Comunidades microbianas presentes en la hojarasca a diferentes ...
Comunidades microbianas presentes en la hojarasca a diferentes ...
Comunidades microbianas presentes en la hojarasca a diferentes ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
UNIVERSIDAD DEL TURABO<br />
COMUNIDADES MICROBIANAS PRESENTES EN LA HOJARASCA A<br />
DIFERENTES ESTADOS DE DESCOMPOSICIÓN CON O SIN LA ABERTURA DEL<br />
DOSEL Y LA DEPOSICIÓN DEL DETRITO<br />
Por<br />
María L. Ortiz Hernández<br />
B.S., Ci<strong>en</strong>cias Naturales, Universidad de Puerto Rico <strong>en</strong> Río Piedras<br />
TESIS<br />
Escue<strong>la</strong> de Ci<strong>en</strong>cias y Tecnología<br />
Universidad del Turabo<br />
Requisito parcial para el grado de<br />
Maestría <strong>en</strong> Ci<strong>en</strong>cias Ambi<strong>en</strong>tales<br />
Con Especialidad <strong>en</strong> Manejo Ambi<strong>en</strong>tal<br />
Gurabo, Puerto Rico<br />
mayo, 2008
© Copyright 2008<br />
María L. Ortiz Hernández. All Rights Reserved.
Dedicatoria<br />
Dedico este trabajo de investigación primeram<strong>en</strong>te a DIOS y a mi mayor tesoro:<br />
mi familia. Porque siempre han estado a mi <strong>la</strong>do apoyándome <strong>en</strong> los mom<strong>en</strong>tos o<br />
situaciones que me hacían f<strong>la</strong>quear. Jean Carlos, Carlos Javier y Kar<strong>la</strong> Michelle ustedes<br />
son mi fu<strong>en</strong>te de motivación e inspiración para cada día seguir superándome. Carlos,<br />
amado esposo, gracias por escoger estar a mi <strong>la</strong>do y por brindarme el espacio y <strong>la</strong> fuerza<br />
que me han permitido culminar este gran reto. A mis padres, Rogelio y Monserrate,<br />
porque me <strong>en</strong>señaron que <strong>en</strong> <strong>la</strong> vida hay que luchar con empeño para lograr nuestros<br />
sueños. A mi nieto Adrián Alexander y a mi futura nieta Ariana Michelle, gracias por<br />
brindarle ternura y <strong>en</strong>ergía a mi vida. Este logro se lo dedico, especialm<strong>en</strong>te, a todos<br />
ustedes.<br />
iii
Agradecimi<strong>en</strong>to<br />
Siempre he p<strong>en</strong>sado que Dios pone <strong>en</strong> nuestro camino a personas que de una<br />
forma u otra han de impactar nuestras vidas. Durante esta investigación hubo muchas<br />
personas que co<strong>la</strong>boraron conmigo. En primer lugar, quiero agradecer de manera muy<br />
especial a <strong>la</strong> Profesora Sharon Cantrell <strong>la</strong> confianza que tuvo <strong>en</strong> mí al escogerme para<br />
realizar esta investigación. Usted ha sido mi guía y asesora, <strong>la</strong> persona que ha estado<br />
durante estos años brindándome su apoyo y conocimi<strong>en</strong>to para que hoy pueda culminar<br />
con este gran reto. Gracias por su paci<strong>en</strong>cia y dedicación. También quiero agradecer de<br />
manera especial el asesorami<strong>en</strong>to, <strong>la</strong>s recom<strong>en</strong>daciones y el apoyo del Profesor José<br />
Pérez y <strong>la</strong> Dra. Deborah J. Logde.<br />
Mi agradecimi<strong>en</strong>to especial al “Luquillo Long Term Ecological Research” por<br />
proporcionarnos <strong>la</strong> asist<strong>en</strong>cia técnica y al “Institute for Tropical Ecology Study” por<br />
proveernos <strong>la</strong>s facilidades y los recursos económicos que nos permitieron llevar a cabo<br />
este estudio.<br />
Agradezco a Francisco Rivera, Zulma Ortiz, C<strong>la</strong>ribel Báez, Albany Agues<br />
Marchetti y a Carlos Cruz <strong>la</strong> ayuda que me brindaron <strong>en</strong> <strong>la</strong>s tareas realizadas <strong>en</strong> el<br />
<strong>la</strong>boratorio. Gracias por su ayuda incondicional.<br />
Finalm<strong>en</strong>te, agradezco a mis familiares, amistades y a todos aquellos que dieron<br />
de su conocimi<strong>en</strong>to, tiempo, y dedicación para que esta investigación se realizara.<br />
Gracias por su apoyo.<br />
iv
Tab<strong>la</strong> de cont<strong>en</strong>ido<br />
página<br />
Lista de Tab<strong>la</strong>s ..................................................................................................................vii<br />
Lista de Figuras ................................................................................................................viii<br />
Tab<strong>la</strong> de Apéndices ............................................................................................................ xi<br />
Abstract .............................................................................................................................xii<br />
Resum<strong>en</strong>...........................................................................................................................xiii<br />
Capítulo Uno Introducción.................................................................................................. 1<br />
Justificación............................................................................................................. 1<br />
Metas y Objetivos.................................................................................................... 3<br />
Hipótesis.................................................................................................................. 4<br />
Capítulo Dos Revisión de Literatura................................................................................... 8<br />
Capítulo Tres Metodología................................................................................................ 22<br />
Descripción del lugar de estudio ........................................................................... 22<br />
Diseño experim<strong>en</strong>tal.............................................................................................. 24<br />
Procedimi<strong>en</strong>to para <strong>la</strong> colección y manejo de muestras........................................ 28<br />
Extracción de ADN ............................................................................................... 28<br />
Amplificación del ADN ........................................................................................ 28<br />
Comparar estructura y estimar diversidad............................................................. 29<br />
v
página<br />
Análisis estadísticos .............................................................................................. 29<br />
Capítulo Cuatro Resultados .............................................................................................. 30<br />
Resultados de <strong>la</strong> investigación .............................................................................. 30<br />
Capítulo Cinco Discusión.................................................................................................. 76<br />
Literatura Citada................................................................................................................ 81<br />
Apéndices.......................................................................................................................... 85<br />
vi
Lista de Tab<strong>la</strong>s<br />
página<br />
Tab<strong>la</strong> 4.01. Muestras colectadas durante los intervalos de muestreo.............................. 31<br />
Tab<strong>la</strong> 4.02. Amplificación de ADN ................................................................................ 32<br />
Tab<strong>la</strong> 4.03. Promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> los Bloques A, B y C de acuerdo<br />
al tratami<strong>en</strong>to aplicado y al tiempo de muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de<br />
<strong>hojarasca</strong> fresca ............................................................................................ 34<br />
Tab<strong>la</strong> 4.04. Promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> los Bloques A, B y C de acuerdo<br />
al tratami<strong>en</strong>to aplicado y al tiempo de muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de<br />
hojas verdes.................................................................................................. 36<br />
Tab<strong>la</strong> 4.05. Resultados del análisis estadístico “Two-Way ANOVA” del ADN<br />
(µg/ml) versus el tratami<strong>en</strong>to aplicado y el tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas<br />
verdes y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca ..................................................................... 40<br />
Tab<strong>la</strong> 4.06. Re<strong>la</strong>ción <strong>en</strong>tre el número de filotipos de hongos y el número de<br />
filotipos de bacterias versus el % de humedad de acuerdo al<br />
tratami<strong>en</strong>to aplicado <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca ................................ 46<br />
Tab<strong>la</strong> 4.07. Resultados del análisis estadístico “ANOVA” al aplicar <strong>la</strong> técnica<br />
TRFLP <strong>en</strong> hongos versus el tratami<strong>en</strong>to aplicado y el tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s<br />
hojas verdes y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca............................................................ 50<br />
Tab<strong>la</strong> 4.08. Resultados del análisis estadístico “ANOVA” al aplicar <strong>la</strong> técnica<br />
TRFLP <strong>en</strong> bacterias versus el tratami<strong>en</strong>to aplicado y el tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s<br />
hojas verdes y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca............................................................ 51<br />
Tab<strong>la</strong> 4.09. Por ci<strong>en</strong>to (%) de masa reman<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los Bloques A, B y C de<br />
acuerdo al tratami<strong>en</strong>to aplicado y al tiempo de muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca .......................................................................... 52<br />
vii
Lista de Figuras<br />
página<br />
Figura 3.01. Mapa del área este de Puerto Rico ............................................................ 23<br />
Figura 3.02. Mapa topográfico del área de estudio <strong>en</strong> <strong>la</strong> Estación El Verde................. 24<br />
Figura 3.03.<br />
Mapa del área de estudio <strong>en</strong> el Bosque Experim<strong>en</strong>tal de Luquillo,<br />
Estación El Verde...................................................................................... 25<br />
Figura 3.04. Diagrama de <strong>la</strong> canasta de descomposición .............................................. 26<br />
Figura 3.05.<br />
Figura 4.01.<br />
Figura 4.02.<br />
Figura 4.03.<br />
Figura 4.04.<br />
Figura 4.05.<br />
Figura 4.06.<br />
Figura 4.07.<br />
Remoción de <strong>la</strong> canasta de descomposición <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s<br />
31 semanas ................................................................................................ 27<br />
Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong><br />
fresca de acuerdo al tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado .............................. 38<br />
Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas<br />
verdes de acuerdo al tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado ............................. 39<br />
Diversidad de bacterias y hongos <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de<br />
<strong>hojarasca</strong> fresca de acuerdo al tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado y<br />
basados <strong>en</strong> el TRFLP................................................................................. 43<br />
Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de<br />
filotipos de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to poda del dosel sin adición del<br />
detrito <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55<br />
semanas ..................................................................................................... 44<br />
Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de<br />
filotipos de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to control <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca<br />
<strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas............................................. 44<br />
Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de<br />
filotipos de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to no poda del dosel más adición<br />
del detrito <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y<br />
55 semanas ................................................................................................ 45<br />
Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de<br />
filotipos de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to poda del dosel más adición<br />
del detrito <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y<br />
55 semanas ................................................................................................ 45<br />
viii
Figura 4.08.<br />
Figura 4.09.<br />
Figura 4.10.<br />
Figura 4.11.<br />
Figura 4.12.<br />
Figura 4.13.<br />
Figura 4.14.<br />
Figura 4.15.<br />
Figura 4.16.<br />
Figura 4.17.<br />
Razón del número de filotipos de hongos <strong>en</strong>tre el número de<br />
filotipos de bacterias versus el por ci<strong>en</strong>to de humedad <strong>en</strong>contrada<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas.......... 47<br />
Diversidad de bacterias y hongos <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de hojas<br />
verdes de acuerdo al tiempo y tratami<strong>en</strong>to aplicado y basados <strong>en</strong> el<br />
TRFLP....................................................................................................... 49<br />
ADN total extraído de 0.3 g de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 17, 31 y<br />
55 semanas y el por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te......................................... 53<br />
C<strong>la</strong>dograma del TRFLP del “pool” de <strong>la</strong>s muestras que dieron<br />
positivo al PCR mostrando <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad de<br />
bacterias y hongos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de hojas y<br />
<strong>en</strong> los tratami<strong>en</strong>tos aplicados..................................................................... 56<br />
Perfil de TRFLP de muestras de bacterias de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong><br />
el bloque (A) a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to control a través<br />
del tiempo.................................................................................................. 58<br />
Perfil de TRFLP de muestras de hongos de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> el<br />
bloque (A) a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to control a través del<br />
tiempo........................................................................................................ 59<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no poda más adición de detrito<br />
<strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas .............................................................. 62<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no poda más adición de detrito<br />
<strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas .............................................................. 63<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no poda más adición de detrito<br />
<strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas .............................................................. 64<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no poda más adición de detrito<br />
<strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas .............................................................. 65<br />
ix
Figura 4.18.<br />
Figura 4.19.<br />
Figura 4.20.<br />
Figura 4.21.<br />
Figura 4.22.<br />
Figura 4.23.<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda más adición de detrito <strong>en</strong><br />
el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas................................................................... 67<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda más adición de detrito <strong>en</strong><br />
el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas................................................................... 68<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda más adición de detrito <strong>en</strong><br />
el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas................................................................... 70<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes de <strong>la</strong><br />
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s<br />
que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda más adición de detrito <strong>en</strong><br />
el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas................................................................... 71<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca del<br />
bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les<br />
aplicaron distintos tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas ........... 73<br />
Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca del<br />
bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s que se les aplicaron<br />
distintos tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas ............................ 74<br />
x
Lista de Apéndices<br />
página<br />
Apéndice Uno. ....................................................................................................... 85<br />
Apéndice 1.01. Protocolo para extracción de ADN ............................................... 86<br />
Apéndice 1.02. Dilución de iniciadores oligonucleótidos...................................... 88<br />
Apéndice 1.03. Protocolo de precipitación para productos de secu<strong>en</strong>ciación........ 89<br />
Apéndice Dos. Resultados ..................................................................................... 91<br />
Apéndice 2.01.<br />
Apéndice 2.02.<br />
Apéndice 2.03.<br />
Resultados de <strong>la</strong> amplificación del ADN mediante <strong>la</strong><br />
técnica de reacción de <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a de polimerasa (PCR)<br />
utilizando <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción Red Taq ................................. 91<br />
Resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras de <strong>hojarasca</strong> fresca<br />
colectadas <strong>en</strong> los Bloques A, B y C al determinar <strong>la</strong><br />
conc<strong>en</strong>tración de ADN total (µg/ml) y <strong>la</strong> diversidad de<br />
microorganismos utilizando <strong>la</strong> técnica de TRFLP de<br />
acuerdo a los tratami<strong>en</strong>tos e intervalos de tiempo......................... 96<br />
Resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras de hojas verdes<br />
colectadas <strong>en</strong> los Bloques A, B y C al determinar <strong>la</strong><br />
conc<strong>en</strong>tración de ADN total (µg/ml) y <strong>la</strong> diversidad de<br />
microorganismos utilizando <strong>la</strong> técnica de TRFLP de<br />
acuerdo a los tratami<strong>en</strong>tos e intervalos de tiempo......................... 98<br />
xi
Abstract<br />
María L. Ortiz Hernández (Master of Sci<strong>en</strong>ce, Environm<strong>en</strong>tal Sci<strong>en</strong>ce)<br />
Leaf litter microbial communities at differ<strong>en</strong>t stages of decomposition with and without<br />
canopy op<strong>en</strong>ing and debris deposition (May 2008)<br />
Abstract of Master’s Thesis at the Universidad del Turabo<br />
M.S. thesis supervised by Dr. Sharon Cantrell<br />
No. of the pages in the text 99<br />
Hurricanes are common disturbances affecting forest ecosystems in the<br />
Caribbean. Our objective was to determine the re<strong>la</strong>tive abundance and diversity of<br />
microorganisms in leaf litter at differ<strong>en</strong>t stages of decomposition, and the influ<strong>en</strong>ce of<br />
canopy op<strong>en</strong>ing and debris addition or removal. The study was conducted in the tabonuco<br />
forest (subtropical moist) at El Yunque Rain Forest, Puerto Rico. Three blocks with four<br />
treatm<strong>en</strong>t plots were established. TRFLP profiles of the 16S rDNA digested with MnlI<br />
and fungal ITS digested with HaeIII showed that the microbial communities at 17, 31 and<br />
55 weeks were highly diverg<strong>en</strong>t among treatm<strong>en</strong>ts. Ratio of fungal to bacterial<br />
phylotypes increased for close canopy with debris addition. Leaf mass loss was slowest in<br />
the treatm<strong>en</strong>t with canopy trimming and debris removal. Microbial community changes<br />
through time can be re<strong>la</strong>ted to microclimate and the avai<strong>la</strong>bility of <strong>la</strong>bile compounds.<br />
Fungi appeared to control the succession of microorganisms in decomposing leaves.<br />
xii
Resum<strong>en</strong><br />
Los huracanes son disturbios comunes que afectan los ecosistemas de bosques <strong>en</strong><br />
el Caribe. El objetivo de nuestro estudio fue determinar <strong>la</strong> abundancia re<strong>la</strong>tiva y <strong>la</strong><br />
diversidad de microorganismos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> a difer<strong>en</strong>tes estados de descomposición, y<br />
el efecto de <strong>la</strong> poda del dosel y <strong>la</strong> adición o remoción del detrito. El estudio fue realizado<br />
<strong>en</strong> bosque tabonuco (subtropical húmedo) <strong>en</strong> el bosque lluvioso El Yunque <strong>en</strong> Puerto<br />
Rico. Se establecieron tres bloques divididos <strong>en</strong> cuatro parce<strong>la</strong>s con cuatro tratami<strong>en</strong>tos<br />
distintos. El TRFLP de <strong>la</strong> región 16S rADN digerida con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima MnlI y <strong>la</strong> región ITS<br />
digerida con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima HaeIII mostró que <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> a <strong>la</strong>s 17, 31 y 55<br />
semanas fueron altam<strong>en</strong>te diverg<strong>en</strong>tes a través de los tratami<strong>en</strong>tos. La razón del número<br />
de filotipos de hongos versus los de bacterias fue mayor <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de no poda más<br />
adición del detrito. La pérdida de masa <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca fue más l<strong>en</strong>ta <strong>en</strong> el<br />
tratami<strong>en</strong>to de poda del dosel sin adición de detrito. Los cambios de <strong>la</strong>s comunidades<br />
<strong>microbianas</strong> a través del tiempo pudieron ser re<strong>la</strong>cionados al microclima y a <strong>la</strong><br />
disponibilidad de compuestos lábiles. Los hongos apar<strong>en</strong>tan contro<strong>la</strong>r <strong>la</strong> sucesión de<br />
microorganismos al descomponer <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>.<br />
xiii
.<br />
xiv
Capítulo Uno<br />
Introducción<br />
Justificación<br />
Los disturbios atmosféricos que afectan los bosques del Caribe son causados<br />
principalm<strong>en</strong>te por los huracanes. Éstos se originan <strong>en</strong> <strong>la</strong> costa occid<strong>en</strong>tal de África y una<br />
vez llegan al Caribe provocan cambios profundos <strong>en</strong> <strong>la</strong> fauna, <strong>la</strong> flora, <strong>la</strong> geografía, el<br />
suelo y <strong>en</strong> diversos aspectos g<strong>en</strong>erales del lugar. En trabajos realizados <strong>en</strong> Puerto Rico se<br />
ha sugerido que los disturbios naturales, como los huracanes, ti<strong>en</strong><strong>en</strong> un efecto<br />
significativo <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructuración de los bosques tropicales, particu<strong>la</strong>rm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
distribución de árboles, <strong>la</strong> diversidad de especies y <strong>la</strong> biomasa (Weaver, 1986; Lugo y<br />
Rivera-Battle, 1987).<br />
Durante los huracanes Hugo (1989) y Georges (1998), se crearon aberturas <strong>en</strong> el<br />
dosel del bosque de El Yunque y se produjo un aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> cantidad de <strong>hojarasca</strong> y<br />
madera acumu<strong>la</strong>da <strong>en</strong> el suelo (Lodge et al, 1991; Ostertag et al, 2003). De acuerdo a los<br />
estudios realizados por Lodge et al, (1991), el Huracán Hugo depositó 1 kg/m 2<br />
de<br />
<strong>hojarasca</strong> <strong>en</strong> el suelo del bosque. En un periodo de dos años, <strong>la</strong> diversidad funcional de<br />
comunidades <strong>microbianas</strong> (Willig et al, 1996) y <strong>la</strong> superviv<strong>en</strong>cia de los hongos (Lodge<br />
and Cantrell, 1995) fue afectada por el aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> detrito, luz, humedad y nutri<strong>en</strong>tes. En<br />
estudios realizados por Quishui y Zak (1995), se re<strong>la</strong>ciona el tamaño de <strong>la</strong> abertura del<br />
dosel <strong>en</strong> bosques subtropicales y <strong>la</strong> descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. En su trabajo se<br />
establece que los factores de temperatura, humedad y <strong>la</strong> radiación so<strong>la</strong>r son factores que<br />
median <strong>la</strong>s actividades y <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong>. Por otra parte <strong>en</strong><br />
1
2<br />
estudios realizados por Cornejo, Vare<strong>la</strong> y Wright (1994), se utiliza el método de<br />
irrigación para manipu<strong>la</strong>r el agua <strong>en</strong> el terr<strong>en</strong>o durante <strong>la</strong> época de sequía y poder<br />
examinar el efecto de ésta sobre <strong>la</strong> razón de descomposición, <strong>la</strong> liberación de nutri<strong>en</strong>tes,<br />
<strong>la</strong>s bacterias y los hongos. Utilizaron series de diluciones para cuantificar <strong>la</strong> d<strong>en</strong>sidad de<br />
bacterias y hongos. En su estudio <strong>en</strong>contraron que <strong>la</strong>s conc<strong>en</strong>traciones de nutri<strong>en</strong>tes <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong>s fracciones recalcitrantes de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> mostraban una declinación rápida <strong>en</strong> el<br />
primer mes seguida por <strong>la</strong> bioacumu<strong>la</strong>ción o cambios no significativos <strong>en</strong> los sigui<strong>en</strong>tes<br />
cuatro meses. El conteo de bacterias mostró <strong>la</strong> t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia a disminuir de valores altos <strong>en</strong><br />
<strong>en</strong>ero, febrero y marzo a valores bajos <strong>en</strong> abril y mayo, cuando <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> era irrigada.<br />
Esta disminución fue corre<strong>la</strong>cionada con <strong>la</strong> pérdida de masa y probablem<strong>en</strong>te reflejaba<br />
una variedad de cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> calidad del sustrato durante <strong>la</strong> descomposición. Por el<br />
contrario, <strong>en</strong> <strong>la</strong> parce<strong>la</strong> control, el conteo de hongos fue mayor cuando <strong>la</strong>s condiciones<br />
eran más secas durante febrero y marzo y declinaba con <strong>la</strong> leve lluvia de abril y <strong>la</strong>s<br />
fuertes lluvias de mayo. Estas observaciones confirmaron que <strong>la</strong>s condiciones secas<br />
favorecían <strong>la</strong> actividad de los hongos (Cornejo et al, 1994). No obstante, aún ti<strong>en</strong>e que ser<br />
determinado el papel que desempeñan <strong>la</strong>s interacciones de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong><br />
<strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión de <strong>la</strong> descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo.<br />
El valor de este estudio estribaba <strong>en</strong> que se pudiera determinar como <strong>la</strong><br />
deposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> verde y <strong>la</strong> abertura del dosel <strong>en</strong> el bosque afectaban <strong>la</strong>s<br />
comunidades de microorganismos (hongos y bacterias) <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. El<br />
objetivo se alcanzó mediante <strong>la</strong> aplicación de “Terminal Restriction Fragm<strong>en</strong>t L<strong>en</strong>gth<br />
Polymorphism” (TRFLP) utilizando el g<strong>en</strong> para <strong>la</strong> subunidad ribosomal pequeña <strong>en</strong><br />
bacterias (16S rADN) y <strong>la</strong> región interna que se transcribe <strong>en</strong> hongos (ITS, por sus sig<strong>la</strong>s
3<br />
<strong>en</strong> inglés), indep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te. Esta técnica es considerada una herrami<strong>en</strong>ta poderosa y<br />
rápida para estimar <strong>la</strong> diversidad y estructura de comunidades <strong>microbianas</strong> complejas.<br />
Meta y Objetivos<br />
La meta del estudio fue determinar cómo <strong>la</strong> deposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> verde y <strong>la</strong><br />
abertura del dosel <strong>en</strong> el bosque afectaban indep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te o <strong>en</strong> conjunto <strong>la</strong>s<br />
comunidades <strong>microbianas</strong> (hongos y bacterias) <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. En otras<br />
pa<strong>la</strong>bras, se pret<strong>en</strong>día caracterizar y medir los cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión microbiana <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> simu<strong>la</strong>ndo <strong>la</strong>s condiciones que surg<strong>en</strong> con el paso de un huracán. Las aberturas<br />
<strong>en</strong> el dosel del bosque y <strong>la</strong> deposición del detrito ocurr<strong>en</strong> normalm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> conjunto como<br />
resultado de los daños causados por los huracanes, pero <strong>en</strong> este estudio se utilizó un<br />
diseño factorial 2 x 2 para separar estos efectos. El estudio se realizó <strong>en</strong> tres áreas del<br />
Bosque Experim<strong>en</strong>tal de Luquillo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s cuales se recrearon los efectos de un huracán<br />
podando de manera sistemática el dosel para luego redistribuir <strong>la</strong> vegetación acumu<strong>la</strong>da<br />
<strong>en</strong> distintas áreas. El cambio <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades se analizó estableci<strong>en</strong>do distintas<br />
condiciones y simu<strong>la</strong>ndo el movimi<strong>en</strong>to de fu<strong>en</strong>tes orgánicas, como hojas y ramas,<br />
durante el paso de un huracán. Con este estudio se pret<strong>en</strong>día medir los cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
estructura microbiana <strong>en</strong> respuesta a los difer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos y sus efectos re<strong>la</strong>tivos <strong>en</strong><br />
los organismos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión de descomposición del material orgánico. Se<br />
tuvo como finalidad re<strong>la</strong>cionar <strong>la</strong> información a nivel molecu<strong>la</strong>r con <strong>la</strong> actividad a esca<strong>la</strong><br />
ecológica. Los objetivos de este estudio son:<br />
<br />
Analizar <strong>la</strong> composición y estructura de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> por medio de TRFLP.
