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hámsters dorados (Mesocricetus auratus) con una sobredosis de pentobarbital sódico
vía intraperitoneal, el riñón se colectó en buffer Krebs-Bicarbonato (118 mM NaCl,
25 mM NaHCO 3 , 1.2 mM KH 2 PO 4 , 4 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4 , 1.8 mM CaCl 2 y
11.1 mM D-glucosa, pH 7.4), este se procesó utilizando el rebanador Brendel-
Vitron; las rebanadas obtenidas de ~6 mm de diámetro y con grosor de ~250 µm se
incubaron en medio MEM/F12 con 0 (control) y 15 µM de HgCl2 solo y en
presencia de los compuestos antirradicales durante 30 min, para la concentración de
los compuestos se eligió una concentración que capturara eficazmente los radicales
libres (determinado por la capacidad de reducir el DPPH) pero a la vez fuese inerte
en células normales(Vero), se eligió probar el compuesto 1B a 3 µg/mL, el 2B a 9
µg/mL y el 3B a 6 µg/mL. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las
rebanadas se disgregaron en un homogenizador provisto con mango de teflón (Potter
Elvehjem, 50 mL), en buffer de sacarosa (0.25 M Sacarosa y 1mM MgCl 2 ), una vez
disgregado, el material se centrifugó a 5000 rpm /10 min, la pastilla se resuspendió
en 90 µl de agarosa de bajo punto de fusión (ABF, 0.75%), la mezcla se colocó en
laminillas previamente tratadas con agarosa de normal punto de fusión (ANF,
0.75%), se dejó solidificar la agarosa ABF a 4 ºC, durante 5 min y se procedió a
colocar una última capa de ABF, después de solidificada esta capa, las laminillas se
colocaron en buffer de lisis (2.5 M NaOH, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris y Triton X-100
al 1%, pH 10) por al menos 60 min a 4 ºC, una vez transcurrido el tiempo se
colocaron en un buffer alcalino pH 13 (300 mM NaOH y 1 mM EDTA) durante 20
min, después se corrió en electroforesis a 300 mV y 25 mA durante 20 min,
transcurrido el tiempo las laminillas se neutralizaron con buffer Tris 0.4 M, pH 7.5 y
se deshidrataron con alcohol etílico, por último las laminillas se tiñeron con 20 µL (5
µg/mL) de bromuro de etidio y se examinaron en un microscopio de fluorescencia
equipado con un filtro de excitación de 515-560 nm. Para cada concentración fueron
analizadas 25 células con un programa computarizado de análisis de imágenes
(CASP, http://casp.sourceforge.net/) tomando en cuenta el momento de Olive
(MO):
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