,2 (un tampon à faible force ionique
utilisé pour la lyophilisation des réactifs de billes).
Diluer 16,7 ml de solution mère KH 2 PO 4 0,3M avec 800 ml d’eau.
Ajuster le pH à 7,2 avec du KOH 1M. compléter le volume à 1 litre
avec de l’eau.
. Tampon phosphate 0,005M – 1% BSA (utilisé pour bloquer toute
adsorption non spécifique sur le réactif Immunobead final). Si la BSA
est indésirable, un réactif similaire doit être préparé utilisant une autre
protéine “porteuse”). Dissoudre 5g de BSA de grande qualité (Irvine
Scientific, réf. 1092) dans 500ml du tampon si dessus.
B. Préparation de la matrice Immunobead avec la fraction anticorps
des globulines
1. La fraction globuline de l’antisérum doit être complètement soluble
dans le PBS. Centrifuger pour éliminer tout matériel insoluble.
2. Le rapport de densité optique OD196 est de 13 pour les globulines
280
de lapin et 14 pour les globulines de chèvre. En utilisant ce rapport,
déterminer la concentration des globulines dans votre préparation.
Dialyser un volume de cette préparation contenant 8 à 10 mg de
protéines contre le tampon de couplage.
Ajouter la préparation d’anticorps dialysée (en incluant tout matériel
ayant précipité dans le tampon de couplage) au réactif Immunobead.
Français 2/6

Si plus de 1ml de solution d’anticorps dialysée est nécessaire pour
les 8mg de protéines requis, la suspension Immunobead doit alors
être centrifugée et décantée avant l’addition de l’anticorps. Après
l’addition de la préparation d’anticorps dialysée, ajuster le volume
total à 20 ml en utilisant le tampon de couplage. Resuspendre les
billes et ajuster le pH à 6,3 si nécessaire.
3. Incuber à 4°C pendant une heure.
4. Ajouter 40,0 mg d’EDAC (1-ethyl-3 [3-dimethylaminopropyl]
carbodiimide-HCl) au mélange. Mélanger vigoureusement et
complètement.
5. Garder à 4°C pendant au moins 3 heures. A cette étape de la
réaction, le mélange pourrait être conservé jusqu’au lendemain; mais
si votre protéine est instable, centrifuger et laver au moins une fois
avec du PBS.
6. Laver selon le protocole décrit dans la section D.
C. Préparation d’Immunobead avec l’antisérum total
Remarque: Ce protocol produit une activité spécifique plus faible
que celui avec les globulines.
1. Centrifuger 200 µl d‘antisérum à 5000xg pour éliminer tout matériel
insoluble.
2. Centrifuger la suspension Immunobead et éliminer le surnageant.
3. Ajouter 100 µl d‘antisérum et 6,5 ml de tampon de couplage au culot
Immunoead de l’étape 2. Resuspendre et bien mélanger.
4. Incuber à 40°C pendant une heure.
5. Ajouter 20,0 mg d’EDAC et mélanger vigoureusement. Maintenir à
4°C pendant au moins 3 heures.
Français 3/6

6. Laver selon la séquence de lavage décrite dans la section D.
PRÉPARATION DU RÉACTIF IMMUNOBEAD
AVEC DU SÉRUM ENTIER
µL d’antisérum/200mg
Titre d’antisérum* de réactif Immunobead
A:1,000 ......................................................... (A)
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25
>1:100,000 (C) ............................................. 10
**Pour les antisérums utilisés dans les techniques RIA (radioimmunoassay)
le titre est défini comme étant la plus grande dilution permettant l’utilisation
d’une aliquote de 100 µl pour produire un résultat quantitatif. Comme le
réactif Immunobead se fixe sur une longue période de temps, le titre doit
être basé sur une incubation de deux heures pour un résultat optimal.
A. Titre trop bas pour être utilisé pour une analyse quantitative. Pourrait
être utilisé pour un marquage cellulaire.
B. Préparer une fraction IgG et utiliser le protocole
décrit dans la section B.
C. Des aliquotes aussi petit que 50 µg de réactif Immunobead peuvent
être séparées de façon quantitative et lavées bien que le culot soit
invisible. Les Immunobead-gamma globulines de lapin ou de chèvre
pourraient être rajoutés comme diluants pour amener la quantité
totale du réactif immunobead à 100-200 µg et donner un culot
facilement visible.
D. Séquence de lavage
Français 4/6