4<br />
<br />
Determinar si hay alguna difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong>tre los tratami<strong>en</strong>tos y<br />
difer<strong>en</strong>tes niveles de descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>.<br />
<br />
Determinar <strong>la</strong> diversidad de bacterias y hongos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong>.<br />
Hipótesis<br />
H o : La deposición de materia orgánica y <strong>la</strong>s aberturas <strong>en</strong> el dosel mant<strong>en</strong>drán<br />
invariable <strong>la</strong> diversidad de microorganismos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> a difer<strong>en</strong>tes estados de<br />
descomposición.<br />
H a : La deposición de materia orgánica y <strong>la</strong>s aberturas <strong>en</strong> el dosel cambiarán <strong>la</strong><br />
diversidad re<strong>la</strong>tiva de microorganismos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> a difer<strong>en</strong>tes estados de<br />
descomposición.<br />
En trabajos realizados <strong>en</strong> el Bosque Experim<strong>en</strong>tal de Luquillo se ha <strong>en</strong>contrado,<br />
que <strong>la</strong> formación de aberturas <strong>en</strong> el dosel del bosque han causado cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
composición de comunidades de basidiomicetos <strong>en</strong> <strong>hojarasca</strong>, y a <strong>la</strong> misma vez, una<br />
disminución <strong>en</strong> <strong>la</strong> abundancia de especies (Hedger, 1985; Lodge and Cantrell, 1995). Por<br />
otro <strong>la</strong>do, Quishui y Zak (1995), <strong>en</strong>contraron que estas aberturas <strong>en</strong> el dosel afectan<br />
drásticam<strong>en</strong>te <strong>la</strong> tasa de descomposición del lugar al reducir <strong>la</strong>s actividades <strong>microbianas</strong><br />
debido a los cambios <strong>en</strong> temperatura e irradiación de luz so<strong>la</strong>r que ocurr<strong>en</strong> <strong>en</strong> el suelo.<br />
El “Long Term Ecological Research” (LTER) auspiciado por <strong>la</strong> Fundación<br />
Nacional para <strong>la</strong> ci<strong>en</strong>cias <strong>en</strong> su propuesta número 3 propuso estudiar los efectos de un<br />
huracán <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades de organismos sobre el suelo del bosque. A estos fines, se<br />
seleccionaron tres áreas o bloques de estudios, <strong>la</strong>s cuales estuvieron divididas <strong>en</strong> cuatro<br />
parce<strong>la</strong>s cada una y estas parce<strong>la</strong>s se dividieron <strong>en</strong> cinco subparce<strong>la</strong>s. En estas áreas se
5<br />
simu<strong>la</strong>ron los difer<strong>en</strong>tes efectos de un huracán. Dos de <strong>la</strong>s cuatro parce<strong>la</strong>s fueron<br />
sometidas a una poda del dosel (corte de ramas por arboristas profesionales). En una de<br />
estas parce<strong>la</strong>s, se removió toda <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> y <strong>la</strong>s ramas verdes, y éstas se distribuyeron<br />
<strong>en</strong> otra parce<strong>la</strong> (donde no hubo poda del dosel). Al podar el dosel y redistribuir <strong>la</strong><br />
biomasa, se crearon cambios <strong>en</strong> el microclima y estructura del bosque. Durante un año se<br />
tomaron muestras de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> para extraer el ADN y determinar los cambios,<br />
mediante indicadores g<strong>en</strong>éticos, <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión de <strong>la</strong>s comunidades de microorganismos<br />
<strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> durante <strong>la</strong> descomposición <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> después de un disturbio natural.<br />
Con el propósito de determinar como estos cambios afectan los microorganismos<br />
describiremos a continuación los distintos tratami<strong>en</strong>tos.<br />
Descripción de los tratami<strong>en</strong>tos:<br />
1. Abertura del dosel y adición del detrito<br />
Este tratami<strong>en</strong>to simu<strong>la</strong>rá cambios <strong>en</strong> el microclima causados por <strong>la</strong> abertura <strong>en</strong> el<br />
dosel y <strong>la</strong> adición de materia orgánica. La tasa de descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong><br />
pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong>s canastas aum<strong>en</strong>tará debido al increm<strong>en</strong>to re<strong>la</strong>tivo <strong>en</strong> <strong>la</strong> humedad de <strong>la</strong><br />
capa de <strong>hojarasca</strong> protegida y al movimi<strong>en</strong>to de nutri<strong>en</strong>tes de <strong>la</strong>s hojas verdes. Los<br />
cambios <strong>en</strong> humedad, profundidad de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> y <strong>la</strong> alta conc<strong>en</strong>tración de nutri<strong>en</strong>tes <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong>s hojas verdes podrán interactuar e influ<strong>en</strong>ciar <strong>la</strong> tasa de descomposición <strong>en</strong> <strong>la</strong> capa de<br />
<strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> pres<strong>en</strong>te sobre el suelo, además de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> verde. Por tanto, <strong>la</strong><br />
diversidad de microorganismos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> no cambiará inmediatam<strong>en</strong>te después que<br />
el dosel sea podado. Ev<strong>en</strong>tualm<strong>en</strong>te habrá una disminución <strong>en</strong> <strong>la</strong> diversidad re<strong>la</strong>tiva<br />
debido a <strong>la</strong> abertura de dosel y los cambios microclimáticos asociados (altas temperaturas<br />
y radiación de luz) que afectarán el desarrollo y <strong>la</strong>s actividades <strong>microbianas</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong>
6<br />
sucesión de descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. Una vez que <strong>la</strong> abertura de dosel se cierre y<br />
<strong>la</strong>s condiciones microclimáticas se reestablezcan aum<strong>en</strong>tará <strong>la</strong> diversidad de<br />
microorganismos.<br />
2. Abertura del dosel y remoción del detrito<br />
Esto simu<strong>la</strong>rá los cambios <strong>en</strong> el microclima (aberturas) creados por el huracán sin<br />
<strong>la</strong> incorporación de cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> redistribución de biomasa. El incorporar material<br />
orgánico es un factor importante para el desarrollo microbiano d<strong>en</strong>tro de un ecosistema.<br />
Por <strong>en</strong>de, si se retira esta fu<strong>en</strong>te orgánica, se disminuye el desarrollo de los<br />
microorganismos, particu<strong>la</strong>rm<strong>en</strong>te los hongos. En este tratami<strong>en</strong>to se observará una<br />
diversidad reducida <strong>en</strong> el número de microorganismos inmediatam<strong>en</strong>te después que el<br />
dosel del bosque se ha podado y se retire el material orgánico ya que habrá una<br />
disminución <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión de descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. Ev<strong>en</strong>tualm<strong>en</strong>te, <strong>la</strong><br />
diversidad de microorganismos com<strong>en</strong>zará a reestablecerse una vez <strong>la</strong> abertura del dosel<br />
se cierre y se reestablezcan <strong>la</strong>s condiciones climáticas d<strong>en</strong>tro del bosque.<br />
3. Dosel cerrado y adición del detrito<br />
Esto simuló los cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> redistribución de biomasa creados por el huracán<br />
sin <strong>la</strong> asociación de los cambios del microclima. Se esperará que <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> exist<strong>en</strong>te <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong>s canastas t<strong>en</strong>ga un aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> tasa de descomposición debido al aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
profundidad de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> y el ambi<strong>en</strong>te favorable. Este tratami<strong>en</strong>to podrá t<strong>en</strong>er <strong>la</strong> tasa<br />
más rápida de pérdida de <strong>hojarasca</strong> pres<strong>en</strong>te sobre el suelo. Las condiciones climáticas<br />
invariables y <strong>la</strong> <strong>en</strong>trada de biomasa d<strong>en</strong>tro del bosque mant<strong>en</strong>drán sin cambios <strong>la</strong><br />
diversidad de microorganismos. Inmediatam<strong>en</strong>te luego del tratami<strong>en</strong>to habrá un marcado<br />
y rápido aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> diversidad de los microorganismos ocasionado por el increm<strong>en</strong>to
7<br />
de biomasa <strong>en</strong> <strong>la</strong> descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo. La diversidad de<br />
microorganismos podrá mant<strong>en</strong>erse sin cambios.<br />
4. Control. Dosel cerrado y no adición del detrito<br />
Esto mant<strong>en</strong>drá <strong>la</strong>s condiciones del bosque sin cambios Se esperará que este<br />
tratami<strong>en</strong>to t<strong>en</strong>ga el segundo o tercer lugar más alto <strong>en</strong> <strong>la</strong> tasa de descomposición. La<br />
diversidad de microorganismos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> de <strong>la</strong>s canastas no cambiará. Las<br />
condiciones invariables del bosque mant<strong>en</strong>drán <strong>la</strong> composición, <strong>la</strong> estructura y <strong>la</strong><br />
diversidad microbiana.
Capítulo Dos<br />
Revisión de Literatura<br />
El suelo es un recurso natural dinámico necesario para sust<strong>en</strong>tar cualquier<br />
ecosistema terrestre. La calidad de éste puede afectar <strong>la</strong> sust<strong>en</strong>tabilidad y productividad<br />
de uso de <strong>la</strong> tierra y, al mismo tiempo, esta calidad puede ser influ<strong>en</strong>ciada fuertem<strong>en</strong>te<br />
por procesos microbiológicos tales como el recic<strong>la</strong>je y <strong>la</strong> capacidad de nutri<strong>en</strong>tes <strong>en</strong>tre<br />
otros.<br />
La biomasa microbiana del suelo y de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> <strong>en</strong> los bosques tropicales está<br />
compuesta de eubacterias, arqueobacterias, hongos, actinomicetos, algas, protozoarios y<br />
algunos nemátodos. Esto constituye un cuarto de <strong>la</strong> biomasa total del p<strong>la</strong>neta. Es por esta<br />
razón que <strong>la</strong> biomasa microbiana contribuye al mant<strong>en</strong>imi<strong>en</strong>to de <strong>la</strong> fertilidad y calidad<br />
del suelo tanto <strong>en</strong> el ecosistema terrestre natural como <strong>en</strong> el ecosistema terrestre<br />
manipu<strong>la</strong>do. De acuerdo a los estudios realizados por Willig et al, (1996), el uso que se le<br />
da al suelo afecta <strong>la</strong> estructura del ecosistema, éste incluye características tales como<br />
composición química, profundidad, disponibilidad de agua y conc<strong>en</strong>tración de materia<br />
orgánica. Aunque todos estos factores se pued<strong>en</strong> re<strong>la</strong>cionar, no se ha podido determinar<br />
cuál de éstos es más importante <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad microbiana debido a <strong>la</strong><br />
falta de manipu<strong>la</strong>ciones <strong>en</strong> <strong>la</strong> experim<strong>en</strong>tación. La biomasa microbiana es parte de <strong>la</strong><br />
materia orgánica del suelo y de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra sobre éste y ti<strong>en</strong>e una<br />
función importante <strong>en</strong> el desarrollo y funcionami<strong>en</strong>to de ecosistemas terrestres. La<br />
materia orgánica del suelo es una mezc<strong>la</strong> compleja de materia viva, muerta y<br />
descompuesta, <strong>en</strong> adición a los compuestos inorgánicos. El compon<strong>en</strong>te vivo compr<strong>en</strong>de<br />
8
9<br />
alrededor de un 4% del carbono orgánico total del suelo y es subdividido <strong>en</strong> tres<br />
compon<strong>en</strong>tes: raíces de p<strong>la</strong>ntas (5-10%), macroorganismos (15-30%) y microorganismos<br />
(60-80%). Por otro <strong>la</strong>do el compon<strong>en</strong>te no vivo de <strong>la</strong> materia orgánica del suelo se puede<br />
dividir <strong>en</strong> materia macroorgánica (residuos de p<strong>la</strong>ntas <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes estados de<br />
descomposición), y humus incluy<strong>en</strong>do sustancias no húmicas (carbohidratos, lípidos,<br />
ácidos orgánicos, pigm<strong>en</strong>tos y proteínas) y sustancia húmicas (ácido húmico y ácido<br />
fúlvico) (Th<strong>en</strong>g et al, 1989).<br />
En <strong>la</strong> naturaleza los microorganismos viv<strong>en</strong> <strong>en</strong> comunidades. Estas comunidades<br />
desempeñan un papel importante <strong>en</strong> <strong>la</strong> biosfera, principalm<strong>en</strong>te recic<strong>la</strong>ndo elem<strong>en</strong>tos<br />
biológicos importantes (Vestal y White, 1989). Todos los ciclos bioquímicos es<strong>en</strong>ciales<br />
como los de carbono, hidróg<strong>en</strong>o, nitróg<strong>en</strong>o, oxíg<strong>en</strong>o y azufre están mediados por<br />
comunidades de microorganismos. Por <strong>en</strong>de, si se <strong>en</strong>ti<strong>en</strong>de <strong>la</strong> función que ti<strong>en</strong><strong>en</strong> los<br />
microorganismos <strong>en</strong> el ambi<strong>en</strong>te natural, se facilitará el distinguir cuáles organismos<br />
están <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong>. Es sumam<strong>en</strong>te importante <strong>en</strong>t<strong>en</strong>der el papel de estos microorganismos <strong>en</strong><br />
el ecosistema. Los microorganismos contro<strong>la</strong>n muchos de los procesos es<strong>en</strong>ciales para el<br />
mant<strong>en</strong>imi<strong>en</strong>to y superviv<strong>en</strong>cia de los bosques tropicales. Lodge et al, (1996) pres<strong>en</strong>ta <strong>la</strong>s<br />
dinámicas de <strong>la</strong> diversidad microbiana y el funcionami<strong>en</strong>to de los bosques. En adición, se<br />
m<strong>en</strong>cionan los atributos funcionales de los microorganismos y se id<strong>en</strong>tifican los procesos<br />
que son s<strong>en</strong>sibles a <strong>la</strong> pérdida de <strong>la</strong> diversidad, de manera especial, aquellos re<strong>la</strong>cionados<br />
con disturbios o cambios ambi<strong>en</strong>tales <strong>en</strong> los bosques tropicales. En ese trabajo, los<br />
autores reconoc<strong>en</strong> que exist<strong>en</strong> pocas publicaciones que pres<strong>en</strong>t<strong>en</strong> cómo los<br />
microorganismos pued<strong>en</strong> influ<strong>en</strong>ciar los ecosistemas <strong>en</strong> los bosques tropicales. Esto<br />
ocurre ya que <strong>la</strong>s publicaciones que más abundan están asociadas a <strong>la</strong> caracterización de
10<br />
microorganismos que se re<strong>la</strong>cionan a procesos <strong>en</strong> ecosistemas tropicales, pero el estudio<br />
de cómo <strong>la</strong> diversidad afecta el funcionami<strong>en</strong>to de los ecosistemas es prácticam<strong>en</strong>te<br />
limitado.<br />
Se ha int<strong>en</strong>tado determinar <strong>la</strong> función de ciertos microorganismos, como bacterias<br />
y hongos, <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> naturales por medio de cultivos selectivos<br />
<strong>en</strong>riquecidos (Vestal y White, 1989). Por ejemplo, se puede seleccionar un medio con una<br />
so<strong>la</strong> fu<strong>en</strong>te de carbono y luego mezc<strong>la</strong>r el medio con <strong>la</strong> muestra de suelo o sedim<strong>en</strong>to, se<br />
esperará que sólo aquellos microorganismos que puedan degradar <strong>la</strong> fu<strong>en</strong>te de carbono<br />
añadida puedan crecer. De esta manera, dichos organismos serán seleccionados y<br />
<strong>en</strong>riquecidos produci<strong>en</strong>do una fu<strong>en</strong>te de biomasa medible. Los microorganismos serán<br />
cultivados para obt<strong>en</strong>er colonias puras. Este método ha sido utilizado para demostrar el<br />
papel de los microorganismos <strong>en</strong> el recic<strong>la</strong>je de <strong>la</strong> materia <strong>en</strong> <strong>la</strong> naturaleza (Vestal y<br />
White, 1989).<br />
La cad<strong>en</strong>a alim<strong>en</strong>taria subterránea del suelo difiere <strong>en</strong> varias maneras de <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a<br />
superior de éste, pero quizás, una de <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>cias más importantes está <strong>en</strong> su función.<br />
Se ha seña<strong>la</strong>do que <strong>la</strong>s cad<strong>en</strong>as subterráneas del suelo son responsables de <strong>la</strong> mayor parte<br />
de <strong>la</strong> descomposición y el recic<strong>la</strong>je de nutri<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> los ecosistemas, mi<strong>en</strong>tras <strong>la</strong>s cad<strong>en</strong>as<br />
superiores son responsables de <strong>la</strong> productividad, como por ejemplo <strong>la</strong> <strong>en</strong>trada de carbono<br />
(Gange et al, 2002). Esta difer<strong>en</strong>cia ocurre ya que <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a subterránea es dominada por<br />
compon<strong>en</strong>tes microbianos. Gange et al, (2002) llegó a <strong>la</strong> conclusión que <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión<br />
temprana los insectos que se alim<strong>en</strong>tan de raíces y los hongos AM (micorrizales<br />
arbuscu<strong>la</strong>res) miembros de <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a alim<strong>en</strong>taria del suelo afectan <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong>s<br />
p<strong>la</strong>ntas de <strong>la</strong> comunidad. Ocurr<strong>en</strong> varias interacciones <strong>en</strong>tre ellos, el efecto de los
11<br />
insectos es más grande cuando los hongos están <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong>, pero el efecto de los hongos es<br />
mayor cuando los insectos están aus<strong>en</strong>tes. Los insectos que se alim<strong>en</strong>tan de raíces<br />
aceleran el proceso de sucesión, mi<strong>en</strong>tras los hongos micorrizales arbuscu<strong>la</strong>res <strong>la</strong><br />
retrasan. Por otra parte, <strong>en</strong> su trabajo LaMontagne et al, (2003) compararon comunidades<br />
bacterianas del suelo a través de dos transectos verticales desde <strong>la</strong> superficie hasta cuatro<br />
metros de profundidad utilizando <strong>la</strong> técnica de polimorfismos <strong>en</strong> longitud de fragm<strong>en</strong>tos<br />
terminales de restricción (TRFLP) para amplicones de g<strong>en</strong>es 16S rARN para determinar<br />
cómo se difer<strong>en</strong>ciaban <strong>la</strong>s comunidades bacterianas <strong>en</strong> <strong>la</strong> superficie y <strong>la</strong>s capas<br />
subterráneas. Los hal<strong>la</strong>zgos reve<strong>la</strong>ron que el ADN extraído de <strong>la</strong> muestras del suelo de<br />
los dos transectos disminuyó expon<strong>en</strong>cialm<strong>en</strong>te desde <strong>la</strong> superficie hasta cuatro metros de<br />
profundidad. La riqueza, adquirida por el número de picos obt<strong>en</strong>idos después de <strong>la</strong><br />
digestión con <strong>la</strong>s <strong>en</strong>zimas HhaI, MspI, RsaI, o HaeIII, y <strong>la</strong> diversidad, obt<strong>en</strong>ida por los<br />
índices de diversidad Shannon, fueron m<strong>en</strong>ores <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras más profundas. La<br />
disminución <strong>en</strong> diversidad <strong>en</strong> <strong>la</strong> profundidad es consist<strong>en</strong>te con <strong>la</strong> teoría de <strong>en</strong>ergía de <strong>la</strong>s<br />
especies, <strong>la</strong> cual predice una diversidad re<strong>la</strong>tiva m<strong>en</strong>or <strong>en</strong> los horizontes de materia<br />
orgánica más profundos. El patrón de uso del sustrato indica que el cultivo de<br />
microorganismos difiere <strong>en</strong>tre los horizontes A (capa del suelo <strong>en</strong> <strong>la</strong> que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra el<br />
humus, materia orgánica descomponiéndose y <strong>la</strong> actividad microbiana) y el horizonte O<br />
(capa superior del suelo <strong>en</strong> el que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>) <strong>en</strong> los suelos del bosque.<br />
Este cambio <strong>en</strong> <strong>la</strong>s pob<strong>la</strong>ciones coincide con <strong>la</strong> disminución <strong>en</strong> el carbono del suelo, <strong>la</strong><br />
biomasa microbiana total y <strong>la</strong> actividad que se produce a medida que aum<strong>en</strong>ta <strong>la</strong><br />
profundidad. En adición, LaMontagne et al, (2003) m<strong>en</strong>cionan <strong>en</strong> su trabajo que <strong>la</strong>s<br />
comunidades bacterianas <strong>en</strong> <strong>la</strong> superficie cambian con <strong>la</strong> disponibilidad de nutri<strong>en</strong>tes y
12<br />
que hay difer<strong>en</strong>cias causadas por <strong>la</strong> profundidad y <strong>la</strong>s estaciones del año. Exist<strong>en</strong> varios<br />
ejemplos de cómo <strong>la</strong> alteración <strong>en</strong> <strong>la</strong> productividad de <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nta (usualm<strong>en</strong>te por<br />
defoliación) afecta <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a alim<strong>en</strong>taria del suelo (Miko<strong>la</strong> et al, 2001).<br />
Estos experim<strong>en</strong>tos mostraron que <strong>la</strong>s interacciones son complejas a medida que algunos<br />
compon<strong>en</strong>tes de <strong>la</strong> biota del suelo, como los nemátodos microbívoros, son afectados por<br />
algunas combinaciones particu<strong>la</strong>res de especies de p<strong>la</strong>ntas defoliadas. Mi<strong>en</strong>tras tanto para<br />
otros (hongos), no es importante <strong>la</strong> id<strong>en</strong>tidad de <strong>la</strong> especie de p<strong>la</strong>nta, pero si <strong>la</strong> cantidad<br />
del fol<strong>la</strong>je que fue removido (Gange et al, 2002). Los trabajos de Miko<strong>la</strong> et al, 2001<br />
sugier<strong>en</strong> que <strong>la</strong> int<strong>en</strong>sidad de <strong>la</strong> defoliación puede afectar grandem<strong>en</strong>te <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a<br />
alim<strong>en</strong>taria del suelo. En ese trabajo se concluyó que los datos microbianos obt<strong>en</strong>idos<br />
implicaban que el efecto de <strong>la</strong> int<strong>en</strong>sidad de <strong>la</strong> defoliación <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a<br />
alim<strong>en</strong>taria del suelo podría dep<strong>en</strong>der de <strong>la</strong> duración de <strong>la</strong> defoliación y, por<br />
consigui<strong>en</strong>te, es probable que sea más dinámico que constante <strong>en</strong> <strong>la</strong> naturaleza. En<br />
trabajos realizados <strong>en</strong> Puerto Rico, se ha sugerido que los disturbios naturales, como los<br />
huracanes, ti<strong>en</strong><strong>en</strong> un efecto significativo <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructuración de los bosques tropicales.<br />
Esto ocurre <strong>en</strong> re<strong>la</strong>ción a los aspectos de distribución de árboles, diversidad de especies y<br />
<strong>la</strong> biomasa del lugar (Weaver, 1986; Lugo y Rivera-Battle, 1987). Según Lodge et al,<br />
(1996), <strong>en</strong> los bosques tropicales exist<strong>en</strong> grupos funcionales s<strong>en</strong>sitivos que realizan<br />
funciones básicas <strong>en</strong> los procesos de los ecosistemas. La función de <strong>la</strong> masa microbiana<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> materia orgánica sobre el suelo y <strong>en</strong> el mant<strong>en</strong>imi<strong>en</strong>to de nitróg<strong>en</strong>o puede ser<br />
