Descargar Catálogo Preparación de Muestras - Grupo BioMaster

FiltRación caPtiVa
método de análisis
Preparación de muestras
A) Se usó una solución tensioactiva (Triton X-100 al 0,002%)
para preparar una solución de perlas de látex al 0,05% (0,3
µm y 0,5 µm).
B) Se usó una solución de perlas de látex (0,3 µm) para la
prueba de vida útil de la columna de menos de 2 µm.
Se usaron muestras sin filtrar y muestras filtradas (con
filtros de 0,2 µm) para comparar el efecto en la vida útil
de la columna de menos de 2 µm.
C) El extracto de plasma humano se usó para la prueba de
vida útil de la columna de menos de 2 µm. Se usaron
muestras sin filtrar, centrifugadas y filtradas (con filtros
de 0,2 µm) para comparar el efecto en la vida útil de la
columna de menos de 2 µm. La muestra se preparó
mediante los siguientes pasos.
1. Se vertieron 2 ml de plasma humano en un tubo de ensayo.
2. Se añadieron 10 ml de acetonitrilo con ácido acético al 1%.
3. La muestra se agitó enérgicamente en el vórtex y, a
continuación, se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos.
4. El sobrenadante se transfirió a un tubo de ensayo limpio.
5. El sobrenadante se secó con flujo de N 2
a 37 °C.
6. La muestra seca se reconstituyó con 10:90 de MeOH/H 2
Om,
mezclada en el vórtex y con aplicación de un baño de
ultrasonidos.
Filtración
La solución se pasó a través de cada uno de los filtros de
jeringa y se recogió un filtrado de 1 ml en un vial de 2 ml
para el análisis HPLC.
Resultados: efecto de la filtración en la columna a de menos de 2 µm
con una solución de perlas de látex de 0,3 µm
efecto de la filtración en la vida útil de la columna de menos de 2 µm
Retropresión de columna (bares)
1200
1000
800
600
400
200
Perlas de látex sin filtrar 3
Perlas de látex sin filtrar 3
Filtro de nailon Agilent Captiva de 0,2 µm
Filtro RC Agilent Captiva de 0,2 µm
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Número de inyecciones de la muestra de perlas de látex de 0,3 µm sin filtrar o filtrada (0,05%)
Resultados: efecto de la filtración en la columna b de menos de 2 µm
con un extracto de precipitación de proteínas de plasma humano
efecto de la filtración en la vida útil de la columna de menos de 2 µm
Instrumentos UHPLC (para la prueba de vida útil
de la columna de menos de 2 µm)
columna: agilent zoRbax RRHd eclipse
Plus c18, 2,1 x 50 mm, 1,8 µm,
n.º de referencia 959757-902
La columna se desconectó del detector
y se realizó un ciclo de drenaje.
Fase móvil: Acetonitrilo:agua (35:65, v/v)
Velocidad de flujo: 0,4 ml/min, modo isocrático
inyecciones: 10 µl por inyección, 1 inyección po minuto
monitorización: Se registró la retropresión de la columna
junto con el número de inyecciones.
Fallo de la columna: En caso de retropresión de la columna
superior a 1000 bares.
Serie: Normalmente, se usó una serie de 1000
inyecciones, excepto en caso de fallo de
la columna durante el procedimiento
debido a la alta presión. Se usó una
columna nueva para cada serie individual.
Retropresión de columna (bares)
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Número de inyecciones del extracto de precipitación de proteínas de plasma humano sin
filtrar, centrifugado y filtrado
conclusión
Extracto de plasma sin filtrar
Extracto de plasma filtrado, 0,2 µm (con filtros Agilent
Captiva de 0,2 µm)
Extracto de plasma centrifugado
Se ha demostrado que la filtración de muestras antes de su introducción en el sistema
HPLC aumenta considerablemente la vida útil de la columna.
www.agilent.com/cHem/SamPlePReP 117