Cette séquence éliminera complètement tout matériel non lié de façon
covalente avec une perte d’activité minimale. Toutes les étapes sont
importantes et doivent être suivies rigoureusement. Les tampons
doivent être maintenus à 4°C. Une fois l’étape de haute concentration
en sels a commencé, le reste des étapes doit être achevé dans un
temps minimum.
1. Diviser le matériel en portions égales dans des tubes à centrifugation.
Un volume de lavage d’au moins 80ml/200mg de réactif immunobead
est requis.
2. Remplier les tubes selon leurs capacités et les équilibrer avec du
PBS. Centrifuger à 1000xg au minimum et pendant au moins 10
minutes.
3. Immédiatement après l’arrêt de la centrifugeuse, décanter et éliminer
le surnageant en renversant complètement les tubes.
4. Ajouter un petit volume de PBS à chaque tube. Resuspendre le culot
en utilisant un Vortex ou en mélangeant vigoureusement.
5. Répéter les étapes 2 et 3.
6. Resuspendre le culot dans un petit volume de tampon NaCl 1,4M
-PBS. Remplier les tubes selon leurs capacités et les équilibrer avec
du NaCl 1,4M -PBS.
7. Centrifuger à 1000xg pendant 10 minutes.
8. Immédiatement après l’arrêt de la centrifugeuse, décanter le
surnageant avec une seule inversion complète des tubes. Assécher
brièvement.
9. Répéter les étapes 6, 7 et 8.
10. Laver deux fois avec du PBS. (Répéter deux fois les étapes 4, 2 et
3).
Français 5/6

11. Resuspendre dans du PBS et laisser reposer dans de la glace (4°C)
pendant au moins 3 heures pour permettre la “renaturation” totale
des anticorps liés.
12. a.) A ce point, le réactif pourrait être utilisé. Laver deux fois comme
indiqué si-dessus et combiner pour un volume final de 20ml (10mg/
ml de réactif Immunobead).
OU
b.) Il est bénéfique d’incuber le réactif final avec du BSA avant son
utilisation dans un système analytique. Laver deux fois avec du
tampon phosphate 0,005M, pH 7,2 contenant 1% BSA.
13. Le réactif pourrait être lavé par centrifugation avec d’autres tampons
avant son utilisation. S’il le réactif est conservé sans lyophilisation,
ajouter 1 ml d’une solution de 2% NaN3 (2g/100ml) comme
conservateur. Le réactif immunobead conservé avec de l’azoture
de sodium est généralement stable pendant au moins 180 jours à
4°C.
APPLICATIONS OF IMMUNOBEAD REAGENT
Fluorolmmunoassay 1,2 – 0.1 to 1.0 mg de réactif Immunobead par point
Marquage cellulaire 3,4 – 0.1 to 0.2 mg de réactif Immunobead per 10 6 cells
Radiolmmunoassay 5,6 – 0.1 to 2.0 mg de réactif Immunobead per point
PRÉCAUTION ET MISE EN GARDE
Ce dispositif est destiné à une utilisation par un personnel formé aux
procédures comprenant l’application indiquée pour laquelle le dispositif
est destiné.
Immunobead ® est une marque déposée des laboratoires Bio-Rad.
Français 6/6

APLICAÇÃO
Dispõe-se de 200 mg de matriz de imunoesferas liofilizada e com
0.01% de NaN 3 . A re-hidratação com 20 mL de água destilada produz
uma suspensão de 10 mg/mL no tampão de ligação recomendado. Não
refrigerar depois da re-hidratação . Conservar a 4°C.
A ligação de anticorpos é feita a pH 6.3; Não obstante, a ligação de outros
tipos de proteínas é feita a um pH próximo ao ponto isoeléctrico das
proteínas. Por exemplo, a albumina do soro humano (ponto isoeléctrico
=4.8) é ligada à matriz de imunoesferas num tampão de 0.001M de
pirimidina, pH 4.8. Isto é essencial, pois que a ligação será realizada a
uma baixa força iónica. (condutividade 1,000 µohms).
INSTRUÇÕES DE USO
A. Tampões
1. Tampão de ligação (0.003 M fosfato, pH 6.3).
Prepare uma solução stock de 0.3 M de fosfato potássio monobásico
(KH 2 PO 4 anidro, m.w. = 136.1) dissolvendo 40.8 g de KH 2 PO 4 em
1lt de H 2 O. Dilua 10mL stock 0.3 M KH 2 PO 4 com 800 mL de água.
Ajuste o pH a 6.3 com 0.1 M KOH. Diluir a 1.0 litro.
2. Tampão salino de Fosfato (PBS) (0.01 M KH 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, pH
7.2 com KOH).
Dissolva 478 g de cloreto de sódio (NaCl) e 0.1 g NaN 3 em 500 mL
de água. Adicionar 33.3 mL de solução stock 0.3 M KH 2 PO 4 . Ajustar
o pH 7.2 com 1 M KOH. Diluir a 1.0 litro com água
3. 1.4 M cloreto de sódio (NaCl) – PBS.
Dissolva 73.22 g NaCl em 700 mL PBS. Dilua a 1.0 litro com PBS
e ajuste o pH a 7.2.
Se factos anteriores importantes constituem um problema, sugerese
o uso do seguinte tampão em lugar do 1.4 M NaCl – PBS: 5M
Português 1/6