significante, particu<strong>la</strong>rm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> ecosistemas perturbados o que se están reg<strong>en</strong>erando<br />
(Arunacha<strong>la</strong>m et al, 1996). Gran parte de estos microorganismos llevan a cabo<br />
interacciones mutualistas con otros organismos, como, <strong>la</strong>s bacterias fijadoras de
13<br />
nitróg<strong>en</strong>o <strong>en</strong> los nódulos de <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>ntas y los que actúan con artrópodos y <strong>la</strong>s micorrizas.<br />
Como gran parte de estos organismos ti<strong>en</strong><strong>en</strong> su propio nicho ecológico, se hace difícil<br />
que puedan sustituir <strong>la</strong> exist<strong>en</strong>cia de otros. Es razonable p<strong>en</strong>sar que algunos procesos <strong>en</strong><br />
los bosques tropicales asociados a estos microorganismos y a sus interacciones sean<br />
s<strong>en</strong>sitivos a disturbios debido a que <strong>la</strong>s actividades y los grupos funcionales de éstos<br />
están delimitados a ambi<strong>en</strong>tes restringidos y son s<strong>en</strong>sibles a cambios. El tamaño de una<br />
abertura producida <strong>en</strong> el dosel de un bosque después de un ev<strong>en</strong>to climatológico, como<br />
un huracán, es determinante <strong>en</strong> <strong>la</strong>s actividades de <strong>la</strong> descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. En<br />
estudios realizados por Quishui y Zak (1995), se re<strong>la</strong>ciona el tamaño de <strong>la</strong> abertura del<br />
dosel <strong>en</strong> bosques subtropicales y <strong>la</strong> descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. En su trabajo se<br />
establece que <strong>la</strong> temperatura, <strong>la</strong> humedad y <strong>la</strong> radiación so<strong>la</strong>r son factores que median <strong>la</strong>s<br />
actividades y <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong>. Por ejemplo, <strong>la</strong>s aberturas de<br />
gran tamaño provocarán aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>en</strong>trada de <strong>la</strong> radiación so<strong>la</strong>r, esto a su vez causará<br />
que aum<strong>en</strong>te <strong>la</strong> evaporación y disminuya rápidam<strong>en</strong>te <strong>la</strong> humedad de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. Por<br />
otro <strong>la</strong>do, según Vestal y White (1989), cuando se hab<strong>la</strong> del estado metabólico de <strong>la</strong>s<br />
comunidades <strong>microbianas</strong> se ti<strong>en</strong>e que m<strong>en</strong>cionar que éstas pued<strong>en</strong> vivir bajo<br />
condiciones de estrés metabólico o crecimi<strong>en</strong>to desigual cuando los factores de humedad,<br />
pH, luz, nutri<strong>en</strong>tes inorgánicos, materia orgánica disponible y temperatura no son<br />
adecuados. Exist<strong>en</strong> muchas célu<strong>la</strong>s eucariotas y bacterianas que almac<strong>en</strong>an molécu<strong>la</strong>s<br />
intracelu<strong>la</strong>res durante los períodos de estrés metabólicos. El análisis de estos compuestos<br />
almac<strong>en</strong>ados puede ser usado como indicador de <strong>la</strong> salud metabólica de <strong>la</strong> comunidad.<br />
Los cambios <strong>en</strong> estos compuestos pued<strong>en</strong> ser seguidos durante <strong>la</strong> manipu<strong>la</strong>ción ambi<strong>en</strong>tal<br />
para estudiar los efectos de los cambios <strong>en</strong> el metabolismo de <strong>la</strong> comunidad. De acuerdo
14<br />
a trabajos realizados por Liu et al, (1997), <strong>la</strong> caracterización de <strong>la</strong> diversidad microbiana<br />
utilizando <strong>la</strong> técnica TRFLP demostraron que esta metodología provee un análisis rápido<br />
para conocer diversidad microbiana y los cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura microbiana de <strong>la</strong><br />
comunidad que ocurre a esca<strong>la</strong>s temporales y espaciales o que ocurr<strong>en</strong> <strong>en</strong> respuesta a<br />
perturbaciones ambi<strong>en</strong>tales.<br />
En <strong>la</strong>s últimas décadas se han utilizado medios selectivos <strong>en</strong>riquecidos con una o<br />
varias fu<strong>en</strong>tes de <strong>en</strong>ergía para estudiar <strong>la</strong> estructura de una comunidad microbiana<br />
natural. El ais<strong>la</strong>mi<strong>en</strong>to y <strong>la</strong> id<strong>en</strong>tificación de colonias, <strong>en</strong> adición a <strong>la</strong> utilización de<br />
técnicas básicas, como <strong>la</strong> técnica de tinción, observaciones morfológicas y pruebas<br />
bioquímicas, son acercami<strong>en</strong>tos taxonómicos numéricos. Éstos pres<strong>en</strong>tan gran dificultad,<br />
consum<strong>en</strong> mucho tiempo, son costosos y so<strong>la</strong>m<strong>en</strong>te muestran <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia de<br />
microorganismos que pued<strong>en</strong> ser cultivados <strong>en</strong> el medio seleccionado. El cultivo de<br />
microorganismos de muestras naturales puede indicar <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia de microorganismos,<br />
pero no reve<strong>la</strong> cuando los microorganismos biodegradan un compuesto particu<strong>la</strong>r bajo<br />
condiciones ambi<strong>en</strong>tales. En adición, muchas comunidades <strong>microbianas</strong> re<strong>la</strong>cionadas a<br />
un sustrato no pued<strong>en</strong> ser cuantitativam<strong>en</strong>te removidas y contabilizadas.<br />
Con el propósito de solucionar estos problemas se han desarrol<strong>la</strong>ndo diversas<br />
técnicas para medir <strong>la</strong> biomasa, <strong>la</strong> estructura, el estatus metabólico y <strong>la</strong> actividad de una<br />
comunidad microbiana bajo condiciones in situ, tratando de reve<strong>la</strong>r de forma más precisa<br />
el papel funcional de dicha comunidad <strong>en</strong> <strong>la</strong> naturaleza. Una de estas técnicas es el uso de<br />
análisis de lípidos. El análisis de lípidos se utiliza para el estudio de <strong>la</strong> biomasa, <strong>la</strong><br />
estructura de <strong>la</strong> comunidad, el estatus metabólico y <strong>la</strong> actividad de <strong>la</strong>s comunidades<br />
<strong>microbianas</strong> naturales y, <strong>en</strong> adición, es una técnica re<strong>la</strong>tivam<strong>en</strong>te s<strong>en</strong>sitiva y cuantitativa
15<br />
que permite un mayor conteo de los microorganismos naturalm<strong>en</strong>te <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong>. Al usar<br />
esta metodología se pued<strong>en</strong> estudiar los cambios, a través del tiempo, <strong>en</strong> <strong>la</strong>s pob<strong>la</strong>ciones<br />
<strong>microbianas</strong> producidos por <strong>la</strong>s perturbaciones físicas o químicas <strong>en</strong> el ambi<strong>en</strong>te (Vestal<br />
y White, 1989). El análisis de lípidos descrito por Vestal y White <strong>en</strong> el 1989 involucra <strong>la</strong><br />
extracción de lípidos de una muestra con solv<strong>en</strong>tes orgánicos seguido por el análisis de<br />
ciertas fracciones del material extraído. La extracción y el análisis deb<strong>en</strong> ser directos. En<br />
el área de estudio o <strong>en</strong> el <strong>la</strong>boratorio, <strong>la</strong> muestra debe ser expuesta a una mezc<strong>la</strong> de fase<br />
s<strong>en</strong>cil<strong>la</strong> de cloroformo, metanol y agua <strong>en</strong> una razón inicial de 1:2:0.8. Cuando estos<br />
solv<strong>en</strong>tes son añadidos, los lípidos se disuelv<strong>en</strong> instantáneam<strong>en</strong>te y el metabolismo de los<br />
lípidos se deti<strong>en</strong>e. Esta técnica provee una visión de los lípidos al mom<strong>en</strong>to de <strong>la</strong><br />
extracción de éstos. Después de un corto período de haberse hecho <strong>la</strong> extracción se añade<br />
agua y cloroformo al sistema con el propósito de separar <strong>la</strong>s fases cambiando <strong>la</strong> po<strong>la</strong>ridad<br />
de <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong>. La fracción total de los lípidos puede ser <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong> <strong>la</strong> fase más baja del<br />
cloroformo y <strong>la</strong>s proteínas de mayor po<strong>la</strong>ridad, los ácidos nucleicos, <strong>la</strong>s paredes de <strong>la</strong>s<br />
célu<strong>la</strong>s y otros compon<strong>en</strong>tes permanec<strong>en</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> fase metano-agua superior o <strong>en</strong> <strong>la</strong> interfase<br />
cloroformo-agua. La fase orgánica (cont<strong>en</strong>ido de lípidos) puede ser fraccionada <strong>en</strong><br />
fosfolípidos para el análisis de <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad y <strong>la</strong> biomasa. El residuo <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong> interfase puede ser usado para medir bacterias gram negativa, gram positiva y <strong>la</strong><br />
biomasa eubacteriana total.<br />
Actualm<strong>en</strong>te se ha desarrol<strong>la</strong>do un método más simple con el objetivo de extraer<br />
los ácidos grasos directam<strong>en</strong>te del suelo. MIDI (Microbial ID) es un protocolo diseñado<br />
para extraer los ácidos grasos de cultivos de bacterias puros, aunque de acuerdo a Sasser<br />
(1990), éste se ha utilizado <strong>en</strong> <strong>la</strong> extracción de ácidos grasos del suelo. En ambas
16<br />
metodologías los ácidos grasos pasan por una meti<strong>la</strong>ción que dará lugar a <strong>la</strong> formación de<br />
los ácidos grasos meti<strong>la</strong>dos (“Fatty Acid Methyl Ester” o FAME por sus sig<strong>la</strong>s <strong>en</strong> inglés).<br />
Éstos serán analizados <strong>en</strong> un cromatógrafo de gas. Según Cavigelli et al, 1995, el valor<br />
del análisis de los ácidos grasos meti<strong>la</strong>dos (FAME) surge del hecho de que hay un gran<br />
número de difer<strong>en</strong>tes c<strong>la</strong>ses de ácidos grasos <strong>en</strong> los lípidos de los microorganismos y esa<br />
diversidad de organismos provee difer<strong>en</strong>tes combinaciones de éstos. Este trabajo fue<br />
realizado por medio de un acercami<strong>en</strong>to in situ de <strong>la</strong> distribución espacial de <strong>la</strong>s<br />
comunidades <strong>microbianas</strong> del suelo y es parte del esfuerzo que se realiza para mejorar el<br />
<strong>en</strong>t<strong>en</strong>dimi<strong>en</strong>to de los patrones, <strong>la</strong>s causas, y <strong>la</strong>s consecu<strong>en</strong>cias de <strong>la</strong> diversidad<br />
microbiana <strong>en</strong> el suelo. Los perfiles de los ácidos grasos meti<strong>la</strong>dos fueron usados <strong>en</strong> el<br />
experim<strong>en</strong>to por su habilidad única de caracterizar rápidam<strong>en</strong>te toda <strong>la</strong> comunidad y por<br />
su costo re<strong>la</strong>tivam<strong>en</strong>te bajo. En su trabajo se mostró que <strong>la</strong> interpretación de los perfiles<br />
de todo el suelo de <strong>la</strong> comunidad puede ser difícil porque muchos ácidos grasos son<br />
comunes <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes organismos y porque <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras del ambi<strong>en</strong>te hay ci<strong>en</strong>tos de<br />
ácidos grasos difer<strong>en</strong>tes.<br />
Al determinar <strong>la</strong> biomasa de una comunidad microbiana se provee un estimado de<br />
<strong>la</strong> cantidad de los microorganismos activos <strong>en</strong> un ambi<strong>en</strong>te particu<strong>la</strong>r y <strong>la</strong> capacidad para<br />
transformaciones metabólicas <strong>en</strong> ese ambi<strong>en</strong>te. La masa viable de una comunidad<br />
microbiana es determinada midi<strong>en</strong>do los compon<strong>en</strong>tes celu<strong>la</strong>res que son comunes a todas<br />
<strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s de <strong>la</strong> microbiota y que se degradan rápidam<strong>en</strong>te con <strong>la</strong> muerte de <strong>la</strong> célu<strong>la</strong>.<br />
Una manera de medir <strong>la</strong> biomasa es a través de <strong>la</strong> extracción y análisis de los<br />
compon<strong>en</strong>tes de los fosfolípidos. Todas <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s conti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> sus membranas<br />
fosfolípidos, los cuales no son almac<strong>en</strong>ados, pero si transformados rápidam<strong>en</strong>te durante
17<br />
el metabolismo. La totalidad de los lípidos serán extraídos como se m<strong>en</strong>cionó<br />
anteriorm<strong>en</strong>te. La biomasa de ciertos organismos de una comunidad microbiana puede<br />
ser estimada por <strong>la</strong> extracción de compuestos que son únicos <strong>en</strong> esos organismos, por<br />
ejemplo, <strong>la</strong> eubacteria <strong>en</strong> una muestra puede ser estimada midi<strong>en</strong>do <strong>la</strong> cantidad de ácido<br />
murámico. Éste puede ser extraído de <strong>la</strong> interfase residual de una extracción típica de<br />
lípidos y luego será purificada y analizada usando <strong>la</strong> cromatografía de gas. Un dato sobre<br />
este método es que el ácido murámico varía dramáticam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s de <strong>la</strong>s<br />
bacterias gram positiva y gram negativa, al igual que <strong>en</strong> <strong>la</strong>s cianobacterias. En el caso de<br />
los hongos, <strong>la</strong> biomasa de éstos puede ser estimada por medio del cont<strong>en</strong>ido de ergosterol<br />
(Buchan et al, 2003).<br />
Por otro <strong>la</strong>do, cuando se hab<strong>la</strong> de <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad se hace notar que<br />
<strong>la</strong> diversidad <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> el ambi<strong>en</strong>te<br />
determinará cuando se llevarán a cabo ciertas transformaciones. Para estudiar <strong>la</strong><br />
estructura de <strong>la</strong> comunidad microbiana es importante discriminar <strong>en</strong>tre difer<strong>en</strong>tes tipos de<br />
microorganismos. El análisis del cont<strong>en</strong>ido de los patrones PLFA (Análisis de ácidos<br />
grasos fosfolipídicos) proveerá significado a los resultados obt<strong>en</strong>idos. Muchas célu<strong>la</strong>s<br />
ti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> sus membranas fosfolípidos que conti<strong>en</strong><strong>en</strong> ácidos grasos meti<strong>la</strong>dos. El análisis<br />
cuantitativo y cualitativo de <strong>la</strong> fracción de fosfolípidos para ácidos grasos puede reve<strong>la</strong>r<br />
<strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia y abundancia de ciertos tipos de microorganismos bajo condiciones<br />
naturales. De esta manera proveerá un patrón de los microorganismos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> un<br />
mom<strong>en</strong>to <strong>en</strong> particu<strong>la</strong>r. La pres<strong>en</strong>cia de ciertos ácidos grasos de fosfolípidos podría servir<br />
de marcadores para ciertos tipos de microorganismos (Vestal y Wise, 1989) pero no<br />
puede determinar con certeza <strong>la</strong>s especies.
18<br />
Para el 1985 se reportó el desarrollo de una nueva técnica conocida como<br />
reacción <strong>en</strong> cad<strong>en</strong>a de polimerasa (PCR por sig<strong>la</strong>s <strong>en</strong> inglés de Polymerase Chain<br />
Reaction) por Kary Mullis y asociados, <strong>la</strong> cual amplió grandem<strong>en</strong>te el poder de <strong>la</strong><br />
investigación con el ADN recombinante e inclusive reemp<strong>la</strong>zo algunos de los métodos<br />
que existían anteriorm<strong>en</strong>te (Bridge et al, 1998). Uno de los requisitos para muchas de <strong>la</strong>s<br />
técnicas de ADN recombinante es <strong>la</strong> disponibilidad de grandes cantidades de un<br />
segm<strong>en</strong>to específico de ADN. El PCR permite <strong>la</strong> amplificación directa de segm<strong>en</strong>tos de<br />
ADN específicos sin clonación y puede utilizarse <strong>en</strong> fragm<strong>en</strong>tos de ADN que estén<br />
<strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> cantidades muy pequeñas. Este método se basa <strong>en</strong> <strong>la</strong> amplificación de un<br />
segm<strong>en</strong>to de ADN utilizando una polimerasa de ADN y cebadores oligonucleótidos que<br />
hibridizan con <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a complem<strong>en</strong>taria <strong>la</strong> secu<strong>en</strong>cia a amplificar. En <strong>la</strong> investigación de<br />
Fierer et al, (2005), se describe un método cuantitativo de PCR para estimar <strong>la</strong><br />
abundancia re<strong>la</strong>tiva de grupos taxonómicos de bacterias y hongos <strong>en</strong> el suelo. Los<br />
cebadores oligonucleótidos fueron probados para especificidad y el método fue aplicado<br />
a tres distintos suelos. Los resultados demostraron que <strong>la</strong> técnica provee un índice rápido<br />
y sólido de <strong>la</strong> estructura microbiana de <strong>la</strong> comunidad.<br />
El PCR comi<strong>en</strong>za con ADN de cad<strong>en</strong>a doble que conti<strong>en</strong>e <strong>la</strong> secu<strong>en</strong>cia que será<br />
amplificada y sitios complem<strong>en</strong>tarios para el par de iniciadores. Los iniciadores por lo<br />
g<strong>en</strong>eral son de 20 nucleótidos de longitud y son hechos sintéticam<strong>en</strong>te. El PCR se puede<br />
resumir <strong>en</strong> un ciclo de tres etapas fundam<strong>en</strong>tales: (1) <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a doble del ADN que se<br />
quiere amplificar se d<strong>en</strong>aturaliza <strong>en</strong> cad<strong>en</strong>as s<strong>en</strong>cil<strong>la</strong>s cal<strong>en</strong>tando a 94-95°C por un<br />
tiempo aproximado de 5 minutos; (2) <strong>la</strong> solución se <strong>en</strong>fría y los iniciadores se hibridan al<br />
ADN de cad<strong>en</strong>a s<strong>en</strong>cil<strong>la</strong> a 37-65°C, se utilizan dos iniciadores distintos ya que cada uno
19<br />
ti<strong>en</strong>e <strong>la</strong> secu<strong>en</strong>cia complem<strong>en</strong>taria a una de <strong>la</strong>s dos cad<strong>en</strong>as del ADN y se alinea con sus<br />
extremos 3’ <strong>en</strong>carados debido a que se hibridan a cad<strong>en</strong>as opuestas; (3) a <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> de <strong>la</strong><br />
reacción se le añade una ADN polimerasa resist<strong>en</strong>te al calor a 70-75°C, <strong>la</strong> cual se<br />
exti<strong>en</strong>de <strong>en</strong> dirección 5’–3’ utilizando como modelo el ADN de <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a s<strong>en</strong>cil<strong>la</strong> unido<br />
al iniciador t<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do como producto una molécu<strong>la</strong> de ADN de doble cad<strong>en</strong>a con los<br />
cebadores incorporados <strong>en</strong> el producto final. Cada grupo de tres pasos se d<strong>en</strong>omina ciclo.<br />
El proceso es automático, rápido y se realiza <strong>en</strong> un aparato de ciclos termales programado<br />
para realizar un número predeterminado de ciclos <strong>en</strong> un tiempo y temperatura dada. En el<br />
PCR, <strong>la</strong> cantidad del nuevo ADN g<strong>en</strong>erado aum<strong>en</strong>ta geométricam<strong>en</strong>te, com<strong>en</strong>zando con<br />
una molécu<strong>la</strong> de ADN, <strong>en</strong> el primer ciclo se produc<strong>en</strong> dos molécu<strong>la</strong>s de ADN, <strong>en</strong> el<br />
segundo cuatro molécu<strong>la</strong>s, <strong>en</strong> el tercero 8 molécu<strong>la</strong>s y así sucesivam<strong>en</strong>te (Russell, 2006;<br />
Klug & Cummings, 1999). En su libro Bridge et al, (1998), expone los principios y <strong>la</strong>s<br />
aplicaciones de <strong>la</strong> técnica de PCR <strong>en</strong> una variedad de áreas diversas de <strong>la</strong> micología.<br />
Entre estas se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran g<strong>en</strong>ética de los hongos, ecología microbiana, patología de <strong>la</strong>s<br />
p<strong>la</strong>ntas, micología medicinal y biotecnología de hongos. En conclusión, el PCR es una de<br />
<strong>la</strong>s herrami<strong>en</strong>tas más abarcadoras <strong>en</strong> el estudio del campo de <strong>la</strong> microbiología.<br />
Por otra parte <strong>en</strong> su libro Osborn & Smith (2005), describ<strong>en</strong> <strong>la</strong> técnica conocida<br />
como el análisis de polimorfismos de longitud de fragm<strong>en</strong>tos terminales de restricción<br />
(TRFLP) del g<strong>en</strong> 16S rADN, también conocido como el análisis de restricción de rADN<br />
amplificado (ARDRA). Este análisis es conocido porque permite <strong>la</strong> fácil comparación del<br />
rADN de bacterias ais<strong>la</strong>das o bibliotecas de clones. Los productos de PCR son obt<strong>en</strong>idos<br />
usando los iniciadores cebadores universales 16S rADN y el producto es digerido con<br />
<strong>en</strong>zimas de restricción. Los productos del PCR 16S rADN de difer<strong>en</strong>tes bacterias,
20<br />
proveyéndoles el mismo iniciador, podrían mostrar sólo una variación limitada <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
longitud. Sin embargo, los sitios de restricción se pued<strong>en</strong> <strong>en</strong>contrar <strong>en</strong> posiciones<br />
difer<strong>en</strong>tes d<strong>en</strong>tro de <strong>la</strong> secu<strong>en</strong>cia 16S rADN de difer<strong>en</strong>tes bacterias y de aquí se adhiere el<br />
producto del PCR <strong>en</strong> dos o más fragm<strong>en</strong>tos de difer<strong>en</strong>te longitud. El factor discriminante<br />
es <strong>la</strong> localización de los sitios de restricción d<strong>en</strong>tro del 16S rADN, con secu<strong>en</strong>cia<br />
específica y por lo tanto, pot<strong>en</strong>cialm<strong>en</strong>te, un taxón específico. En investigaciones<br />
realizadas por Liu et al, (1997), se trabajó con <strong>la</strong> técnica de PCR <strong>en</strong> donde uno de los dos<br />
iniciadores usados era fluoresc<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te marcado <strong>en</strong> el Terminal 5’ y fue usado para<br />
amplificar una región seleccionada del 16S rADN del ADN total de <strong>la</strong> comunidad. El<br />
producto de PCR fue digerido con <strong>en</strong>zimas de restricción y el fragm<strong>en</strong>to de restricción<br />
terminal marcado fluoresc<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te fue medido con precisión utilizando un analizador<br />
g<strong>en</strong>ético automático.<br />
Un análisis simu<strong>la</strong>do de computadoras para polimorfismos de longitud de<br />
fragm<strong>en</strong>tos terminales de restricción para 1,002 secu<strong>en</strong>cias eubacterianas mostraron que<br />
con una selección adecuada de los iniciadores del PCR y de <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción, 686<br />
secu<strong>en</strong>cias podrían ser amplificadas por PCR y c<strong>la</strong>sificadas <strong>en</strong> 233 fragm<strong>en</strong>tos de<br />
longitud de restricción terminal o ribotipos (Liu et al, 1997). Utilizando TRFLP, se fue<br />
capaz de distinguir todas <strong>la</strong>s cad<strong>en</strong>as bacterianas <strong>en</strong> un modelo de comunidad bacteriana<br />
y el patrón fue consist<strong>en</strong>te con <strong>la</strong> predicción. Los resultados demostraron que el TRFLP<br />
es una herrami<strong>en</strong>ta poderosa para determinar <strong>la</strong> diversidad de comunidades bacterianas<br />
complejas y para <strong>la</strong> comparación rápida de <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad y <strong>la</strong> diversidad<br />
de difer<strong>en</strong>tes ecosistemas.
