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como la concentración inhibitoria media (CI 50 ) en µg/mL. Como control positivo de
muerte celular se utilizó tritón X-100 al 0.5% y como control negativo medio de
cultivo este mismo se utilizo para disolver los extractos.
7.5.2. Ensayo WST-1
Para los ensayos de proliferación restantes (fracciones y compuestos activos)
se eligió continuar con la técnica de WST-1 (4-[3-(4-Iodophenyl)- 2-(4-nitrophenyl)-
2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) que si bien también se basan en la
reducción de sales por enzimas succinato deshidrogenada mitocondrial, los cristales
son solubilizados en el medio de cultivo (Ishiyama et al., 1995), evitando lavados, lo
que se traduce en un manejo más eficiente de los cultivos, del tiempo y de reactivos.
Para el ensayo WST-1 se siguió la misma metodología descrita anteriormente
(para MTT), al concluir el tiempo de incubación de las células con las muestras se
añadieron 10 µL del reactivo por pozo, se incubó la microplaca 90 min a 37 °C e
inmediatamente después se leyó a 450 nm. Se corrieron tres ensayos independientes,
los resultados se calcularon con probit, expresados como la concentración inhibitoria
media (CI 50 ) en µg/mL. Como control positivo se utilizó tritón X-100 al 0.5% y
como control negativo medio de cultivo este mismo se utilizo para disolver las
muestras.
7.6 Determinación del Efecto Antigenotóxico (Ensayo Cometa)
Para determinar el efecto protector de los compuestos antirradicales se utilizó
el ensayo cometa, este consiste en cuantificar el daño inducido al ADN de células
incluidas en agarosa, lisadas en condiciones fuertemente alcalinas y luego sometidas
a electroforesis a pH alcalino, de manera que los rompimientos inducidos en el
núcleo se desplacen en dirección al ánodo, formando una cola de cometa, que se
visualiza mediante fluorescencia (Singh, 1988).
Para determinar el efecto protector de los compuestos activos se utilizó HgCl 2
para generar estrés oxidativo e inducir daño al ADN esto en un modelo ex vivo de
rebanadas de riñón. El ensayo se realizó de la siguiente manera: se sacrificaron
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