Cloridrato guanidina(GuHCl) – PBS.
Dissolva 478 g GuHCl e 8.77 g NaCl em 700 mL de água. Adicione
33.3 mL de stock 0.3 M KH 2 PO 4 e ajuste a pH 7.2. Filtrar (se
necessário) e diluir a 1.0 litro com água.
4. Tampão de fosfato 0.005 M, pH 7.2 ( é utilizado um tampão de baixa
força iónica para a liofilização das gotas de reagentes).
Diluir 16.7 mL de stock 0.3 M KH 2 PO 4 com 800 mL de água. Ajustar
o pH 7.2 com 1 M KOH. Diluir a 1.0 litro
5. 0.005 M tampão de fosfato– 1% BSA (usado para impedir alguma
absorção não especifica sobre os reagentes Immunobead finais).
Se o BSA é indesejado, um reagente similar deve ser preparado
usando outro transportador de proteínas). Dissolva 5 g de BSA de
alta qualidade (I.S. Cat #1092) em 500 mL do tampão utilizado.
B. Preparação da Matriz Immunobead com anticorpos
de fracções de Globulina
1. Fracções de Globulina de antisoros devem ser completamente
solúveis em PBS. Centrifugue para remover material insolúvel.
2. Usando um valor de OD196 de 14 para Globulina de Coelho e para
280
Globulina de Cabra, determine a concentração da sua preparação.
Dialize um volume da sua preparação contendo 8-10 mg de proteína
contra um Tampão de ligação.
Adicione a preparação de anticorpos dializada, incluindo qualquer
material que precipite no tampão de ligação, aos reagentes
Immunobead.
Se forem requeridos mais de 1 mL de anticorpos dializados
para completar o requisito de 8mg de proteína, a suspensão
deimunoesferas deve ser centrifugada e decantada antes da adição
Português 2/6