21<br />
En conclusión, seremos capaces de predecir el desarrollo de comunidades y<br />
manejar efectivam<strong>en</strong>te los procesos que se dan <strong>en</strong> el<strong>la</strong>s, cuando com<strong>en</strong>cemos a <strong>en</strong>t<strong>en</strong>der<br />
<strong>la</strong> complejidad de <strong>la</strong>s interacciones bióticas <strong>en</strong> el suelo y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> y <strong>la</strong> manera <strong>en</strong><br />
que éstas afectan <strong>la</strong>s comunidades de p<strong>la</strong>ntas. Podemos m<strong>en</strong>cionar que el conocimi<strong>en</strong>to<br />
detal<strong>la</strong>do de los procesos ecológicos y <strong>la</strong>s interre<strong>la</strong>ciones <strong>en</strong>tre ellos, a esca<strong>la</strong>s específicas<br />
de tiempo y espacio, es integral para el manejo de los ecosistemas.<br />
Se han desarrol<strong>la</strong>do procedimi<strong>en</strong>tos analíticos s<strong>en</strong>sitivos para el estudio<br />
cuantitativo de <strong>la</strong>s comunidades naturales de microorganismos in situ. Aunque estos<br />
métodos no contestan todas <strong>la</strong>s preguntas experim<strong>en</strong>tales concerni<strong>en</strong>tes a <strong>la</strong>s<br />
comunidades <strong>microbianas</strong> naturales, éstos prove<strong>en</strong> un conjunto de herrami<strong>en</strong>tas<br />
necesarias para estudiar los microorganismos ya que pued<strong>en</strong> proveer información<br />
cuantitativa del estatus y del papel de los compon<strong>en</strong>tes más importantes del ecosistema.
Capítulo Tres<br />
Metodología<br />
Descripción del Lugar de Estudio<br />
El Bosque Experim<strong>en</strong>tal de Luquillo está ubicado <strong>en</strong> <strong>la</strong> parte noreste de Puerto<br />
Rico y compr<strong>en</strong>de cuatro zonas de vida que resultan de los cambios <strong>en</strong> elevación, clima y<br />
características de suelo (Willig, 1996). El estudio se realizó <strong>en</strong> el bosque de tabonuco<br />
(Dacryodes excelsa) <strong>en</strong> <strong>la</strong> estación El Verde, <strong>la</strong> cual está localizada <strong>en</strong> una de <strong>la</strong>s zonas<br />
de vida c<strong>la</strong>sificada como bosque subtropical montano bajo húmedo (Figura 3.01). La<br />
temperatura promedio m<strong>en</strong>sual es de 21˚C <strong>en</strong> <strong>en</strong>ero a 25˚C <strong>en</strong> septiembre (Brown et al,<br />
1983). La precipitación anual es poco cambiante (375.95 ± 79.47 cm) con valores bajos<br />
<strong>en</strong>tre <strong>en</strong>ero y abril (19.57 ± 23.71 cm) y valores altos (35.01 ± 45.99 cm) <strong>en</strong> los semanas<br />
restantes (Brown et al, 1983).<br />
Diseño Experim<strong>en</strong>tal<br />
En esta área el “Luquillo Long Term Ecological Research” (Luq–LTER)<br />
estableció tres bloques (60 x 60 m) seleccionados de acuerdo a su similitud <strong>en</strong> p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te,<br />
características de suelo, composición de especies y cobertura del dosel (Figura 3.02). Los<br />
bloques fueron divididos <strong>en</strong> cuatro parce<strong>la</strong>s (20 x 20 m), (Figura 3.03), sometidas a<br />
cuatro tratami<strong>en</strong>tos (ver sección anterior).<br />
22
23<br />
El Yunque<br />
Figura 3.01. Mapa del área este de Puerto Rico (Cortesía de <strong>la</strong> Junta de P<strong>la</strong>nificación de<br />
Puerto Rico, 1996).
24<br />
Estación<br />
del Verde<br />
186<br />
Bloque<br />
A<br />
Bloque<br />
C<br />
Bloque<br />
B<br />
Figura 3.02. Mapa topográfico del área de estudio <strong>en</strong> <strong>la</strong> Estación de El Verde<br />
(Cortesía del Servicio Geológico de Estados Unidos, 1977).
25<br />
N<br />
#<br />
#<br />
#<br />
# # # #<br />
#<br />
Bloque Block A<br />
340-360m<br />
W facing<br />
## # ## #<br />
# #<br />
#<br />
#<br />
###<br />
#<br />
# # # ## #<br />
# # ## ##<br />
#<br />
#<br />
# ###<br />
#<br />
#<br />
# ## #<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
# #<br />
# # # #<br />
# # # # #<br />
##<br />
# #<br />
#<br />
#<br />
# #<br />
#<br />
#<br />
# #<br />
#<br />
# # #<br />
#<br />
# # #<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
#<br />
# #<br />
# #<br />
##<br />
# ##<br />
#<br />
#<br />
Block Bloque C B<br />
450-470m<br />
W-NW facing<br />
Block B<br />
Bloque C<br />
450-470m<br />
450-470m<br />
NW facing<br />
Figura 3.03. Mapa del área de estudio <strong>en</strong> el Bosque Experim<strong>en</strong>tal de<br />
Luquillo, Estación El Verde mostrando los tres bloques y <strong>la</strong>s parce<strong>la</strong>s por<br />
bloque (Cortesía de “Luquillo-Long Term Ecological Research”, 1998).<br />
En cada parce<strong>la</strong> se seleccionaron cinco subparce<strong>la</strong>s y <strong>en</strong> cada una se colocaron<br />
seis canastas <strong>en</strong> donde se recolectó <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> estudiada (Figura 3.04). Las canastas<br />
plásticas (35 x 25 cm) estuvieron descubiertas y su fondo fue reemp<strong>la</strong>zado con una maya<br />
de nilón. Se cubrió el fondo de <strong>la</strong>s canastas con una porción de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo<br />
exist<strong>en</strong>te <strong>en</strong> cada subparce<strong>la</strong>. Luego se colocó una te<strong>la</strong> plástica de 1 mm <strong>en</strong> cada canasta<br />
para separar <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo de <strong>la</strong> capa de <strong>hojarasca</strong> fresca que se <strong>en</strong>contraba<br />
<strong>en</strong> el lugar. Nuevam<strong>en</strong>te se colocó otra te<strong>la</strong> plástica para separar <strong>la</strong> capa de <strong>hojarasca</strong>
26<br />
fresca de <strong>la</strong> capa de hojas verde. Es importante recordar que solo se añadió <strong>la</strong> capa de<br />
hojas verdes a <strong>la</strong> canasta <strong>en</strong> aquellos tratami<strong>en</strong>tos donde hubo adición de detrito. Se<br />
colocó otra te<strong>la</strong> plástica <strong>en</strong> cada canasta para separar <strong>la</strong>s hojas nuevas que van cay<strong>en</strong>do<br />
durante cada intervalo del muestreo, como se muestra <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 3.05. Sin embargo, el<br />
tratami<strong>en</strong>to donde el dosel es podado y <strong>la</strong> biomasa es removida sólo tuvo canastas <strong>en</strong><br />
cuatro de <strong>la</strong>s cinco subparce<strong>la</strong>s de descomposición de <strong>hojarasca</strong>, <strong>en</strong> los bloque B y C.<br />
Hojarasca de 44 a 55 semanas<br />
semanas semanas<br />
Hojarasca<br />
Nueva Hojarasca de 31 a 44 semanas<br />
Hojarasca de 17 a 31 semanas<br />
Hojarasca de 7 a 17 semanas<br />
Hojarasca caída de 0 a 7 semanas<br />
Hojas verdes<br />
Hojarasca Fresca<br />
Hojarasca sobre el suelo<br />
Figura 3.04. Diagrama de <strong>la</strong> canasta de descomposición
27<br />
Una canasta fue removida de cada subparce<strong>la</strong> durante los sigui<strong>en</strong>tes intervalos de<br />
tiempo 7, 17, 31, 44 y 55 semanas. En cada intervalo de muestreo se hizo una<br />
combinación de <strong>la</strong>s muestras recolectadas de <strong>la</strong> misma cohorte que se <strong>en</strong>contraban <strong>en</strong> <strong>la</strong>s<br />
cinco subparce<strong>la</strong>s para t<strong>en</strong>er una muestra más repres<strong>en</strong>tativa de <strong>la</strong> parce<strong>la</strong>. El<br />
experim<strong>en</strong>to com<strong>en</strong>zó <strong>en</strong>tre el 1 y el 10 de julio de 2005 y se ext<strong>en</strong>dió por un año.<br />
Figura 3.05. Foto donde se ilustran <strong>la</strong>s canastas de descomposición y <strong>la</strong><br />
remoción de una de <strong>la</strong>s canastas <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 31 semanas.
28<br />
Procedimi<strong>en</strong>to para <strong>la</strong> Colección y Manejo de <strong>la</strong> Muestra<br />
Las cinco muestras de cada parce<strong>la</strong> se mezc<strong>la</strong>ron para t<strong>en</strong>er una muestra<br />
repres<strong>en</strong>tativa de ésta. Las muestras fueron colocadas <strong>en</strong> bolsas estériles y se<br />
transportaron <strong>en</strong> neveras portátiles para luego ser almac<strong>en</strong>adas <strong>en</strong> un refrigerador a -20˚C<br />
para evitar cambios <strong>en</strong> composición (Shutter and Dick, 2000). Las muestras se obtuvieron<br />
durante los meses de agosto, octubre, <strong>en</strong>ero, abril y julio com<strong>en</strong>zando <strong>en</strong> el 2005 y<br />
terminando <strong>en</strong> el 2006.<br />
Extracción de ADN<br />
El ADN se extrajo directam<strong>en</strong>te de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> utilizando “UltraClean Soil<br />
DNA Iso<strong>la</strong>tion Kit” (MoBio Laboratorios, So<strong>la</strong>na Beach, CA). Se tomó 0.3g de cada<br />
muestra y se siguió el protocolo indicado por el manufacturero para <strong>la</strong> extracción de<br />
ADN (Apéndice 2.01).<br />
Amplificación del ADN<br />
Se utilizó “Polymerase Chain Reaction” (PCR) con el propósito de amplificar<br />
segm<strong>en</strong>tos específicos del ADN seleccionado. Se hizo un estimado de <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración<br />
de ADN de acuerdo a <strong>la</strong> int<strong>en</strong>sidad de <strong>la</strong> banda <strong>en</strong> el gel. La amplificación fue hecha<br />
utilizando <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima “Red Taq DNA Polymerase” (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), los<br />
marcadores molecu<strong>la</strong>res 16S rARN y <strong>la</strong> región interna que se transcribe (ITS) y los<br />
iniciadores oligonucleótidos que se utilizaron para <strong>la</strong>s bacterias fueron el 27F-FAM y el<br />
1525R, mi<strong>en</strong>tras que para los hongos se utilizaron el ITS1-FAM y el ITS4 (Apéndice<br />
2.02).
29<br />
Comparar Estructura de <strong>la</strong> Comunidad y Estimar Diversidad<br />
Para comparar <strong>la</strong> estructura y estimar <strong>la</strong> diversidad de <strong>la</strong>s comunidades<br />
<strong>microbianas</strong> <strong>en</strong> estudio se utilizó <strong>la</strong> técnica TRFLP. Se utilizó esta técnica ya que es<br />
s<strong>en</strong>sitiva e informativa para describir comunidades <strong>microbianas</strong>. Una vez obt<strong>en</strong>ido el<br />
amplicón, se realizó <strong>la</strong> digestión de éste con <strong>en</strong>zimas de restricción específicas, <strong>la</strong>s cuales<br />
cortarían el ADN <strong>en</strong> lugares característicos. En nuestro caso, <strong>la</strong>s <strong>en</strong>zimas de restricción<br />
utilizadas fueron MnlI para bacterias y HaeIII para hongos.<br />
La digestión procedió a 37ºC por 2 horas. Cada producto de digestión se precipitó<br />
con alcohol para ser procesados <strong>en</strong> el Analizador G<strong>en</strong>ético Automático ABI 3130<br />
(Applied Biosystems, Foster City, CA; Apéndice 2.03). Se utilizó el estándar “Liz 500<br />
size standard” (Applied Biosystem, Warrinton, UK).<br />
Análisis Estadístico<br />
Con los resultados obt<strong>en</strong>idos se preparó una matriz de 0 y 1, donde 0 repres<strong>en</strong>taba<br />
<strong>la</strong> aus<strong>en</strong>cia de un filotipo y 1 <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia del filotipo. Para comparar <strong>la</strong>s comunidades se<br />
construyeron árboles filog<strong>en</strong>éticos utilizando PAUP 4.1b10 (Swofford, 2003). De esta<br />
manera se determinaron <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong>tre <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> <strong>en</strong> cada tratami<strong>en</strong>to y <strong>la</strong> temporada de muestreo. En adición, se realizó el<br />
análisis estadístico “Two-way ANOVA” del ADN y del número de picos obt<strong>en</strong>idos al aplicar <strong>la</strong><br />
técnica de TRFLP para determinar si surgieron difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades de<br />
hongos y bacterias a través del tiempo y el tratami<strong>en</strong>to aplicado utilizando el programa MINI<br />
TAB (Versión 14). Para construir <strong>la</strong>s gráficas <strong>en</strong> <strong>la</strong>s que se pres<strong>en</strong>tan los resultados de nuestro<br />
estudio se utilizó el programa Microsoft Office Excel 2003.
Capítulo Cuatro<br />
Resultados<br />
Introducción<br />
La meta del estudio fue determinar cómo <strong>la</strong> deposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> verde y <strong>la</strong><br />
abertura del dosel <strong>en</strong> el bosque afectaban indep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te o <strong>en</strong> conjunto <strong>la</strong>s<br />
comunidades <strong>microbianas</strong> (hongos y bacterias) <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>. En otras<br />
pa<strong>la</strong>bras, se pret<strong>en</strong>día caracterizar y medir los cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión microbiana <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> luego del paso de un huracán. Con este propósito aplicamos cuatros<br />
tratami<strong>en</strong>tos distintos a nuestras áreas de estudio (ver capítulo tres) y <strong>en</strong> base a dichos<br />
tratami<strong>en</strong>tos se aplicaron diversas técnicas de análisis que nos permitieron obt<strong>en</strong>er<br />
resultados de los muestreos realizados <strong>en</strong> los distintos intervalos de tiempo.<br />
Colección de Muestras<br />
Se recolectaron un total de 135 muestras. El desglose del número de muestras<br />
resultantes de acuerdo a los intervalos de tiempo establecidos <strong>en</strong> nuestro diseño<br />
experim<strong>en</strong>tal está cont<strong>en</strong>ido <strong>en</strong> <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> 4.01. A partir de <strong>la</strong>s 31 semanas se observa una<br />
reducción <strong>en</strong> el número de muestras colectadas ya que se estuvo trabajando,<br />
exclusivam<strong>en</strong>te, con <strong>la</strong>s muestras de <strong>hojarasca</strong> fresca y <strong>la</strong>s de hojas verdes.<br />
30
31<br />
Tab<strong>la</strong> 4.01. Muestras colectadas durante los difer<strong>en</strong>tes tiempos de colección.<br />
Tiempo de muestreo (semanas)<br />
7 17 31 44 55<br />
Número de muestras colectadas 39 42 18 18 18<br />
Amplificación del ADN<br />
Al utilizar <strong>la</strong> técnica de PCR con el propósito de amplificar segm<strong>en</strong>tos específicos<br />
del ADN seleccionado, se com<strong>en</strong>zó diluy<strong>en</strong>do 2 µl de <strong>la</strong> muestra pura del ADN <strong>en</strong> 18 µl<br />
de agua deionizada estéril. La amplificación del ADN fue lograda <strong>en</strong> 60 muestras (de un<br />
total de 78) a diversas conc<strong>en</strong>traciones del ADN para bacterias, y <strong>en</strong> 68 muestras para<br />
hongos (Tab<strong>la</strong> 4.02). Se infiere <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia de sustancias inhibidoras <strong>en</strong> algunas de <strong>la</strong>s<br />
muestras a <strong>la</strong>s que no se le pudo amplificar el ADN ya que se mezcló una cantidad de<br />
ADN de muestras que fueron positivas a PCR con muestras que habían dado negativo y<br />
el resultado fue negativo. No pudimos determinar que sustancia estaba inhibi<strong>en</strong>do <strong>la</strong><br />
reacción <strong>en</strong> cad<strong>en</strong>a de <strong>la</strong> polimerasa <strong>en</strong> dichas muestras.<br />
Los datos de <strong>la</strong> amplificación del ADN de cada muestra individual se pres<strong>en</strong>tan<br />
<strong>en</strong> el Apéndice 2.01.
32<br />
Tab<strong>la</strong> 4.02. Amplificación de ADN para hongos y bacterias.<br />
Tiempo<br />
Número de<br />
Amplificación de 16S rADN<br />
Amplificación de ITS<br />
de<br />
muestras<br />
(Bacterias)<br />
(Hongos)<br />
muestreo<br />
(semanas)<br />
colectadas<br />
Negativas<br />
Dilución de Negativas<br />
ADN 1<br />
10 -1 10 -2<br />
Dilución de<br />
ADN 1<br />
10 -1 10 -2<br />
7 2 39<br />
17 42 12 13 17 10 24 8<br />
31 18 6 4 8 0 1 17<br />
44 2 18<br />
55 18 0 17 1 0 18 0<br />
1<br />
En re<strong>la</strong>ción al ADN g<strong>en</strong>ómico total extraído<br />
2<br />
No se realizó PCR a <strong>la</strong>s muestras de <strong>la</strong>s 7 y <strong>la</strong>s 44 semanas.<br />
Los resultados de <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> 4.02 reflejan que a <strong>la</strong>s 31 semanas <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración del<br />
ADN de hongos aum<strong>en</strong>tó <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras. Esto lo podemos deducir ya que durante este<br />
período hubo que diluir el ADN extraído <strong>en</strong> 17 de <strong>la</strong>s 18 muestras que se obtuvieron<br />
hasta una conc<strong>en</strong>tración de 10 -2 (2µl de ADN diluido 10 -1 <strong>en</strong> 18 µl de agua deionizada
33<br />
estéril) para obt<strong>en</strong>er resultados positivos al PCR. Por otra parte, tanto para hongos como<br />
para bacterias, <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración del ADN disminuyó a <strong>la</strong>s 55 semanas ya que para <strong>la</strong>s<br />
muestras de hongos que dieron positiva al PCR, el 100% (18 de 18) se <strong>en</strong>contraban a una<br />
conc<strong>en</strong>tración de 10 -1 (2µl de ADN extraído <strong>en</strong> 18 µl de agua deionizada estéril) y <strong>en</strong> el<br />
caso de <strong>la</strong>s muestras para bacterias, el 94% (17 de 18) se <strong>en</strong>contraban <strong>en</strong> una dilución de<br />
10 -1 .<br />
El Apéndice 2.01 pres<strong>en</strong>ta los resultados individuales de <strong>la</strong> amplificación del<br />
ADN de cada muestra de acuerdo al periodo de muestreo y a <strong>la</strong> dilución a <strong>la</strong> que se<br />
<strong>en</strong>contraba <strong>la</strong> muestra cuando resultó positivo al PCR utilizando <strong>la</strong> ADN polimerasa<br />
RedTaq. Estos datos fueron resumidos <strong>en</strong> <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> 4.02.<br />
Los resultados obt<strong>en</strong>idos al calcu<strong>la</strong>r el promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> los<br />
bloques A, B y C de acuerdo al tratami<strong>en</strong>to aplicado y al tiempo de muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s<br />
cohortes de <strong>hojarasca</strong> fresca (Tab<strong>la</strong> 4.03) y <strong>la</strong>s hojas verdes (Tab<strong>la</strong> 4.04) se utilizaron<br />
para construir <strong>la</strong>s gráficas <strong>en</strong> <strong>la</strong>s que se compara el promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> fresca (Figura 4.01) y <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes (Figura 4.02) de acuerdo al tiempo y<br />
al tratami<strong>en</strong>to aplicado.
