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FiltRación caPtiVa Efecto de la filtración en la vida útil de la columna LC importancia de la filtración La obstrucción de la columna es la causa más frecuente de fallos de la columna según los cromatógrafos. La inyección de muestras que contienen partículas, aunque sea en cantidades mínimas, obstruye el inyector de la columna, lo que provoca un nivel alto de retropresión, un cambio del tiempo de retención, la pérdida de resolución y la consiguiente reducción de la vida útil de la columna. Estos efectos se pueden intensificar en el caso de las columnas de menos de 2 µm. Dado que estas columnas con un tamaño de partícula inferior se suelen usar con un alto nivel de presión, son más sensibles al aumento de presión provocado por la acumulación de partículas en la columna. El objetivo de este análisis es demostrar que la filtración de las muestras prolonga la vida útil, no solo de las columnas LC convencionales con filtros de 0,45 µm, sino también de las columnas LC de menos de 2 µm con filtros de 0,2 µm. Para establecer la correlación entre la prolongación de la vida útil y la aplicación real, se compararon los extractos de plasma obtenidos mediante la precipitación de proteínas con muestras sin filtración, las muestras con centrifugación y las muestras con filtración. 116
FiltRación caPtiVa método de análisis Preparación de muestras A) Se usó una solución tensioactiva (Triton X-100 al 0,002%) para preparar una solución de perlas de látex al 0,05% (0,3 µm y 0,5 µm). B) Se usó una solución de perlas de látex (0,3 µm) para la prueba de vida útil de la columna de menos de 2 µm. Se usaron muestras sin filtrar y muestras filtradas (con filtros de 0,2 µm) para comparar el efecto en la vida útil de la columna de menos de 2 µm. C) El extracto de plasma humano se usó para la prueba de vida útil de la columna de menos de 2 µm. Se usaron muestras sin filtrar, centrifugadas y filtradas (con filtros de 0,2 µm) para comparar el efecto en la vida útil de la columna de menos de 2 µm. La muestra se preparó mediante los siguientes pasos. 1. Se vertieron 2 ml de plasma humano en un tubo de ensayo. 2. Se añadieron 10 ml de acetonitrilo con ácido acético al 1%. 3. La muestra se agitó enérgicamente en el vórtex y, a continuación, se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. 4. El sobrenadante se transfirió a un tubo de ensayo limpio. 5. El sobrenadante se secó con flujo de N 2 a 37 °C. 6. La muestra seca se reconstituyó con 10:90 de MeOH/H 2 Om, mezclada en el vórtex y con aplicación de un baño de ultrasonidos. Filtración La solución se pasó a través de cada uno de los filtros de jeringa y se recogió un filtrado de 1 ml en un vial de 2 ml para el análisis HPLC. Resultados: efecto de la filtración en la columna a de menos de 2 µm con una solución de perlas de látex de 0,3 µm efecto de la filtración en la vida útil de la columna de menos de 2 µm Retropresión de columna (bares) 1200 1000 800 600 400 200 Perlas de látex sin filtrar 3 Perlas de látex sin filtrar 3 Filtro de nailon Agilent Captiva de 0,2 µm Filtro RC Agilent Captiva de 0,2 µm 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Número de inyecciones de la muestra de perlas de látex de 0,3 µm sin filtrar o filtrada (0,05%) Resultados: efecto de la filtración en la columna b de menos de 2 µm con un extracto de precipitación de proteínas de plasma humano efecto de la filtración en la vida útil de la columna de menos de 2 µm Instrumentos UHPLC (para la prueba de vida útil de la columna de menos de 2 µm) columna: agilent zoRbax RRHd eclipse Plus c18, 2,1 x 50 mm, 1,8 µm, n.º de referencia 959757-902 La columna se desconectó del detector y se realizó un ciclo de drenaje. Fase móvil: Acetonitrilo:agua (35:65, v/v) Velocidad de flujo: 0,4 ml/min, modo isocrático inyecciones: 10 µl por inyección, 1 inyección po minuto monitorización: Se registró la retropresión de la columna junto con el número de inyecciones. Fallo de la columna: En caso de retropresión de la columna superior a 1000 bares. Serie: Normalmente, se usó una serie de 1000 inyecciones, excepto en caso de fallo de la columna durante el procedimiento debido a la alta presión. Se usó una columna nueva para cada serie individual. Retropresión de columna (bares) 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Número de inyecciones del extracto de precipitación de proteínas de plasma humano sin filtrar, centrifugado y filtrado conclusión Extracto de plasma sin filtrar Extracto de plasma filtrado, 0,2 µm (con filtros Agilent Captiva de 0,2 µm) Extracto de plasma centrifugado Se ha demostrado que la filtración de muestras antes de su introducción en el sistema HPLC aumenta considerablemente la vida útil de la columna. www.agilent.com/cHem/SamPlePReP 117
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FiltRación caPtiVa<br />
Efecto <strong>de</strong> la filtración en la vida útil <strong>de</strong> la<br />
columna LC<br />
importancia <strong>de</strong> la filtración<br />
La obstrucción <strong>de</strong> la columna es la causa más frecuente <strong>de</strong> fallos <strong>de</strong> la columna según los cromatógrafos.<br />
La inyección <strong>de</strong> muestras que contienen partículas, aunque sea en cantida<strong>de</strong>s mínimas, obstruye el inyector<br />
<strong>de</strong> la columna, lo que provoca un nivel alto <strong>de</strong> retropresión, un cambio <strong>de</strong>l tiempo <strong>de</strong> retención, la pérdida<br />
<strong>de</strong> resolución y la consiguiente reducción <strong>de</strong> la vida útil <strong>de</strong> la columna. Estos efectos se pue<strong>de</strong>n intensificar<br />
en el caso <strong>de</strong> las columnas <strong>de</strong> menos <strong>de</strong> 2 µm. Dado que estas columnas con un tamaño <strong>de</strong> partícula<br />
inferior se suelen usar con un alto nivel <strong>de</strong> presión, son más sensibles al aumento <strong>de</strong> presión provocado por<br />
la acumulación <strong>de</strong> partículas en la columna.<br />
El objetivo <strong>de</strong> este análisis es <strong>de</strong>mostrar que la filtración <strong>de</strong> las muestras prolonga la vida útil, no solo <strong>de</strong> las<br />
columnas LC convencionales con filtros <strong>de</strong> 0,45 µm, sino también <strong>de</strong> las columnas LC <strong>de</strong> menos <strong>de</strong> 2 µm con<br />
filtros <strong>de</strong> 0,2 µm. Para establecer la correlación entre la prolongación <strong>de</strong> la vida útil y la aplicación real, se<br />
compararon los extractos <strong>de</strong> plasma obtenidos mediante la precipitación <strong>de</strong> proteínas con muestras sin<br />
filtración, las muestras con centrifugación y las muestras con filtración.<br />
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