de anticorpos. Depois da adição da preparação de anticorpos
dializados, ajustar o volume total a 20 mL com o tampão de ligação.
Ressuspender as gotas e ajustar ao pH de 6.3, se necessário.
3. Incube a 4°C por 1 hora.
4. Adicione 40.0 mg EDAC (1-etil-3 [3-dimetilaminopropil] carbodiimida
HCl) a mistura de reacção. Misturar muito bem e vigorosamente.
5. Conservar a 4° C por pelo menos 3 horas. A mistura da reacção
pode guardar-se durante a noite tal qual está, mas se a proteína é
instável centrifugue e lave pelo menos uma vez com PBS.
6. Siga com os procedimentos de lavagem (Secção D).
C. Preparação de Imunoesferas com Antisoro intacto
Nota: Este procedimento produz uma actividade especifica menor
que o procedimento da Globulina
1. Centrifugue 200 µL de antisoro a 5,000 x g para remover qualquer
material insolúvel.
2. Centrifugue a suspensão de imunoesferas e descarte o
sobrenadante.
3. Adicione 100 µL de antisoro e 6.5 mL de tampão de ligação ao pellet
de imunoesferas do passo 2. Ressuspender e agitar muito bem.
4. Incube a 40° C por 1 hora.
5. Adicione 20.0 mg EDAC e agite vigorosamente. Conserve a 4° C
por pelo menos 3 horas.
6. Continue com a sequência de lavagem (Secção D).
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PREPARAÇÃO DO REAGENTE IMMUNOBEAD
COM ANTISORO INTACTO
µL antisoro/200mg
Antisoro titulado* Reagente Immunobead
A:1,000 ......................................................... (A)
1:1,000-1:5,000 ............................................ (B)
1:5,000-1:20,000 ......................................... 100
1:20,000-1:40,000 ........................................ 50
1:40,000-1:100,000 ...................................... 25
>1:100,000 (C) ............................................. 10
*Para antisoro usado em procedimentos de radioimunoensaio , o título
é expresso como a maior diluição que permite o uso duma alíquota de
100 µL e que produz dados quantitativos. Sempre que os reagentes
Immunobead sejam suavemente mantidos em repouso por períodos
longos, os títulos deverão implicar uma incubação de aproximadamente
2 horas para obter bons resultados.
A. Titulo é demasiado baixo para ser usado em análises quantitativas.
Pode ser usado para marcação de células..
B. Preparação da Fracção lgG . Use os procedimentos da secção B
C. Alíquotas tão pequenas como 50 µg de reagentes Immunobead
podem ser separadas quantitativamente e lavadas, embora o pellet
é invisível. Gama Globulinas de coelho Immunobead ou Gama
-globulina de cabra podem ser adicionadas como diluentes para
levar a quantidade total de reagentes Immunobead até 100-200 µg
para permitir um pellet facilmente visível.
D. Sequência de lavagem
Esta sequência removerá completamente o material não ligado
covalentemente, com um mínimo de perda de actividade. Todos
os passos são importantes e devem ser seguidos rigorosamente.
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Os tampões devem ser conservados a a 4° C. Uma vez começado
o high salt step, os restantes passos devem ser completados no
mínimo de tempo.
1. Divida o material colocando quantidades iguais em tubos de
centrifuga . Requer-se de um volume de pelo menos 80 mL/200
mg de reagente Immunobead para a lavagem
2. Encha os tubos na sua capacidade e equilibre os mesmos com PBS.
Centrifugue a um mínimo de 1,000 x g pelo menos, por 10 minutos.
3. Imediatamente depois da centrifuga parar, decante e descarte o
sobrenadante mediante a inversão completa dos tubos.
4. Adicione um pequeno volume de PBS a cada tubo. Ressuspenda
o pellet usando um agitador vortex ou agitador vigoroso.
5. Repita os passos 2 e 3.
6. Resuspenda o pellet num pequeno volume de 1.4 M NaCl-PBS.
Encha os tubos na sua capacidade e equilibre com 1.4 M NaCl-PBS.
7. Centrifugue a 1,000 x g por 10 minutos.
8. Imediatamente depois da centrifuga parar, decante o sobrenadante
com uma única e completa inversão dos tubos. Seque brevemente.
9. Repita os passos 6, 7, e 8.
10. Lave duas vezes com PBS. (Repita duas vezes os passos 4, 2, e
3.)
11. Ressuspenda em PBS e deixe repousar sobre gelo (4°C) pelo menos
por 3 horas para permitir completar a renaturação dos anticorpos
de ligação
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12. a.) Nesta altura , o reagente pode ser usado. Lave duas vezes como
indicado anteriormente e leve a um volume final de 20 mL (10 mg/
mL de reagente Immunobead).
OU
b.) Frequentemente é conveniente absorver o reagente final com
BSA antes de usar –se um sistema analítico. Lave duas vezes
com 0.005 M de fosfato, pH 7.2, e deixe repousar em 0.005 M de
fosfato – 1% tampão BSA .
O reagente pode ser lavado por centrifugação dentro de outros
tampões para uso. Se é conservado sem liofilização, adicione 1 mL
of 2% (2 g/100 mL) de solução NaN 3 como conservante. Reagentes
Immunobead conservados com azida sódica são geralmente
estáveis por pelo menos 180 dias a 4°C.
APLICAÇÕES DOS REAGENTES DE IMMUNOBEAD
Fluorolmunoensaio 1,2 – 0.1 a 1.0 mg reagentes Imunobead por ponto
Marcação de células 3,4 – 0.1a 0.2 mg reagentes Immunobead por
10 6 células
Radiolmunoensaio 5,6 – 0.1 ao 2.0 mg reagentes Imunobead por ponto
PRECAUÇÕES E AVISOS
Este dispositivo deve ser utilizado por funcionários treinados em
procedimentos aos quais se destina.
Immunobead ® é uma marca comercial registada dos Laboratórios
Bio-Rad.
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REFERENCES
1. Burgett, M. W. et al., “Fluorescent Immunoassay for the Quantitation
of C 4 Complement,” J. Immunol. Methods, 16, 211 (1977).
2. Burgett, M. W. et al, “Fluorescent Immunoassay for the Quantitation
of C3 Complement,” Clin. Chim. Acta 78,277 (1977).
3. Chao, W. and Yokoyama, M., “Determination of B Lympocyte
Population, “Clin. Chim. Acta, 78, 79 (1977).
4. Ammann, A. J., Borg, D., Kondo, L. and Ward, D. W. J. Immunol.
Methods, 17, 365 (1977).
5. Cheung, A. H., et al., “Direct Solid Phase Radioimmunoassay for
Chicken Lipoprotein Lipase, “Anal. Biochem, 94, 346(1979).
6. Langone, J. J., “A Solid-Phase Immunoassay for Human Immunoglobulin
E: Use of 125 l-Labeled Protein A as the Tracer” Anal.
Biochem, 93, 207 (1979).
Immunobead ® is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories.
Immunobead ® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Bio-Rad
Laboratories.
Immunobead ® è una marca registrata dei laboratori Bio-Rad.
Immunobead ® es una marca registrada de Laboratorios Bio-Rad.
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