34<br />
Tab<strong>la</strong> 4.03. Promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> los bloques A, B y C de acuerdo al<br />
tratami<strong>en</strong>to aplicado y al tiempo de muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca.<br />
Tratami<strong>en</strong>to Tiempo Promedio ADN 1 Desviación<br />
(semanas) (µg/ml) Estándar<br />
Control 7 126.50 99.64<br />
No poda + detrito 7 84.77 0.06<br />
Poda + No adición 7 151.77 227.47<br />
Poda + Detrito 7 111.87 66.40<br />
Control 17 34.17 39.99<br />
No poda + Detrito 17 29.47 27.20<br />
Poda + No adición 17 87.30 13.02<br />
Poda + Detrito 17 85.03 23.34<br />
Control 31 60.37 66.39<br />
No poda + Detrito 31 93.13 17.25<br />
Poda + No adición 31 90.93 47.30<br />
Poda + Detrito 31 64.13 47.86<br />
Control 44 26.83 9.29<br />
No poda + Detrito 44 30.27 4.27<br />
Poda + No adición 44 36.63 27.00<br />
Poda + Detrito 44 29.27 12.69<br />
Control 55 17.53 77.42<br />
No Poda + Detrito 55 27.60 22.68
35<br />
Poda + No adición 55 22.27 31.29<br />
Poda + Detrito 55 20.00 31.29<br />
1<br />
El promedio se calculó <strong>en</strong> base a los datos obt<strong>en</strong>idos al utilizar el biofotómetro para<br />
obt<strong>en</strong>er <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> cada muestra individual (Apéndice<br />
2.02, página 96). Por ejemplo, para calcu<strong>la</strong>r el promedio del ADN (µg/ml) <strong>en</strong> el intervalo<br />
de 17 semanas <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to control <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca se utilizaron los datos<br />
obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> ese intervalo para los tres bloques. En el bloque A <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración del<br />
ADN total fue de 8.10 (µg/ml), <strong>en</strong> el bloque B fue de 30.50 (µg/ml) y <strong>en</strong> el bloque C fue<br />
de 63.90 (µg/ml). Se suman estos tres datos y se divid<strong>en</strong> <strong>en</strong>tre el número de bloques, que<br />
son tres, y obt<strong>en</strong>emos que el ADN promedio <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas para el<br />
grupo control <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca fue de 34.17 (µg/ml). Este proceso se utilizó para<br />
completar <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> 4.03 y <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> 4.04.
36<br />
Tab<strong>la</strong> 4.04. Promedio del ADN (µg/ml) <strong>en</strong> los Bloques A, B y C de acuerdo al<br />
tratami<strong>en</strong>to aplicado y al tiempo de muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de hojas verdes.<br />
Tratami<strong>en</strong>to Tiempo Promedio ADN Desviación<br />
(semanas) (µg/ml) Estándar<br />
Poda + Detrito 7 140.75 162.28<br />
No poda + Detrito 7 290.43 201.62<br />
Poda + Detrito 17 57.40 28.99<br />
No poda + Detrito 17 49.23 30.28<br />
Poda + Detrito 31 38.07 17.82<br />
No poda + Detrito 31 52.77 1.59<br />
Poda + Detrito 44 28.37 12.87<br />
No poda + Detrito 44 27.07 10.15<br />
Poda + Detrito 55 15.43 1.79<br />
No poda + Detrito 55 22.30 5.59
37<br />
La información pres<strong>en</strong>tada <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.01 muestra que <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de<br />
ADN total <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca disminuye a <strong>la</strong>s 17 semanas, pero aum<strong>en</strong>ta nuevam<strong>en</strong>te<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong>s 31 semanas, excepto <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el que hubo poda y adición del detrito, el<br />
cual continuó disminuy<strong>en</strong>do hasta <strong>la</strong>s 55 semanas. Este dato corre<strong>la</strong>ciona los resultados<br />
obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> 4.02 para <strong>la</strong> comunidad de hongos, con respecto al aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
conc<strong>en</strong>tración de ADN pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras a <strong>la</strong>s 31 semanas, ya que se puede<br />
observar que durante este intervalo de tiempo <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca aum<strong>en</strong>ta <strong>en</strong> tres de los tratami<strong>en</strong>tos.<br />
En el caso de <strong>la</strong> cohorte de hojas verdes <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración del ADN total va<br />
disminuy<strong>en</strong>do a través del tiempo, excepto <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de no poda y adición del<br />
detrito, el cual tuvo un ligero aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN, pero luego continuó<br />
su trayectoria desc<strong>en</strong>d<strong>en</strong>te. En los períodos de <strong>la</strong>s 44 semanas y <strong>la</strong>s 55 semanas el ADN<br />
total (µg/ml) disminuye <strong>en</strong> todos los tratami<strong>en</strong>tos, tanto para <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca (Figura<br />
4.01) como para <strong>la</strong>s hojas verdes (Figura 4.02).
38<br />
A D N to ta l<br />
(µ g /m l)<br />
H o ja r a sc a fr e sc a (7 se m a n a s)<br />
1 6 0<br />
1 2 0<br />
8 0<br />
4 0<br />
0<br />
P o d a<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
D etrito<br />
A D N to ta l<br />
(µ g /m l)<br />
H o ja r a sc a fr e s c a (1 7 se m a n a s)<br />
1 6 0<br />
1 2 0<br />
8 0<br />
4 0<br />
0<br />
P o d a<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
D e tr ito<br />
H o ja r a sc a fr e sc a (3 1 se m a n a s)<br />
1 6 0<br />
A D N to ta l<br />
(µ g /m l)<br />
1 2 0<br />
8 0<br />
4 0<br />
0<br />
P o d a<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
D e tr ito<br />
H o ja r a sc a fr e sc a (4 4 se m a n a s)<br />
A D N to ta l<br />
(µ g /m l)<br />
1 6 0<br />
1 2 0<br />
8 0<br />
4 0<br />
0<br />
P o d a<br />
1 0<br />
1<br />
0<br />
D e tr ito<br />
H o ja r a sc a fresc a (5 5 se m a n a s )<br />
1 6 0<br />
A D N to ta l<br />
(µ g /m l)<br />
1 2 0<br />
8 0<br />
4 0<br />
0<br />
1<br />
P o d a<br />
0<br />
0<br />
1<br />
D e tr ito<br />
Figura 4.01 Comparación del promedio del ADN<br />
total (µg/ml) <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca de acuerdo al<br />
tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado. O = no poda o<br />
no adición de detrito, 1 = poda o adición de<br />
detrito.
39<br />
300<br />
250<br />
ADN total<br />
(µg/ml)<br />
200<br />
150<br />
100<br />
Poda + Detrito<br />
No poda + Detrito<br />
50<br />
0<br />
7<br />
17<br />
31<br />
Tiempo (semanas)<br />
44<br />
55<br />
Tratami<strong>en</strong>to<br />
Figura 4.02. Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes de<br />
acuerdo al tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado.
40<br />
Tab<strong>la</strong> 4.05. Resultados del análisis estadístico “Two Way ANOVA” del ADN (µg/ml)<br />
versus el tratami<strong>en</strong>to aplicado y el tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca.<br />
P<br />
P<br />
Recurso Hojas verdes Hojarasca fresca<br />
Tratami<strong>en</strong>to 0.623 0.247<br />
Tiempo (meses) 0.020 0.001<br />
Interacción 0.577 0.265<br />
Los resultados del análisis estadístico ANOVA muestran que hubo una difer<strong>en</strong>cia<br />
significativa <strong>en</strong> <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total (µg/ml) versus el tiempo que se tomó <strong>la</strong><br />
muestra, tanto <strong>en</strong> <strong>la</strong> hojas verdes (P=0.020) como <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca (P=0.001). Esta<br />
difer<strong>en</strong>cia significativa no fue observada <strong>en</strong> el ADN total (µg/ml) versus el tratami<strong>en</strong>to<br />
aplicado <strong>en</strong> ambos cohortes (Tab<strong>la</strong> 4.05). Los resultados del análisis estadístico ANOVA<br />
confirman los resultados obt<strong>en</strong>idos al calcu<strong>la</strong>r el ADN total y al realizar el PCR <strong>en</strong><br />
re<strong>la</strong>ción a que <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total cambió a través del tiempo.
41<br />
Comparación de <strong>la</strong> Estructura de <strong>la</strong> Comunidad y Estimar Diversidad<br />
De acuerdo al TRFLP de <strong>la</strong> región 16S rADN bacteriana digerida con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima<br />
de restricción MnlI, el número de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades bacterianas de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong><br />
fresca <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> que hubo poda y adición del detrito disminuyó durante el<br />
período de <strong>la</strong>s 31 semanas, pero posteriorm<strong>en</strong>te aum<strong>en</strong>tó a <strong>la</strong>s 55 semanas (Figura<br />
4.03.A-C). Por otra parte, considerando el TRFLP de <strong>la</strong> región ITS de hongos con <strong>la</strong><br />
<strong>en</strong>zima de restricción HaeIII, se pudo observar que el número de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s<br />
comunidades de hongos se mantuvo muy simi<strong>la</strong>r <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 17 y 31 semanas, pero disminuyó<br />
a <strong>la</strong>s 55 semanas para el mismo tratami<strong>en</strong>to (Figura 4.03.D-F).<br />
Si comparamos <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong>s comunidades de bacterias y hongos<br />
<strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 31 semanas, podemos observar que<br />
el número de filotipos de <strong>la</strong>s comunidades de hongos fue mayor <strong>en</strong> todos los<br />
tratami<strong>en</strong>tos. Este marcado aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el número de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades de<br />
hongos corrobora el aum<strong>en</strong>to que hubo <strong>en</strong> el ADN total (µg/ml) que se <strong>en</strong>contró a <strong>la</strong>s 31<br />
semanas (Figura 4.01) y los <strong>en</strong>contrados <strong>en</strong> <strong>la</strong> amplificación del ADN para hongos (Tab<strong>la</strong><br />
4.02).<br />
En el tratami<strong>en</strong>to donde hubo poda, sin adición del detrito, el número de filotipos<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades bacterianas fue disminuy<strong>en</strong>do desde <strong>la</strong>s 17 semanas a <strong>la</strong>s 31 semanas<br />
y <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 55 semanas no se obtuvo resultado alguno. Este resultado pudo ser causado por<br />
<strong>la</strong> falta de incorporar una fu<strong>en</strong>te de material orgánico que promoviera el desarrollo de<br />
microorganismos y por el aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> radiación so<strong>la</strong>r. En el caso de <strong>la</strong>s comunidades<br />
de hongos se <strong>en</strong>contró que el número de filotipos <strong>en</strong> éstas se mantuvo bastante uniforme<br />
<strong>en</strong> los tratami<strong>en</strong>tos aplicados <strong>en</strong>tre <strong>la</strong>s 17 y 31 semanas, ocurri<strong>en</strong>do una disminución <strong>en</strong> el
42<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas. En el caso de <strong>la</strong>s comunidades de hongos, el tratami<strong>en</strong>to que<br />
pres<strong>en</strong>tó una mayor disminución <strong>en</strong> el número de filotipos a través del tiempo fue el de<br />
poda y adición del detrito.<br />
La Figura 4.04 muestra una re<strong>la</strong>ción o t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia directa <strong>en</strong>tre el número de<br />
filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos cuando se aplicó el<br />
tratami<strong>en</strong>to de poda del dosel sin adición del detrito <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca durante los<br />
intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas (R 2 =0.8304). La re<strong>la</strong>ción muestra una t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong> que si los hongos disminuían, <strong>la</strong>s bacterias también lo hacían. En <strong>la</strong> Figura 4.05 no se<br />
pudo observar una re<strong>la</strong>ción o t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia <strong>en</strong>tre el número de filotipos de bacterias versus<br />
los de hongos cuando se aplicó el tratami<strong>en</strong>to control durante los mismos intervalos de<br />
tiempo (R 2 =0.3271). La Figura 4.06 muestra que al aplicar el tratami<strong>en</strong>to de no poda del<br />
dosel más adición del detrito se pudo observar una re<strong>la</strong>ción directa <strong>en</strong>tre el número de<br />
filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> los<br />
intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas (R 2 =0.7272). La re<strong>la</strong>ción muestra una t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong> cual cuando los hongos disminuían, <strong>la</strong>s bacterias también lo hacían. En el caso del<br />
tratami<strong>en</strong>to de poda del dosel más adición del detrito (Figura 4.07) se pudo observar una<br />
re<strong>la</strong>ción inversa <strong>en</strong>tre el número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de<br />
hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca durante los mismos intervalos de tiempo (R 2 =0.9159). La<br />
re<strong>la</strong>ción mostró una t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> <strong>la</strong> cual al aum<strong>en</strong>tar los hongos disminuían <strong>la</strong>s bacterias<br />
o por el contrario, cuando disminuían los hongos <strong>la</strong>s bacterias aum<strong>en</strong>taban.
43<br />
A<br />
Hojarasca fresca (17 semanas)<br />
D<br />
Hojarasca fresca (17 semanas)<br />
Número de<br />
filotipos de<br />
bacterias<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
100<br />
80<br />
Número de<br />
60<br />
filotipos de<br />
40<br />
hongos<br />
20<br />
0<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
AB<br />
Hojarasca fresca (31 semanas)<br />
E<br />
Hojarasca fresca (31 semanas)<br />
Número de<br />
filotipos de<br />
bacterias<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
1<br />
Poda<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
100<br />
80<br />
Número de<br />
60<br />
filotipos de<br />
40<br />
hongos<br />
20<br />
0<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
C<br />
100<br />
80<br />
Número de<br />
60<br />
filotipos de<br />
40<br />
bacterias<br />
20<br />
0<br />
Hojarasca fresca (55 semanas)<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
F<br />
100<br />
0 80<br />
Número de<br />
42.5 60<br />
filotipos de<br />
44 40<br />
hongos<br />
20<br />
0<br />
Hojarasca fresca (55 semanas)<br />
1<br />
Poda<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
Figura 4.03. Número de filotipos de bacterias (A-C) <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de<br />
<strong>hojarasca</strong> fresca de acuerdo al tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado y basados <strong>en</strong> el TRFLP de<br />
<strong>la</strong> región 16S rADN bacteriana digerida con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción MnlI. Número de<br />
filotipos de hongos (D-F) <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca de acuerdo al<br />
tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado y basados <strong>en</strong> el TRFLP de <strong>la</strong> región ITS de hongos con<br />
<strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción HaeIII. O = no poda o no adición de detrito, 1 = poda o adición<br />
de detrito.
44<br />
Número de filotipos de hongos<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
17 S<br />
55 S 31 S<br />
y = 0.2385x + 38.211<br />
R 2 = 0.8304<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80<br />
Número de filotipos de bacterias<br />
Figura 4.04. Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos<br />
de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to poda del dosel sin adición del detrito <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca<br />
<strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas.<br />
Número de filotipos de hongos<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
31 S<br />
55 S<br />
17 S<br />
y = 0.7092x + 15.061<br />
R 2 = 0.3271<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80<br />
Número de filotipos de bacterias<br />
Figura 4.05. Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos<br />
de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to control <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y<br />
55 semanas.
45<br />
Número de filotipos de hongos<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
31 S 17 S<br />
55 S<br />
y = 1.6646x - 10.139<br />
R 2 = 0.7272<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80<br />
Número de filotipos de bacterias<br />
Figura 4.06. Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos<br />
de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de no poda del dosel más adición del detrito <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong><br />
fresca <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas.<br />
Número de filotipos de hongos<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
31 S<br />
17 S<br />
55 S<br />
y = -0.6391x + 72.882<br />
R 2 = 0.9159<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80<br />
Número de filotipos de bacterias<br />
Figura 4.07. Re<strong>la</strong>ción del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos<br />
de hongos <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de poda del dosel más adición del detrito <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong><br />
fresca <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas.
46<br />
Tab<strong>la</strong> 4.06. Datos utilizados para determinar <strong>la</strong> re<strong>la</strong>ción <strong>en</strong>tre <strong>la</strong> razón del número de<br />
picos de hongos y el número de picos de bacterias versus el por ci<strong>en</strong>to de humedad de<br />
acuerdo al tratami<strong>en</strong>to aplicado <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca.<br />
Tratami<strong>en</strong>to Número de filotipos Número de filotipos Razón 1 % de humedad<br />
de hongos<br />
de bacterias<br />
Control 38 34 1.12 69.70<br />
Control 59 48 1.22 81.20<br />
Control 42 50 0.85 83.30<br />
No poda + detrito 63 45 1.40 77.86<br />
No poda + detrito 59 38 1.55 82.43<br />
No poda + detrito 44 35 1.26 82.93<br />
Poda - detrito 49 40 1.24 56.07<br />
Poda - detrito 41 22 1.86 74.68<br />
Poda - detrito 39 0 0 73.62<br />
Poda + detrito 49 46 1.08 73.00<br />
Poda + detrito 57 21 2.70 79.06<br />
Poda + detrito 27 68 0.40 78.30<br />
1<br />
La razón se obtuvo al dividir el número de filotipos de hongos versus el de bacterias.
47<br />
3<br />
Razón del núm ero de filotipos<br />
de hongos <strong>en</strong>tre el núm ero<br />
de filotipos de bacterias<br />
2.5<br />
2<br />
1.5<br />
1<br />
0.5<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90<br />
Tratami<strong>en</strong>to<br />
Poda - detrito<br />
Poda + detrito<br />
No poda + detrito<br />
Control<br />
% de humedad<br />
Figura 4.08. Razón del número de filotipos de hongos <strong>en</strong>tre el número de filotipos de<br />
bacterias versus el por ci<strong>en</strong>to de humedad <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca de acuerdo al<br />
tratami<strong>en</strong>to aplicado <strong>en</strong> los intervalo de <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas.<br />
Los datos pres<strong>en</strong>tados <strong>en</strong> <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> 4.06 fueron utilizados para determinar <strong>la</strong><br />
re<strong>la</strong>ción <strong>en</strong>tre <strong>la</strong> razón del número de picos de hongos y el número de picos de bacterias<br />
versus el por ci<strong>en</strong>to de humedad de acuerdo al tratami<strong>en</strong>to aplicado <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de<br />
<strong>hojarasca</strong> fresca mostrada <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.08. De esta figura se puede concluir que al<br />
aum<strong>en</strong>tar el por ci<strong>en</strong>to de humedad se promovió el desarrollo de hongos, especialm<strong>en</strong>te<br />
<strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de no poda más adición del detrito.
48<br />
Los resultados obt<strong>en</strong>idos del TRFLP de <strong>la</strong> región 16S rADN bacteriana digerida<br />
con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción MnlI <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes mostraron que <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de<br />
no poda más adición del detrito hubo un mayor número de filotipos a medida que<br />
transcurrió el tiempo (Figura 4.09.A). En el caso del tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el que hubo poda y<br />
adición del detrito se pudo observar una leve disminución <strong>en</strong> el número de filotipos de<br />
bacterias <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 31 semanas, seguida de un aum<strong>en</strong>to de éstos <strong>en</strong> el<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.<br />
En <strong>la</strong> Figura 4.09.B se muestra que <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de no poda más detrito el<br />
número de filotipos de hongos fue mayor <strong>en</strong> el periodo de <strong>la</strong>s 17 y 31 semanas y que <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong>s 55 semanas éstos disminuyeron. En el caso del tratami<strong>en</strong>to de poda más detrito, se<br />
observó un ligero aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el número de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad de hongos a <strong>la</strong>s 31<br />
semanas, seguido por una leve disminución <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.<br />
(Resultados basados <strong>en</strong> el TRFLP de <strong>la</strong> región ITS de hongos con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de<br />
restricción HaeIII).<br />
Hay que seña<strong>la</strong>r que cuando se compara el número de filotipos bacterianos versus<br />
el número de filotipos de hongos se observa una t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia inversa <strong>en</strong> el comportami<strong>en</strong>to<br />
de éstos. El número de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s bacterias aum<strong>en</strong>ta a través del tiempo, pero <strong>en</strong> el<br />
caso de los hongos, el número de filotipos disminuye a través del tiempo. Este resultado<br />
es más evid<strong>en</strong>te <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de no poda más detrito. Una vez los hongos actúan<br />
degradando el sustrato (compuestos recalcitrantes) <strong>la</strong>s bacterias aum<strong>en</strong>tan ya que ti<strong>en</strong><strong>en</strong><br />
los nutri<strong>en</strong>tes necesarios para colonizar el sustrato (compuestos lábiles). Este resultado es<br />
observado <strong>en</strong> <strong>la</strong>s <strong>hojarasca</strong> fresca, Figura 4.03 y <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes, Figura 4.09.
49<br />
A<br />
Número de<br />
filotipos de<br />
bacterias<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
17<br />
31<br />
Tiempo (semanas)<br />
55<br />
Poda + Detrito<br />
No poda + Detrito<br />
B<br />
Número de<br />
filotipos de<br />
hongos<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
17<br />
31<br />
Tiempo (semanas)<br />
55<br />
Poda + Detrito<br />
No poda + detrito<br />
Figura 4.09. A repres<strong>en</strong>ta el número de filotipos de bacterias <strong>en</strong>contrados <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de<br />
hojas verdes de acuerdo al tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado y basados <strong>en</strong> el TRFLP de <strong>la</strong><br />
región 16S rADN bacteriana digerida con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción MnlI. B repres<strong>en</strong>ta el<br />
número de filotipos de hongos <strong>en</strong>contrados <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de hojas verdes de acuerdo al<br />
tiempo y al tratami<strong>en</strong>to aplicado y basados <strong>en</strong> el TRFLP de <strong>la</strong> región ITS de hongos con<br />
<strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción HaeIII.
50<br />
Tab<strong>la</strong> 4.07. Resultados del análisis estadístico “Two-Way ANOVA” del número de picos<br />
obt<strong>en</strong>idos al aplicar <strong>la</strong> técnica TRFLP <strong>en</strong> hongos versus el tratami<strong>en</strong>to aplicado y el<br />
tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca.<br />
P<br />
P<br />
Recurso Hojas verdes Hojarasca fresca<br />
Tratami<strong>en</strong>to 0.114 0.916<br />
Tiempo (semanas) 0.025 0.054<br />
Interacción 0.073 0.917<br />
Los resultados del análisis estadístico ANOVA (Tab<strong>la</strong> 4.07) muestran que hubo<br />
una difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong> el número de filotipos de hongos versus el tiempo de<br />
muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes (P=0.025) y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca (P=0.054). Por otra parte,<br />
el análisis mostró que no hubo una difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong> el número de filotipos de<br />
hongos versus el tratami<strong>en</strong>to aplicado, tanto <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes (P=0.114), como <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> fresca (P=0.916). En el caso de <strong>la</strong>s comunidades de bacterias, los resultados<br />
obt<strong>en</strong>idos del análisis estadístico ANOVA muestran que no hubo difer<strong>en</strong>cias<br />
significativas <strong>en</strong> el número de filotipos de bacterias versus el tiempo y el tratami<strong>en</strong>to<br />
aplicado, tanto <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes, como <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca (Tab<strong>la</strong> 4.08).
51<br />
Tab<strong>la</strong> 4.08. Resultados del análisis estadístico “Two Way ANOVA” del número de picos<br />
obt<strong>en</strong>idos al aplicar <strong>la</strong> técnica TRFLP <strong>en</strong> bacterias versus el tratami<strong>en</strong>to aplicado y el<br />
tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes y <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca.<br />
P<br />
P<br />
Recurso Hojas verdes Hojarasca fresca<br />
Tratami<strong>en</strong>to 0.233 0.508<br />
Tiempo (semanas) 0.299 0.973<br />
Interacción 0.601 0.567
52<br />
Tab<strong>la</strong> 4.09. Por ci<strong>en</strong>to (%) de masa reman<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los Bloques A, B y C de acuerdo al<br />
tratami<strong>en</strong>to aplicado y al tiempo de muestreo <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca.<br />
Tratami<strong>en</strong>to Tiempo % de Masa Reman<strong>en</strong>te Desviación<br />
(semanas)<br />
Estándar<br />
Control 17 59.00 5.67<br />
No poda + Detrito 17 57.20 7.46<br />
Poda + No adición 17 61.30 8.64<br />
Poda + Detrito 17 62.30 7.43<br />
Control 31 46.97 1.59<br />
No poda + Detrito 31 43.47 5.27<br />
Poda + No adición 31 49.60 4.65<br />
Poda + Detrito 31 49.30 3.89<br />
Control 55 35.00 1.16<br />
No poda + Detrito 55 34.00 2.42<br />
Poda + No adición 55 45.30 4.28<br />
Poda + Detrito 55 25.90 5.11
53<br />
A<br />
100<br />
80<br />
ADN total 60<br />
(µg/ml) 40<br />
20<br />
0<br />
Hojarasca fresca (17 semanas)<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
D<br />
% de masa<br />
reman<strong>en</strong>te<br />
Hojarasca fresca (17 semanas)<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
B<br />
100<br />
80<br />
ADN total 60<br />
(µg/ml) 40<br />
20<br />
0<br />
Hojarasca fresca (31 semanas)<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
E<br />
% de masa<br />
reman<strong>en</strong>te<br />
Hojarasca fresca (31 semanas)<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
Poda<br />
1<br />
0<br />
1<br />
0<br />
Detrito<br />
C<br />
ADN total<br />
(µg/ml)<br />
Hojarasca fresca (55 semanas)<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
1<br />
Poda<br />
0<br />
1<br />
0 Detrito<br />
F<br />
% de masa<br />
reman<strong>en</strong>te<br />
Hojarasca fresca (55 semanas)<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
1<br />
Poda<br />
0<br />
1<br />
0 Detrito<br />
Figura 4.10. A-C repres<strong>en</strong>ta el ADN total extraído de 0.3 g de <strong>hojarasca</strong> fresca <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 17,<br />
31 y 55 semanas. D-F repres<strong>en</strong>ta el por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong>s 17, 31 y 55 semanas. O = no poda o no adición de detrito, 1 = poda o adición de<br />
detrito.
54<br />
En investigaciones realizadas por <strong>la</strong> Dra. Jean Lodge <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma área de estudio,<br />
ésta <strong>en</strong>contró que el por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca fue muy<br />
uniforme <strong>en</strong> todos los tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas (Lodge, datos no<br />
publicados) (Tab<strong>la</strong> 4.09). Al com<strong>en</strong>zar nuestra investigación <strong>la</strong> Dra. Lodge buscó <strong>la</strong> masa<br />
de <strong>la</strong>s capas de <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo, <strong>la</strong> de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca y <strong>la</strong> de <strong>la</strong>s hojas verdes<br />
(<strong>en</strong> los tratami<strong>en</strong>tos que hubo adición de detrito) que fueron colocadas <strong>en</strong> todas <strong>la</strong>s<br />
canasta como se explica <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 3.04. El por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te se calculó<br />
luego de haber retirado los 2 gramos que fueron utilizados para realizar el análisis<br />
microbiano. Después de haber retirado los 2 gramos de cada muestra se procedió a buscar<br />
<strong>la</strong> masa de éstas con el propósito de calcu<strong>la</strong>r el por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te.<br />
Finalm<strong>en</strong>te, el por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te se calculó utilizando los datos que se<br />
obtuvieron al com<strong>en</strong>zar <strong>la</strong> investigación para <strong>la</strong> masa de cada muestra y los que se<br />
obtuvieron después de cada muestreo. Si comparamos estos resultados con los obt<strong>en</strong>idos<br />
al calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total <strong>en</strong> nuestra investigación <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s<br />
17 semanas veremos que <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total disminuyó drásticam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los<br />
tratami<strong>en</strong>tos donde no hubo poda. En el intervalo de <strong>la</strong>s 31 semanas el por ci<strong>en</strong>to de masa<br />
reman<strong>en</strong>te disminuyó, pero se mantuvo uniforme <strong>en</strong>tre los tratami<strong>en</strong>tos (Figura 4.10). Por<br />
otra parte, <strong>en</strong> re<strong>la</strong>ción a <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total durante este intervalo de tiempo,<br />
se pudo observar un marcado aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN <strong>en</strong> los tratami<strong>en</strong>tos<br />
donde no hubo poda y una reducción <strong>en</strong> <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong><br />
donde hubo poda y adición del detrito. Durante <strong>la</strong>s 55 semanas el por ci<strong>en</strong>to de masa<br />
reman<strong>en</strong>te se mantuvo muy simi<strong>la</strong>r al de <strong>la</strong>s 31 semanas <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el cual hubo<br />
poda y no adición del detrito. En el resto de los tratami<strong>en</strong>tos hubo una marcada reducción
55<br />
<strong>en</strong> el por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te, <strong>en</strong> especial, <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el cual hubo poda y<br />
adición del detrito. En re<strong>la</strong>ción a <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55<br />
semanas, se pudo observar una reducción drástica de ésta <strong>en</strong> todos los tratami<strong>en</strong>tos.<br />
En términos de <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong><br />
nuestras áreas de estudio, los resultados pres<strong>en</strong>tados <strong>en</strong> el c<strong>la</strong>dograma (Figura 4.11)<br />
indican que <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad de bacterias, hay un apar<strong>en</strong>te agrupami<strong>en</strong>to<br />
de éstas basado <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to donde hubo poda del dosel o donde no hubo poda y por<br />
el tiempo. Este resultado se puede observar <strong>en</strong> los c<strong>la</strong>dos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras A, B y<br />
C cuando se agruparon <strong>en</strong> base al tratami<strong>en</strong>to y D para <strong>la</strong>s que se agruparon <strong>en</strong> base al<br />
tiempo (Figura 4.11.A). Por otro <strong>la</strong>do, <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad de los hongos se<br />
observa que éstos se agruparon de acuerdo a los tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> los cuales hubo adición o<br />
no adición del detrito, por el tipo de cohorte de hojas y por el tiempo. Este dato se<br />
observa <strong>en</strong> los c<strong>la</strong>dos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras E, F y G cuando se agruparon <strong>en</strong> base a los<br />
tratami<strong>en</strong>tos e I para los que se agruparon <strong>en</strong> base al tiempo (Figura 4.11. B).
56<br />
HN 17 s<br />
HF 17 s<br />
E<br />
HF 31 s<br />
HF 55 s<br />
HF 31 s<br />
HV 17 s<br />
HV 31 s<br />
HF 17 s<br />
HF 17 s<br />
HV 17 s<br />
HN 17 s<br />
A<br />
B<br />
HF 55 s<br />
HV 55 s<br />
HF 55 s<br />
HV 55 s<br />
s<br />
HF 17 s<br />
HF 17 s<br />
HF 55 s<br />
HF 31 s<br />
F<br />
G<br />
HF 55 s<br />
s<br />
HF 55 s<br />
HN 17 s<br />
HN 17 s<br />
HF 31 s<br />
HV 31 s<br />
HF 31 s<br />
HF 31 s<br />
HF 17 s<br />
C<br />
HV 17 s<br />
s<br />
HN 17 s<br />
s<br />
HN 17 s<br />
s<br />
HF 17 s<br />
s<br />
HV 31s<br />
HF 31 s<br />
I<br />
HV 55 s<br />
HF 55 s<br />
D<br />
HV 17 s<br />
HV 31 s<br />
H<br />
HV 55 s<br />
HF 31 s<br />
A<br />
HN 17 s<br />
B<br />
HF 31 s<br />
Control<br />
No poda + detrito<br />
Poda + detrito<br />
Poda + no detrito<br />
Figura 4.11. C<strong>la</strong>dograma del TRFLP de <strong>la</strong>s combinaciones de <strong>la</strong>s muestras que dieron<br />
positivo al PCR mostrando <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong> comunidad de bacterias (A) y hongos (B)<br />
<strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes cohortes de hojas y <strong>en</strong> los tratami<strong>en</strong>tos. Las sig<strong>la</strong>s HF seña<strong>la</strong>n <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> fresca; HN seña<strong>la</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> nueva y HV repres<strong>en</strong>ta <strong>la</strong>s hojas verdes. La letra<br />
S repres<strong>en</strong>ta <strong>la</strong> unidad de tiempo <strong>en</strong> semana.
57<br />
A partir de <strong>la</strong> selección de varias muestras a <strong>la</strong>s que se les aplicó <strong>la</strong> técnica de<br />
TRFLP, se obtuvo el mapa g<strong>en</strong>ético de los distintos filotipos que <strong>la</strong>s conformaban. La<br />
Figura 4.12 muestra el número de filotipos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad bacteriana cuando<br />
se aplica el tratami<strong>en</strong>to control <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca. La composición de <strong>la</strong><br />
comunidad bacteriana se observa difer<strong>en</strong>te y cambia a partir de <strong>la</strong>s 17 semanas, pero no<br />
se observa una difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong>tre <strong>la</strong>s comunidades <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 31 y<br />
55 semanas. Este dato puede ser seña<strong>la</strong>do con el filotipo marcado con <strong>la</strong> letra A, el cual<br />
surge <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 31 semanas y perdura hasta <strong>la</strong>s 55 semanas, pero no se<br />
<strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad de bacterias pres<strong>en</strong>te a <strong>la</strong>s 17 semanas. En el caso de <strong>la</strong><br />
comunidad de hongos para <strong>la</strong> misma cohorte y tratami<strong>en</strong>to se <strong>en</strong>contró que hubo una<br />
difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong> <strong>la</strong> riqueza de filotipos que se obtuvieron. La composición de <strong>la</strong><br />
comunidad de hongos cambia a través del tiempo, este dato se puede corroborar al<br />
observar <strong>la</strong> Figura 4.13. En el intervalo de <strong>la</strong>s 31 semanas no se observan filotipos que<br />
estuvieran <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> a <strong>la</strong>s 17 semanas, por ejemplo, los filotipos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras<br />
A y B. Por otra parte, <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 31 semanas surg<strong>en</strong> filotipos que no estaban <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong>s<br />
17 semanas, como los filotipos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras C, D y E. En el intervalo de <strong>la</strong>s 55<br />
semanas se observan filotipos que no estaban <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 17 y 31 semanas, por<br />
ejemplo, los filotipos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras F y G. Es importante recordar que <strong>en</strong> el<br />
tratami<strong>en</strong>to control no hubo poda ni adición de detrito, pero a pesar de este hecho <strong>la</strong><br />
composición de <strong>la</strong>s comunidades de bacterias y de hongos cambiaron a través del tiempo.<br />
Este dato nos muestra que hubo un efecto de temporalidad <strong>en</strong> los resultados obt<strong>en</strong>idos<br />
que pudo haber surgido por <strong>la</strong> disponibilidad de nutri<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> cada intervalo de muestreo.
58<br />
17 semanas<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
31 semanas<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
55 semanas<br />
A<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.12. Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca del bloque A<br />
que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to control a través del<br />
tiempo (17, 31 y 55 semanas). La letra A repres<strong>en</strong>ta filotipo que se repite <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
comunidad de bacterias a <strong>la</strong>s 17 y 55 semanas. Las letras pb repres<strong>en</strong>tan los pares de<br />
bases.
59<br />
17 semanas<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
A<br />
31 semanas<br />
B<br />
d<br />
e<br />
C<br />
D<br />
E<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
55 semanas<br />
F<br />
G<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.13. Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca del bloque A<br />
que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to control a través del<br />
tiempo (17, 31 y 55 semanas). Las letras A, B, C, D, E, F y G repres<strong>en</strong>tan filotipos<br />
<strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad de hongos a través del tiempo.
60<br />
Si comparamos los resultados pres<strong>en</strong>tados <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.12 con los que se<br />
muestran <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.13 podemos concluir que hubo una mayor variabilidad <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
composición de <strong>la</strong> comunidad de hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca versus <strong>la</strong> de<br />
bacterias a través del tiempo cuando se aplicó el tratami<strong>en</strong>to control. Estos resultados<br />
coincid<strong>en</strong> con los <strong>en</strong>contrados <strong>en</strong> <strong>la</strong> técnica de análisis ANOVA (Tab<strong>la</strong>s 4.07 y Tab<strong>la</strong><br />
4.08).<br />
La Figura 4.14 muestra el perfil de TRFLP de <strong>la</strong>s muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicó<br />
el tratami<strong>en</strong>to de no poda más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas. Se<br />
puede observar que aún d<strong>en</strong>tro de <strong>la</strong> misma canasta <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad<br />
bacteriana cambia. Aunque cabe seña<strong>la</strong>r que hay filotipos que se manti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> todas <strong>la</strong>s<br />
cohortes de <strong>la</strong> canasta, por ejemplo, el filotipo seña<strong>la</strong>do con <strong>la</strong> letra A. Por otra parte, hay<br />
filotipos que se mantuvieron <strong>en</strong> algunas cohortes, pero no se mostraban <strong>en</strong> el resto de<br />
éstas. Por ejemplo, el filotipo seña<strong>la</strong>do con <strong>la</strong> letra B se pres<strong>en</strong>ta <strong>en</strong> <strong>la</strong>s cohortes de<br />
<strong>hojarasca</strong> sobre el suelo y <strong>la</strong> de hojas verdes, pero no se pres<strong>en</strong>ta <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca y<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas nuevas. Si comparamos <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad bacteriana <strong>en</strong> el<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas con <strong>la</strong> composición de esta misma comunidad <strong>en</strong> el intervalo<br />
de <strong>la</strong>s 55 semanas (Figura 4.15) podremos observar como ésta cambia a través del<br />
tiempo. Hay que seña<strong>la</strong>r que <strong>en</strong> esta figura hay filotipos que permanec<strong>en</strong> <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong><br />
ambos cohortes, por ejemplo, el filotipo seña<strong>la</strong>do con <strong>la</strong> letra A. En <strong>la</strong> Figura 4.15 se<br />
muestran únicam<strong>en</strong>te <strong>la</strong>s cohortes de <strong>hojarasca</strong> fresca y hojas verdes ya que se trabajó<br />
exclusivam<strong>en</strong>te con estas cohortes a partir de <strong>la</strong>s 31 semanas. Al observar <strong>la</strong> Figura 4.15<br />
se puede constatar que los filotipos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras A y B <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.14 no
61<br />
están <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> ésta a pesar de que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta y se les aplicó el<br />
mismo tratami<strong>en</strong>to. Este resultado evid<strong>en</strong>cia que <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad<br />
bacteriana pres<strong>en</strong>tó un cambio más pronunciado a través del tiempo versus el que ocurrió<br />
d<strong>en</strong>tro de <strong>la</strong> misma canasta durante el mismo intervalo de tiempo.<br />
La Figura 4.16 muestra como <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad de hongos cambió<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>tes cohortes que se <strong>en</strong>contraba d<strong>en</strong>tro de <strong>la</strong> misma canasta del bloque A y a<br />
<strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no poda más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s<br />
17 semanas. Se observa una gran variedad <strong>en</strong> los filotipos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong>s distintas<br />
cohortes (por ejemplo, ver los filotipos cont<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> <strong>la</strong> figura seña<strong>la</strong>da con <strong>la</strong> letra A),<br />
pero cabe seña<strong>la</strong>r que <strong>en</strong> esta figura hay filotipos que se pres<strong>en</strong>tan <strong>en</strong> más de una cohorte,<br />
por ejemplo, los filotipos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras B y C. Cuando se compara <strong>la</strong><br />
composición de <strong>la</strong>s comunidades de hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de hojas verdes y hojas frescas<br />
<strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas con <strong>la</strong> de <strong>la</strong>s 17 semanas se puede observar como <strong>la</strong><br />
composición y <strong>la</strong> riqueza de los filotipos de esta comunidad cambia a través del tiempo<br />
(Figura 4.17). Se puede indicar que el cambio <strong>en</strong> <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad de<br />
hongos fue más pronunciada y evid<strong>en</strong>te que <strong>en</strong> <strong>la</strong> de <strong>la</strong> comunidad de bacterias (Figura<br />
4.14 y Figura 4.15).
62<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojas nuevas<br />
Hojas verdes<br />
B<br />
Hojarasca fresca<br />
Hojarasca sobre el suelo<br />
B<br />
A<br />
A<br />
A<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.14. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no<br />
poda más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas.
63<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
Hojas verdes<br />
A<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojarasca fresca<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.15. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no<br />
poda más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.
64<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojas nuevas<br />
Hojas verdes<br />
Hojarasca fresca<br />
C<br />
Hojarasca sobre el suelo<br />
B<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.16. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no poda<br />
más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas. La letra A repres<strong>en</strong>ta un filotipo<br />
seña<strong>la</strong>do.
65<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
d<br />
e<br />
Hojas verdes<br />
A<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojarasca fresca<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.17. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de no poda<br />
más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.
66<br />
En <strong>la</strong>s Figuras 4.18 y 4.19 se continua observando el mismo patrón <strong>en</strong> re<strong>la</strong>ción a<br />
los cambios que ocurrieron <strong>en</strong> <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad bacteriana <strong>en</strong> los<br />
intervalos de <strong>la</strong>s 17 y 55 semanas cuando se trabajó con <strong>la</strong>s muestras de <strong>la</strong>s distintas<br />
cohortes d<strong>en</strong>tro de una misma canasta, pero <strong>en</strong> este caso se aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda<br />
más adición del detrito. En el caso de <strong>la</strong> comunidad de bacterias se observa como cambia<br />
<strong>la</strong> composición de ésta <strong>en</strong> <strong>la</strong>s distintas cohortes. Por ejemplo, los filotipos delimitados por<br />
<strong>la</strong> figura seña<strong>la</strong>da con <strong>la</strong> letra A muestran como varia <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad<br />
cuando pasamos al intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas. En el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas (Figura<br />
4.19) no se observan los filotipos que estaban <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.18. Nuevam<strong>en</strong>te<br />
se muestra un efecto de temporalidad ya que aún d<strong>en</strong>tro de <strong>la</strong> misma canasta se pudo<br />
observar como <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad bacteriana cambia a través del tiempo.<br />
En <strong>la</strong> Figura 4.20 se observa una disminución drástica <strong>en</strong> el número de filotipos<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo cuando se aplica el tratami<strong>en</strong>to de poda más<br />
adición del detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas. Se muestra una difer<strong>en</strong>cia<br />
significativa <strong>en</strong> <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad de hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo<br />
versus <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca y <strong>la</strong> de hojas nuevas. A pesar de este hecho, se<br />
<strong>en</strong>contraron filotipos comunes <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> sobre el suelo y <strong>la</strong> de <strong>hojarasca</strong><br />
fresca, por ejemplo, el filotipo seña<strong>la</strong>do con <strong>la</strong> letra A. La composición de <strong>la</strong> comunidad<br />
de hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca y <strong>la</strong> cohorte de hojas nuevas pres<strong>en</strong>ta un<br />
mayor número y riqueza de filotipos. Por ejemplo, los filotipos seña<strong>la</strong>dos con <strong>la</strong>s letras B<br />
y C. En <strong>la</strong> Figura 4.21 se observa como <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad de hongos<br />
pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.20 <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas cambió <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s<br />
55 semanas.
67<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojas nuevas<br />
Hojarasca fresca<br />
Hojarasca sobre el suelo<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.18. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda<br />
más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas.
68<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojas verdes<br />
Hojarasca fresca<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.19. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda<br />
más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.
69<br />
Para poder comparar <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad de hongos <strong>en</strong> ambas figuras<br />
t<strong>en</strong>emos que referirnos a <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca. En base a este hecho podemos<br />
decir que surgieron cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad de hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> fresca a través del tiempo ya que <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas surgieron<br />
filotipos que no estuvieron pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 17 semanas. Por ejemplo, los filotipos<br />
cont<strong>en</strong>ido <strong>en</strong> <strong>la</strong>s figuras seña<strong>la</strong>das con <strong>la</strong>s letras A y D. Por otra parte, hay que indicar<br />
que los filotipos seña<strong>la</strong>dos <strong>en</strong> el perfil de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca con <strong>la</strong>s letras B y C <strong>en</strong> el<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas (Figura 4.20) continúan pres<strong>en</strong>tándose <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s<br />
55 semanas, no solo <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca, sino que también se pres<strong>en</strong>tan <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas<br />
verdes. Esto nos puede indicar que parte de <strong>la</strong> comunidad de hongos originales se está<br />
restableci<strong>en</strong>do <strong>en</strong> el intervalo de un año o que éstos han logrado adaptarse y subsistir a<br />
través del tiempo.<br />
La Figura 4.22 pres<strong>en</strong>ta muestras de <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca y del bloque A<br />
que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicaron distintos tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> el<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas. Hay que seña<strong>la</strong>r <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia de un mayor número de<br />
filotipos <strong>en</strong> aquellos tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> donde no hubo poda versus los tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> que sí<br />
hubo poda. Podríamos inferir que <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong> comunidad de bacterias no se<br />
restablece completam<strong>en</strong>te de los efectos de un huracán o que ésta cambia <strong>en</strong> un período<br />
de 55 semanas, aunque estén d<strong>en</strong>tro del mismo bloque. En el caso de <strong>la</strong> composición de<br />
<strong>la</strong> comunidad de hongos para el mismo tratami<strong>en</strong>to e intervalo de tiempo, se observó una<br />
disminución <strong>en</strong> el número de filotipos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> todos los tratami<strong>en</strong>tos d<strong>en</strong>tro del<br />
mismo bloque (Figura 4.23).
70<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojas nuevas<br />
C<br />
B<br />
Hojarasca fresca<br />
C<br />
B<br />
A<br />
Hojarasca sobre el suelo<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.20. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda<br />
más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 17 semanas.
71<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
Hojas verdes<br />
C<br />
B<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Hojarasca fresca<br />
C<br />
B<br />
A<br />
D<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.21. Perfil de TRFLP de muestras de difer<strong>en</strong>tes cohortes <strong>en</strong> <strong>la</strong> misma canasta del<br />
bloque A que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s que se les aplicó el tratami<strong>en</strong>to de poda<br />
más adición de detrito <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.
72<br />
Hay que seña<strong>la</strong>r que aunque se observó una reducción <strong>en</strong> el número de filotipos<br />
<strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad de hongos durante este intervalo de tiempo hubo filotipos que<br />
se <strong>en</strong>contraron <strong>en</strong> prácticam<strong>en</strong>te todos los tratami<strong>en</strong>tos, excepto <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to control.<br />
Este es el caso del filotipo seña<strong>la</strong>do con <strong>la</strong> letra A. Si comparamos <strong>la</strong> composición de <strong>la</strong><br />
comunidad de bacterias (Figura 4.22) con <strong>la</strong> de <strong>la</strong> comunidad de hongos (Figura 4.23)<br />
podríamos concluir que <strong>en</strong> el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas el número de filotipos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong><br />
<strong>en</strong> todos los tratami<strong>en</strong>tos fue mayor para <strong>la</strong> comunidad de bacterias, especialm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los<br />
tratami<strong>en</strong>tos donde no hubo poda.<br />
En resum<strong>en</strong>, podemos decir que los resultados de los distintos análisis<br />
microbianos mostraron, al aplicar los difer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> nuestra área de estudio,<br />
que hubo cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión microbiana a través del tiempo, especialm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> el<br />
caso de los hongos. Los resultados obt<strong>en</strong>idos del TRFLP para <strong>la</strong> región 16S rADN<br />
bacteriana digerida con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción MnlI y el TRFLP de <strong>la</strong> región ITS de<br />
hongos con <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima de restricción HaeIII corroboran lo anteriorm<strong>en</strong>te expuesto ya que<br />
cuando se aplicó el análisis estadístico ANOVA a estos resultados se <strong>en</strong>contró que hubo<br />
una difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong> el número de filotipos de hongos a través del tiempo. En el<br />
caso de <strong>la</strong>s bacterias hubo cambios <strong>en</strong> el número de filotipos a través del tiempo, pero <strong>la</strong><br />
difer<strong>en</strong>cia no fue significativa. Otro aspecto importante fue que los electroferogramas<br />
mostraron que, <strong>en</strong> el caso de los hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca, hubo un mayor número de<br />
filotipos <strong>en</strong> los tratami<strong>en</strong>tos donde no hubo poda o <strong>en</strong> los que hubo adición del detrito. En<br />
adición, se pudo observar que había variedad de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s cohortes que se<br />
<strong>en</strong>contraban d<strong>en</strong>tro de una misma canasta del mismo bloque y durante el mismo intervalo<br />
de tiempo.
73<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
Control<br />
No poda + detrito<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Poda - detrito<br />
Poda + detrito<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.22. Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca del bloque A<br />
que dieron positivo a bacterias y a <strong>la</strong>s que se les aplicaron distintos tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> el<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.
74<br />
U<br />
n<br />
i<br />
d<br />
a<br />
d<br />
e<br />
s<br />
Control<br />
No poda + detrito<br />
d<br />
e<br />
f<br />
l<br />
u<br />
o<br />
r<br />
e<br />
s<br />
c<br />
e<br />
n<br />
c<br />
i<br />
a<br />
Poda - detrito<br />
Poda + detrito<br />
A<br />
A<br />
A<br />
Longitud de fragm<strong>en</strong>to terminal (pb)<br />
Figura 4.23. Perfil de TRFLP de muestras de <strong>la</strong> cohorte de <strong>hojarasca</strong> fresca del bloque A<br />
que dieron positivo a hongos y a <strong>la</strong>s que se les aplicaron distintos tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> el<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas.
75<br />
En re<strong>la</strong>ción al número de filotipos obt<strong>en</strong>idos del TRFLP para <strong>la</strong> comunidad de<br />
hongos <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca podemos decir que hubo un mayor número de filotipos de<br />
hongos <strong>en</strong> prácticam<strong>en</strong>te todos los tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17 y 31 semanas.<br />
En términos de <strong>la</strong>s hojas verdes se observó que hubo un mayor número de filotipos de<br />
bacterias <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de no poda más detrito durante el intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas,<br />
mi<strong>en</strong>tras que para los hongos el número de filotipos fue mayor <strong>en</strong> los intervalos de <strong>la</strong>s 17<br />
y 31 semanas. Este dato puede sugerirnos que <strong>en</strong> los hojas verdes <strong>la</strong> comunidad de<br />
bacterias empieza a recuperarse de los efectos de un disturbio <strong>en</strong> aproximadam<strong>en</strong>te un<br />
año. Se observó una t<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> <strong>la</strong> cual después que <strong>la</strong> comunidad de hongos actuaba<br />
descomponi<strong>en</strong>do <strong>la</strong> materia orgánica se podía observar un aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad de<br />
bacterias, es decir, cuando los hongos aum<strong>en</strong>taban <strong>la</strong>s bacterias disminuían o por el<br />
contrario, cuando los hongos disminuían <strong>la</strong>s bacterias aum<strong>en</strong>taban.
Capítulo Cinco<br />
Discusión<br />
El estudio pret<strong>en</strong>día medir los cambios <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura microbiana <strong>en</strong> respuesta a<br />
los difer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos y sus efectos re<strong>la</strong>tivos <strong>en</strong> los organismos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
sucesión de descomposición del material orgánico. Los objetivos del estudio incluían<br />
analizar <strong>la</strong> composición y estructura de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> por<br />
medio de <strong>la</strong> técnica de TRFLP, determinar si hubo alguna difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong>tre<br />
<strong>la</strong>s áreas de estudio y difer<strong>en</strong>tes niveles de descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> y determinar<br />
organismos <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> sucesión <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>.<br />
La actividad microbiana es responsable de una gran parte de <strong>la</strong> descomposición.<br />
Los difer<strong>en</strong>tes grupos de descomponedores microbianos se han adaptado a degradar<br />
diversos tipos de recursos y, <strong>en</strong> adición, se han adaptado a difer<strong>en</strong>tes condiciones<br />
ambi<strong>en</strong>tales, dirigi<strong>en</strong>do <strong>la</strong> sucesión de <strong>la</strong> comunidad microbiana al descomponer <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> (Lodge, 1996). Los compuestos lábiles son degradados, <strong>en</strong> primer lugar, por <strong>la</strong>s<br />
bacterias de crecimi<strong>en</strong>to rápido y por los hongos azúcares, mi<strong>en</strong>tras que los recursos<br />
recalcitrantes (ej. lignina) pued<strong>en</strong> ser descompuestos más tarde, primeram<strong>en</strong>te por<br />
hongos, especialm<strong>en</strong>te por basidiomicetos de producción b<strong>la</strong>nca que utilizan <strong>la</strong>s bandas<br />
de <strong>la</strong>s hifas para colonizar nuevos recursos y para importar nutri<strong>en</strong>tes de su fu<strong>en</strong>te de<br />
alim<strong>en</strong>tos previa (Miller and Lodge, 1997). La degradación de <strong>la</strong> lignocelulosa por los<br />
hongos de producción b<strong>la</strong>nca provee variedad <strong>en</strong> los recursos adicionales que son<br />
descompuestos por otros microbios, dirigi<strong>en</strong>do los nuevos cambios de <strong>la</strong> comunidad<br />
microbiana. Los disturbios que ocasionan <strong>la</strong> apertura del dosel y depositan el detrito,<br />
76
77<br />
tanto de actividades naturales (ej. huracanes) como antropogénicas (ej. esparcimi<strong>en</strong>to)<br />
pued<strong>en</strong> afectar significativam<strong>en</strong>te <strong>la</strong>s comunidades de descomponedores microbianos y <strong>la</strong><br />
tasa de descomposición, a través de sus efectos <strong>en</strong> el ambi<strong>en</strong>te del suelo del bosque y <strong>la</strong><br />
calidad de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> (Miller and Lodge, 1997).<br />
En términos de <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total se establece que no hubo una<br />
difer<strong>en</strong>cia significativa de éste <strong>en</strong>tre los bloques, tratami<strong>en</strong>tos y cohortes de <strong>la</strong>s hojas,<br />
pero si fue significativam<strong>en</strong>te difer<strong>en</strong>te a través del tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca<br />
(P=0.001). En el tratami<strong>en</strong>to donde hubo poda y adición del detrito <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración del<br />
ADN fue mayor <strong>en</strong> <strong>la</strong>s 7 y 17 semanas si se compara con el resto de los intervalos de<br />
muestreo (Figura 4.01). La colonización de hongos basidiomicetos es promovida <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> fresca. La tasa de descomposición pudo aum<strong>en</strong>tar debido al aum<strong>en</strong>to re<strong>la</strong>tivo<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> humedad de <strong>la</strong> capa de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca cubierta y al movimi<strong>en</strong>to de nutri<strong>en</strong>tes de<br />
<strong>la</strong>s hojas verdes que están sobre el<strong>la</strong>s. Los cambios <strong>en</strong> humedad, profundidad de <strong>la</strong><br />
<strong>hojarasca</strong> y <strong>la</strong> alta conc<strong>en</strong>tración de nutri<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes pudieron interactuar y<br />
de esta manera influ<strong>en</strong>ciar <strong>la</strong> tasa de descomposición <strong>en</strong> <strong>la</strong> capa de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca<br />
pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> el suelo, además de <strong>la</strong>s hojas verdes. La tasa de descomposición pudo ser más<br />
rápida <strong>en</strong> este tratami<strong>en</strong>to como muestra el bajo por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te <strong>en</strong> el<br />
intervalo de <strong>la</strong>s 55 semanas pres<strong>en</strong>tado <strong>en</strong> <strong>la</strong> Figura 4.10.F (Lodge, datos no publicados).<br />
El clímax de <strong>la</strong> comunidad microbiana es más rápido <strong>en</strong> este tratami<strong>en</strong>to, como muestra<br />
<strong>la</strong> disminución de ADN a <strong>la</strong>s 31 semanas (Figura 4.10.B). Es el único tratami<strong>en</strong>to donde<br />
el ADN disminuye durante este intervalo de tiempo.<br />
La alta conc<strong>en</strong>tración de ADN <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to de poda sin adición del detrito<br />
pudo estar causada por <strong>la</strong> aus<strong>en</strong>cia de hongos basidiomicetos. Cuando los hongos
78<br />
basidiomicetos no están <strong>pres<strong>en</strong>tes</strong> <strong>en</strong> el sustrato, <strong>la</strong>s bacterias y los hongos azúcares<br />
pued<strong>en</strong> colonizarlo. Por tanto, <strong>la</strong> alta conc<strong>en</strong>tración de ADN <strong>en</strong> este tratami<strong>en</strong>to pudo<br />
estar dirigida por estos microorganismos (Figura. 4.10.A). Este resultado está sust<strong>en</strong>tado<br />
por el alto por ci<strong>en</strong>to de masa reman<strong>en</strong>te que se obtuvo a <strong>la</strong>s 55 semanas <strong>en</strong> el<br />
tratami<strong>en</strong>to, mostrando que <strong>la</strong> descomposición fue más l<strong>en</strong>ta <strong>en</strong> aus<strong>en</strong>cia de hongos<br />
basidiomicetos (Figura 4.10.F) (Lodge, datos no publicados). La aceleración de <strong>la</strong><br />
descomposición temprana <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas por algunos hongos basidiomicetos puede ser<br />
atribuida, <strong>en</strong> parte, a su capacidad de colonizar rápidam<strong>en</strong>te el sustrato y a su capacidad<br />
de mover los nutri<strong>en</strong>tes, <strong>la</strong>s cuales les permit<strong>en</strong> convertir <strong>la</strong> biomasa <strong>en</strong> nuevos recursos<br />
cuando <strong>la</strong> incorporación de nutri<strong>en</strong>tes es mínima (Lodge et al, 2008). Al no incorporar<br />
una fu<strong>en</strong>te de material orgánico se disminuyó el desarrollo de los microorganismos,<br />
particu<strong>la</strong>rm<strong>en</strong>te, los hongos. Por tal razón <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> el suelo se<br />
descompone más l<strong>en</strong>tam<strong>en</strong>te que <strong>en</strong> los otros tratami<strong>en</strong>tos ya que <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de<br />
nutri<strong>en</strong>tes declina rápidam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> exist<strong>en</strong>te debido a <strong>la</strong> pérdida de nutri<strong>en</strong>tes<br />
de los microbios y al aum<strong>en</strong>to de <strong>la</strong> radiación del sol. El tamaño de <strong>la</strong> abertura del dosel<br />
es determinante <strong>en</strong> <strong>la</strong>s actividades de <strong>la</strong> descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> (Quishui and<br />
Zak, 1995). En este tratami<strong>en</strong>to se observó una disminución <strong>en</strong> el número de filotipos a<br />
través del tiempo ya que al realizarse <strong>la</strong> poda del dosel, y al retirar el detrito se disminuye<br />
<strong>la</strong> sucesión de descomposición de <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> (Figura 4.03.A–C). Los resultados del<br />
análisis estadístico ANOVA confirmaron que no hubo una difer<strong>en</strong>cia significativa <strong>en</strong> el<br />
número de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades de bacterias <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca a través del<br />
tiempo.
79<br />
El clímax de <strong>la</strong> comunidad microbiana es más l<strong>en</strong>to <strong>en</strong> el tratami<strong>en</strong>to donde no se<br />
poda el dosel, pero <strong>la</strong> abundancia de microorganismos puede ser más alta cuando se<br />
añade el detrito, debido a que se propicia una alta conectividad de hongos (Lodge,<br />
trabajos no publicados). Este hecho es apoyado por <strong>la</strong> alta conc<strong>en</strong>tración de ADN <strong>en</strong> el<br />
tratami<strong>en</strong>to donde no hubo poda, pero si adición del detrito (Fig. 4.10.B).<br />
Los resultados del c<strong>la</strong>dograma mostraron que <strong>la</strong> estructura de <strong>la</strong>s comunidades de<br />
hongos y bacterias cambia a través del tiempo y el espacio. La poda del dosel y <strong>la</strong> adición<br />
del detrito pued<strong>en</strong> afectar <strong>la</strong> comunidad microbiana. Estos cambios y difer<strong>en</strong>cias<br />
observadas <strong>en</strong>tre los tratami<strong>en</strong>tos y <strong>la</strong>s cohortes de hojas, pudieron ser provocados<br />
principalm<strong>en</strong>te por el tiempo de recolección de <strong>la</strong> muestra y por el <strong>la</strong>pso de tiempo que se<br />
tuvo que esperar para defoliar <strong>en</strong>tre un bloque y otro. Además, se <strong>en</strong>contró que <strong>la</strong>s<br />
muestras son altam<strong>en</strong>te diverg<strong>en</strong>tes y no pudo ser observado un patrón definido <strong>en</strong> <strong>la</strong>s<br />
comunidades debido a <strong>la</strong> diversidad de <strong>la</strong>s comunidades de hongos y bacterias, y a <strong>la</strong><br />
variabilidad <strong>en</strong>tre los bloques. El efecto de <strong>la</strong> int<strong>en</strong>sidad de <strong>la</strong> defoliación <strong>en</strong> <strong>la</strong> estructura<br />
de <strong>la</strong> cad<strong>en</strong>a alim<strong>en</strong>taria sobre el suelo pudo dep<strong>en</strong>der de <strong>la</strong> duración de <strong>la</strong> defoliación<br />
provocando que el efecto sobre <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> sea más dinámico que<br />
constante (Miko<strong>la</strong> et al, 2001). Por tanto, pudimos probar que <strong>la</strong> hipótesis (H a ) <strong>en</strong> <strong>la</strong> que<br />
se seña<strong>la</strong>ba que <strong>la</strong> deposición de <strong>la</strong> materia orgánica y <strong>la</strong>s aberturas <strong>en</strong> el dosel<br />
cambiarían <strong>la</strong> diversidad de microorganismos <strong>en</strong> nuestra área de estudio es cierta. Esto es<br />
de esta manera, ya que los resultados obt<strong>en</strong>idos de los distintos análisis que se aplicaron a<br />
<strong>la</strong>s muestras recolectadas corroboraron que <strong>la</strong> deposición de materia orgánica y <strong>la</strong>s<br />
aberturas <strong>en</strong> el dosel cambiaron <strong>la</strong> diversidad re<strong>la</strong>tiva de microorganismos, <strong>en</strong> nuestro<br />
caso, hubo una difer<strong>en</strong>cia significativa mayor <strong>en</strong> el número de filotipos <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad
80<br />
de hongos a través del tiempo, tanto <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> fresca, como <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas verdes.<br />
Podemos concluir que los cambios ocurridos a través del tiempo <strong>en</strong> <strong>la</strong>s comunidades<br />
<strong>microbianas</strong> pued<strong>en</strong> ser re<strong>la</strong>cionados a los cambios ocurridos <strong>en</strong> el microclima y a <strong>la</strong><br />
disponibilidad de los compuestos lábiles. En adición, podemos concluir que los hongos<br />
apar<strong>en</strong>tan contro<strong>la</strong>r <strong>la</strong> sucesión de microorganismos al descomponer <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong> pres<strong>en</strong>te<br />
sobre el suelo.<br />
Por último, <strong>en</strong> muy pocos trabajos de investigación se ha aplicado <strong>la</strong> técnica de<br />
TRFLP al estudio de <strong>la</strong>s comunidades <strong>microbianas</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong>s hojas y <strong>en</strong> determinar como los<br />
cambios <strong>en</strong> el ambi<strong>en</strong>te afectan su estructura y diversidad. En este estudio se logró<br />
aplicar, por primera vez, <strong>la</strong> técnica de TRFLP <strong>en</strong> <strong>la</strong> región del trópico, pero aún se<br />
necesitan realizar más investigaciones, ya que <strong>la</strong>s <strong>en</strong>zimas de restricción que se utilizaron<br />
<strong>en</strong> el estudio nos dieron una resolución limitada. Es necesario evaluar otras <strong>en</strong>zimas para<br />
de esta manera poder determinar cual es más eficaz al mom<strong>en</strong>to de discriminar <strong>en</strong>tre los<br />
efectos causados por los tratami<strong>en</strong>tos y los causados por <strong>la</strong>s cohortes de hojas. Es decir,<br />
utilizar otras <strong>en</strong>zimas de restricción que nos provean una mayor resolución de <strong>la</strong><br />
estructura microbiana pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>hojarasca</strong>.
Literatura Citada<br />
Arunacha<strong>la</strong>m A, Pandey HN. 2003 Ecosystem Restoration of Jhum Fallows in Northeast<br />
India: Microbial C and N Along Altitudinal and Successional Gradi<strong>en</strong>ts.<br />
Restoration Ecology 11: 168-173.<br />
Arunacha<strong>la</strong>m A, Maithani K, Pandey HN, Tripathi RS. 1996. The impact of disturbance<br />
on detrital dynamics and soil microbial biomass of Pinus Kesiya forest in northeast<br />
India. Forest Ecology and Mangem<strong>en</strong>t 88: 273-282.<br />
Bridge PD, Arora DK, Reddy CA, E<strong>la</strong>nder RP. 1998. Applications of PCR I Mycology.<br />
CAB International: 1–20.<br />
Buchan A, Newell SY, Butler M, Biers EJ, Hollibaugh JT, Moran MA. 2003. Dynamics<br />
of Bacterial and Fungal Communities on Decaying Salt Marsh Grass. Applied and<br />
Environm<strong>en</strong>tal Microbiology 69: 6,676–6,687.<br />
Cavigelli MA, Robertson GP, Klug MJ. 1995. Fatty acid methyl ester (FAME) profiles as<br />
measure of soil microbial community structure. P<strong>la</strong>nt Soil 170: 99-113.<br />
Chabrerie O, Laval K, Puget P, Desaire S, A<strong>la</strong>rd D. 2003. Re<strong>la</strong>tionship betwe<strong>en</strong> p<strong>la</strong>nt and<br />
soil microbial communities along a successional gradi<strong>en</strong>t in chalk grass<strong>la</strong>nd in<br />
north- western France. Applied Soil Ecology 24: 43-56.<br />
Cornejo FH, Vare<strong>la</strong> A, Wright SJ. 1994. Tropical Forest Litter Decomposition under<br />
Seasonal Drought: Nutri<strong>en</strong>t Release, Fungi and Bacteria. Oikos 70, No. 2: 183-<br />
190.<br />
81
82<br />
Fierer N, Jackson JA, Vilgalys R, Jackson RB. 2005. Assessm<strong>en</strong>t of Soil Microbial<br />
Community Structure by Use of Taxon-Specific Quantitative PCR Assays.<br />
Applied and Environm<strong>en</strong>tal Microbiology 71, No. 7: 4117-4120.<br />
Gange AC, Brown V. 2002. Soil food web compon<strong>en</strong>ts affect p<strong>la</strong>nt community structure<br />
during early succession. Ecological Research 17: 217-227.<br />
Hedlund K. 2002. Soil microbial community structure in re<strong>la</strong>tion to vegetation<br />
managem<strong>en</strong>t on former agricultural <strong>la</strong>nd. Soil Biology & Biochemistry 34: 1299-<br />
1307.<br />
Klug WS, Cummings MR. 1999. Conceptos de G<strong>en</strong>ética. Pr<strong>en</strong>tice Hall. P. 475 – 477.<br />
LaMontagne MG, Schimel JP, Hold<strong>en</strong> PA. 2003. Comparison of Subsurface and Surface<br />
Soil Bacterial Communities in Grass<strong>la</strong>nd as Assessed by Terminal Restriction<br />
Fragm<strong>en</strong>t L<strong>en</strong>gth Polymorphisms of PCR – Amplified 16S rRNA G<strong>en</strong>es.<br />
Microbial Ecology 46: 216–227.<br />
Liu WT, Marsh TL, Ch<strong>en</strong>g H, Forney LJ. 1997. Characterization of Microbial Diversity<br />
by Determining Terminal Restriction Fragm<strong>en</strong>t L<strong>en</strong>gth Polymorphisms of G<strong>en</strong>es<br />
Encoding 16S rRNA. Applied and Environm<strong>en</strong>tal Microbiology 63 No. 11: 4516-<br />
4522.<br />
Lodge DJ, Cantrell SA. 1995. Fungal communities in wet tropical forests: variation in<br />
time and space. Canadian Journal of Botany Suppl.: S1391-S1398.<br />
Lodge DJ, Hawksworth Y, Richie BJ. 1996a. Microbial diversity and tropical forest<br />
functioning. Ecological Studies 122: 71-100.
83<br />
Lodge DJ, McDowell WH, Macy J, Ward SK, Leisso R, C<strong>la</strong>udio-Campos K, Kühnert K.<br />
2008. Distribution and Role of Mat-Forming Saprobic Basidiomycetes in a<br />
Tropical Forest. Brtish Mycological Society Symposia Series. Chapter 11: 195-<br />
207.<br />
Lodge DJ, McDowell WH, McSwiney CP. 1994. The importance of nutri<strong>en</strong>t pulses in<br />
tropical forest. TREE 9, No. 10: 384-387.<br />
Lodge DJ, Regan DP, Waide RB. 1996b. The Food Web of a Tropical Forest. Univ. of<br />
Chicago Press: 53-108.<br />
Lodge DJ, Scat<strong>en</strong>a FN, Asbury CE, Sanchez MJ. 1991. Fine litterfall and re<strong>la</strong>ted nutri<strong>en</strong>t<br />
inputs resulting from Hurricane Hugo in Subtropical Wet and Lower Montane<br />
Rain Forests of Puerto Rico. Biotropica 23: 364-372.<br />
Lugo AE, Rivera CT. 1987. Leaf production, growth rate, and age of the palm Prestoea<br />
Montana in the Luquillo Experim<strong>en</strong>tal Forest, Puerto Rico. Journal of Tropical<br />
Ecology 3: 151-162.<br />
Miko<strong>la</strong> J, Yeates GW, Barker GM , Wardle DA, Bonner KI. 2001. Effects of defoliation<br />
int<strong>en</strong>sity on soil food-web properties in an experim<strong>en</strong>tal grass<strong>la</strong>nd community.<br />
Oikos 92 Issue 2: 333, 11-17.<br />
Miller RM, Lodge DJ. 1997. Fungal responses to disturbance - Agriculture and Forestry.<br />
Pp. 65-84. In The Mycota, Vol. V. Environm<strong>en</strong>tal and Microbial Re<strong>la</strong>tionships.<br />
K. Esser, P.A. Lemke and D.T. Wicklow, Eds. Springer Ver<strong>la</strong>g.
84<br />
Moore JC, Berlow EL, Coleman DC, De Ruiter PC, Dong Q, Hastings A, Collins N,<br />
McCann KS, Melville K, Morim PJ, Nadelhoffer K, Rosemnd AD, Post DM,<br />
Sabo JL, Scow KM, Vanni MJ, Wall DH. 2004. Detritus, trophic dynamics and<br />
biodiversity. Ecology Letters 7: 584-600.<br />
Osborn AM, Smith CJ. 2005. Molecu<strong>la</strong>r Microbial Ecology. Taylor and Francis Group.<br />
P. 69 – 70.<br />
Ostertag R, Scat<strong>en</strong>a FN, Silver WL. 2003. Forest Floor Decomposition Following<br />
Hurricane Litter Inputs in Several Puerto Rican Forests. Ecosystems 6: 261-273.<br />
Quishui Z, Zak JC. 1995. Effects of gap size on litter decomposition and microbial<br />
activity in subtropical forest. Ecology 78: 2196-2205.<br />
Thormann MN, Currah RS, Bayley SE. 2003. Succession of microfungal assemb<strong>la</strong>ges in<br />
decomposing peat<strong>la</strong>nd p<strong>la</strong>nts. P<strong>la</strong>nt & Soil 250 Issue 2: 323-333.<br />
Vestal JR, White DC. 1989. Lipid Analysis in Microbial Ecology: Quantitative<br />
approaches to the study of microbial communities. BioSci<strong>en</strong>ce 39: 535-541.<br />
Weaver PL. 1986. Hurricane damage and recovery in the montane forest of the Luquillo<br />
Mountain of Puerto Rico. Caribb. J. Sci. 22: 53-70.<br />
Willing MR, Moorehead DL, Cox SB, Zak JC. 1996. Functional diversity of soil bacterial<br />
communities in the tabonuco forest: the interaction of anthropog<strong>en</strong>ic and natural<br />
disturbance. 28: 471-48.
Apéndices<br />
85
86<br />
Apéndice Uno<br />
Apéndice 1.01.<br />
Protocolo alternativo para extraer ADN<br />
(UltraClean Soil DNA Iso<strong>la</strong>tion Kit, MoBio Laboratorios, So<strong>la</strong>na Beach, CA).<br />
Ponerse guantes todo el tiempo.<br />
1. Añadir 0.25 g a 1.00 g de muestra del suelo a <strong>la</strong> solución ya preparada (2 ml Bead<br />
Solution Tubes). Enumerar cada solución.<br />
2. Mover <strong>la</strong>s soluciones.<br />
3. Cotejar <strong>la</strong> solución S1, para verificar que no hal<strong>la</strong> precipitado. Si hay precipitado se<br />
t<strong>en</strong>drá que cal<strong>en</strong>tar <strong>la</strong> solución a una temperatura de 60ºC, hasta que se disuelva el<br />
precipitado.<br />
4. Añadir 60 µl de <strong>la</strong> solución S1 e invertir<strong>la</strong> varias veces o mover<strong>la</strong> brevem<strong>en</strong>te.<br />
5. Añadir 200 µl de <strong>la</strong> solución IRS (“Inhibitor R<strong>en</strong>oval Solution”), se requiere solo si el<br />
ADN será utilizado <strong>en</strong> PCR.<br />
6. Asegurar los tubos horizontalm<strong>en</strong>te utilizando el “Mo Bio Vortex Adapter’’ con cinta<br />
adhesiva. Mover a velocidad máxima por 10 minutos.<br />
7. C<strong>en</strong>trifugar los tubos a 10,000 x g durante 30 segundos.<br />
8. Transferir el sobr<strong>en</strong>adante a tubos microc<strong>en</strong>trifugados limpios.<br />
9. Se espera t<strong>en</strong>er alrededor de 400 µl a 450 µl de sobr<strong>en</strong>adante.<br />
10. Añadir 250 µl de <strong>la</strong> solución S2 y mover<strong>la</strong> por 5 segundos. Colocar<strong>la</strong> <strong>en</strong> el conge<strong>la</strong>dor<br />
a 4ºC por 5 minutos.<br />
11. C<strong>en</strong>trifugar los tubos a 10,000 x g.
87<br />
12. Transferir el volum<strong>en</strong> completo de sobr<strong>en</strong>adante a un tubo de sobr<strong>en</strong>adante limpio.<br />
13. Añadir 1.3 ml de <strong>la</strong> solución S3 al sobr<strong>en</strong>adante y moverlo por 5 minutos.<br />
14. Colocar 700 ml <strong>en</strong> el filtro “Spin filter” y c<strong>en</strong>trifugar por 1 minuto a 10,000 x g.<br />
Descartar el flujo. Repetir el proceso con el sobr<strong>en</strong>adante que falta. Se realizará un total<br />
de 3 tandas por cada muestra.<br />
15. Añadir 300 µl de <strong>la</strong> solución S4 y c<strong>en</strong>trifugar por 30 segundos a 10,00 x g.<br />
16. Descartar el flujo.<br />
17. C<strong>en</strong>trifugar nuevam<strong>en</strong>te por 1 minuto.<br />
18. Colocar cuidadosam<strong>en</strong>te el filtro <strong>en</strong> un tubo nuevo. Se provee.<br />
19. Añadir 50 µl de <strong>la</strong> solución S5 <strong>en</strong> el c<strong>en</strong>tro de <strong>la</strong> membrana del filtro.<br />
20. C<strong>en</strong>trifugar por 30 segundos.<br />
21. Desechar el filtro. El ADN <strong>en</strong> el tubo está listo para <strong>la</strong>s aplicaciones. Se recomi<strong>en</strong>da<br />
que se almac<strong>en</strong>e el tubo con el ADN a una temperatura de -20ºC.
88<br />
Apéndice 1.02.<br />
Dilución de iniciadores oligonucleótidos “primers” para bacterias<br />
1525R<br />
Ci = 100 pmol<br />
20pmol (100 µl)<br />
Vi = =<br />
100pmol<br />
27F (FAM)<br />
Ci= 48.2<br />
20 pmol (100 µl)<br />
Vi = =<br />
48.2 pmol<br />
20 µl “primer”<br />
41.5 µl de “primer”<br />
20 µl “primer”<br />
80 µl ddH2O<br />
41.5 µl “primer”<br />
58.2 µl ddH2O<br />
Se aplicará el mismo procedimi<strong>en</strong>to para diluir los iniciadores oligonucleótidos<br />
“primers” de hongos (ITS 4 e ITS 1 ).
89<br />
Apéndice 1.03.<br />
Protocolo para Precipitación de<br />
Productos de Secu<strong>en</strong>ciación<br />
Volum<strong>en</strong> inicial 20µl<br />
1. Transferir todo el volum<strong>en</strong> de <strong>la</strong> digestión a un microtubo de 1.5 ml.<br />
2. Preparar y añadir:<br />
a. 49 µl de agua deionizada estéril (ddH 2 O)<br />
b. 6 µl de 3M acetato de sodio (CH 3 COONa)<br />
c. 125 µl de etanol 95% (CH 3 CH 2 OH)<br />
3. Mezc<strong>la</strong>r bi<strong>en</strong> (vortex) e incubar a temperatura ambi<strong>en</strong>te por 15 a 20 minutos (reposar).<br />
4. C<strong>en</strong>trifugar a velocidad máxima por 20 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> misma ori<strong>en</strong>tación para localizar el “pellet”.<br />
5. Utilizando una micropipeta, aspirar todo el sobr<strong>en</strong>adante con mucho cuidado y <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
dirección opuesta a donde se supone que esté el “pellet”.<br />
6. Añadir 250 µl de etanol 70% para <strong>la</strong>var el “pellet”.<br />
7. C<strong>en</strong>trifugar a velocidad máxima por 5 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> misma ori<strong>en</strong>tación.<br />
8. Aspirar el sobr<strong>en</strong>adante con premura y mucho cuidado con una micropipeta.<br />
9. Dejar secar <strong>la</strong>s muestras <strong>en</strong> un bloque termal a 70 o C por 15 minutos o dejarlo abierto<br />
de forma horizontal hasta evaporarse el alcohol residual. Si posee secado al vacío mejor.<br />
Puede secar <strong>en</strong> un horno de secado a 70 o C.<br />
10. Resusp<strong>en</strong>der el “pellet” <strong>en</strong> Formamida (CH 3 NO) y <strong>en</strong> el marcador de peso molecu<strong>la</strong>r<br />
“Liz 500’’ (Applied Biosystem, Warrinton, UK). Utilizar 14.8 µl de Formamida + 0.2 µl
90<br />
de “Liz marker” (por muestra). Luego, con una micropipeta, se transfier<strong>en</strong> todas <strong>la</strong>s<br />
muestras al p<strong>la</strong>to de secu<strong>en</strong>ciar y se le coloca el septo (<strong>la</strong> tapa de goma gris).<br />
11. El p<strong>la</strong>to de secu<strong>en</strong>ciar se coloca <strong>en</strong> el termocic<strong>la</strong>dor y se aplica el programa de<br />
desnaturalizar. Este método es aplicado para romper interacciones débiles como los<br />
pu<strong>en</strong>tes de hidróg<strong>en</strong>o que pued<strong>en</strong> formarse.<br />
12. Cuando finalice el ciclo de desnaturalizar, colocar rápidam<strong>en</strong>te el p<strong>la</strong>to de secu<strong>en</strong>ciar<br />
que conti<strong>en</strong>e <strong>la</strong>s muestras <strong>en</strong> un baño de agua fría para un cambio drástico de temperatura<br />
por 2 minutos. Luego secar el p<strong>la</strong>to y colocar <strong>la</strong> base y <strong>la</strong> cubierta requerida para <strong>la</strong><br />
secu<strong>en</strong>ciación <strong>en</strong> el Analizador G<strong>en</strong>ético.
91<br />
Apéndice Dos<br />
Apéndice 2.01. Resultados de <strong>la</strong> amplificación del ADN mediante <strong>la</strong> técnica de reacción<br />
de <strong>la</strong> polimerasa <strong>en</strong> cad<strong>en</strong>a (PCR) utilizando <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima Polimerasa de ADN Red Taq<br />
ADN Descripción Bacterias Dilución Hongos Dilución<br />
16s rADN<br />
ITS<br />
Período de muestreo: 17 semanas<br />
40 A1 - Hojarasca nueva - N/A - N/A<br />
41 A1 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
42 A1 - Hojarasca sobre suelo + 10 -1 + 10 -2<br />
43 A2 - Hojarasca nueva + 10 -2 + 10 -1<br />
44 A2 - Hojarasca fresca - N/A - N/A<br />
45 A2 - Hojarasca sobre suelo + 10 -2 + 10 -1<br />
46 A3 - Hojas verdes - N/A - N/A<br />
47 A3 - Hojarasca nueva + 10 -1 + 10 -1<br />
48 A3 – Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -1<br />
49 A3 - Hojarasca sobre suelo + 10 -2 + 10 -2<br />
50 A4 - Hojas verdes + 10 -2 + 10 -1<br />
51 A4 - Hojarasca nueva + 10 -1 + 10 -1<br />
52 A4 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -1<br />
53 A4 - Hojarasca sobre suelo + 10 -2 + 10 -1<br />
54 B1 - Hojarasca nueva + 10 -2 - N/A
92<br />
Apéndice 2.01., continuación.<br />
55 B1 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -1<br />
56 B1 - Hojarasca sobre suelo + 10 -2 + 10 -1<br />
57 B2 - Hojas verdes + 10 -1 + 10 -1<br />
58 B2 - Hojarasca nueva - N/A + 10 -1<br />
59 B2 - Hojarasca fresca + 10 -2 - N/A<br />
60 B2 - Hojarasca sobre suelo + 10 -2 + 10 -1<br />
61 B3 - Hojas verdes + 10 -2 + 10 -1<br />
62 B3 – Hojarasca nueva + 10 -2 + 10 -1<br />
63 B3 – Hojarasca fresca - N/A - N/A<br />
64 B3 - Hojarasca sobre suelo + 10 -1 - N/A<br />
65 B4 - Hojarasca nueva - N/A + 10 -1<br />
66 B4 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
67 B4 - Hojarasca sobre suelo + 10 -1 N/A N/A<br />
68 C1 - Hojas verdes - N/A + 10 -1<br />
69 C1 - Hojarasca nueva - N/A + 10 -1<br />
70 C1 - Hojarasca fresca - N/A - N/A<br />
71 C1 - Hojarasca sobre suelo + 10 -1 + 10 -1<br />
72 C2 - Hojas verdes - N/A + 10 -1<br />
73 C2 - Hojarasca nueva + 10 -1 N/A N/A<br />
74 C2 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -2<br />
75 C2 - Hojarasca sobre suelo + 10 -2 + 10 -2<br />
76 C3 - Hojarasca nueva + 10 -1 + 10 -2<br />
77 C3 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -1
93<br />
Apéndice 2.01., continuación.<br />
78 C3 - Hojarasca sobre suelo + 10 -1 + 10 -1<br />
79 C4 - Hojarasca nueva - N/A + 10 -2<br />
80 C4 - Hojarasca fresca - N/A + 10 -2<br />
81 C4 - Hojarasca sobre suelo + 10 -1 + 10 -2<br />
Período de muestreo: 31 semanas<br />
82 A1 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -2<br />
83 A2 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -2<br />
84 A3 - Hojas verdes - N/A + 10 -1<br />
85 A3 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -2<br />
86 A4 - Hojas verdes + 10 -1 + 10 -2<br />
87 A4 - Hojarasca fresca - N/A + 10 -2<br />
88 B1 – Hojarasca fresca - N/A + 10 -2<br />
89 B2 – Hojas verdes - N/A + 10 -2<br />
90 B2 - Hojarasca fresca - N/A + 10 -2<br />
91 B3 - Hojas verdes + 10 -2 + 10 -2<br />
92 B3 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -2<br />
93 B4 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -2<br />
94 C1 - Hojas verdes + 10 -2 + 10 -2<br />
95 C1 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -2<br />
96 C2 - Hojas verdes + 10 -2 + 10 -2<br />
97 C2 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -2<br />
98 C3 - Hojarasca fresca - N/A + 10 -2<br />
99 C4 - Hojarasca fresca + 10 -2 + 10 -2
94<br />
Apéndice 2.01., continuación.<br />
Período de muestreo: 55 semanas<br />
118 A1 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
119 A2 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
120 A3 - Hojas verdes + 10 -1 + 10 -1<br />
121 A3 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
122 A4 - Hojas verdes + 10 -2 + 10 -1<br />
123 A4 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
124 B1 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
125 B2 - Hojas verdes + 10 -1 + 10 -1<br />
126 B2 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
127 B3 - Hojas verdes + 10 -1 + 10 -1<br />
128 B3 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
129 B4 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
130 C1 - Hojas verdes + 10 -1 + 10 -1<br />
131 C1 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
132 C2 - Hojas verdes + 10 -1 + 10 -1<br />
133 C2 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
134 C3 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
135 C4 - Hojarasca fresca + 10 -1 + 10 -1<br />
+ resultado positivo al PCR<br />
- resultado negativo al PCR<br />
N/A no aplica
95<br />
10 -1 muestras positivas al PCR al t<strong>en</strong>er 2µl de ADN extraído <strong>en</strong> 18 µl de agua deionizada<br />
estéril<br />
10 -2 muestras positivas al PCR al t<strong>en</strong>er 2µl de ADN diluido 10 -1 <strong>en</strong> 18 µl de agua<br />
deionizada estéril.<br />
Tratami<strong>en</strong>tos:<br />
A1, B1, C4 --- Control<br />
A2, B4, C3--- Poda sin adición de detrito<br />
A3, B2, C2 --- Poda más adición de detrito<br />
A4, B3, C1 --- No poda más adición de detrito
96<br />
Apéndice 2.02. Resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras de <strong>hojarasca</strong> fresca colectadas <strong>en</strong> los<br />
Bloques A, B y C al determinar <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total (µg/ml) y el número de<br />
filotipos utilizando <strong>la</strong> técnica de TRFLP de acuerdo a los tratami<strong>en</strong>tos e intervalos de tiempo.<br />
TRFLP (16S rADN)<br />
TRFLP (ITS)<br />
Bloque Tratami<strong>en</strong>to Tiempo ADN Número de picos Número de picos<br />
(meses) (µg/ml) para bacterias para hongos<br />
A control 17 8.1 34 34<br />
A control 31 80.3 48 66<br />
A control 55 14.4 50 29<br />
A No poda + Detrito 17 29.7 45 63<br />
A No poda + Detrito 31 141.3 N/A 34<br />
A No poda + Detrito 55 23.2 35 44<br />
A Poda + No adición 17 172.2 N/A N/A<br />
A Poda + No adición 31 107.3 10 59<br />
A Poda + No adición 55 18.0 N/A 58<br />
A Poda + Detrito 17 52.5 41 23<br />
A Poda + Detrito 31 66.8 17 81<br />
A Poda + Detrito 55 14.2 45 68<br />
B control 17 30.5 N/A N/A<br />
B control 31 55.5 N/A 51<br />
B control 55 22.4 N/A 56<br />
B No poda + Detrito 17 29.1 N/A N/A
97<br />
B No poda + Detrito 31 65.1 33 54<br />
B No poda + Detrito 55 23.2 N/A N/A<br />
B Poda + No adición 17 37.6 31 24<br />
B Poda + No adición 31 43.8 34 45<br />
B Poda + No adición 55 18.8 N/A 27<br />
B Poda + Detrito 17 109.7 N/A N/A<br />
B Poda + Detrito 31 58.8 N/A 22<br />
B Poda + Detrito 55 15.2 N/A 31<br />
C control 17 63.9 N/A 42<br />
C control 31 45.3 15 64<br />
C control 55 15.8 N/A N/A<br />
C No poda + Detrito 17 29.6 N/A N/A<br />
C No poda + Detrito 31 73.0 43 89<br />
C No poda + Detrito 55 36.4 N/A N/A<br />
C Poda + No adición 17 52.1 48 74<br />
C Poda + No adición 31 121.7 N/A 19<br />
C Poda + No adición 55 30.0 N/A 33<br />
C Poda + Detrito 17 92.9 50 75<br />
C Poda + Detrito 31 66.8 25 68<br />
C Poda + Detrito 55 30.6 94 N/A
98<br />
Apéndice 2.03. Resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras de hojas verdes colectadas <strong>en</strong> los<br />
Bloques A, B y C al determinar <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total (µg/ml) y el número de<br />
filotipos utilizando <strong>la</strong> técnica de TRFLP de acuerdo a los tratami<strong>en</strong>tos e intervalos de tiempo.<br />
TRFLP (16S rADN)<br />
TRFLP (ITS)<br />
Bloque Tratami<strong>en</strong>to Tiempo ADN 1 Número de picos Número de picos<br />
(meses) (µg/ml) para bacterias para hongos<br />
A Poda + Detrito 17 34.2 N/A N/A<br />
A Poda + Detrito 31 28.9 N/A 72<br />
A Poda + Detrito 55 13.9 10 65<br />
A No poda + Detrito 17 34 23 80<br />
A No poda + Detrito 31 51.7 58 64<br />
A No poda + Detrito 55 28.7 31 N/A<br />
B Poda + Detrito 17 48.1 25 45<br />
B Poda + Detrito 31 26.7 N/A 17<br />
B Poda + Detrito 55 17.4 N/A 15<br />
B No poda + Detrito 17 84.1 N/A 66<br />
B No poda + Detrito 31 52 28 95<br />
B No poda + Detrito 55 18.4 N/A 29<br />
C Poda + Detrito 17 89.9 N/A 13<br />
C Poda + Detrito 31 58.6 13 62<br />
C Poda + Detrito 55 15 65 N/A
99<br />
C No poda + Detrito 17 29.6 N/A<br />
69<br />
C No poda + Detrito 31 54.6 22 56<br />
C No poda + Detrito 55 19.8 96 N/A<br />
1<br />
Los resultados obt<strong>en</strong>idos al calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración de ADN total se obtuvieron de <strong>la</strong>s<br />
muestras que fueron colectadas de los bloques A, B y C utilizando el biofotómetro. Se<br />
utilizaron 6 µl del ADN extraído diluidos <strong>en</strong> 54 µl de agua esterilizada.