evaluación de la actividad antioxidante de extractos orgánicos de ...
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ecomienda cubrir de aluminio el vaso o recipiente que contenga la solución, para protección contra la luz. 2.6.3 Método de DPPH•. En una placa de 96 pozos, se añadieron 20 μL de extracto y 0.2 mL del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•, 125 μM). Se agregaron 0.02 mL de BHT (100 μM) como estándar y como absorbencia control 0.02 mL de DMSO y a cada una se le añaden 0.2 mL de 2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH•, 125 μM). Las muestras y los estándares se preparan por triplicado. La placa se mantiene cubierta y en la oscuridad a temperatura ambiente por 30 minutos y pasado este tiempo, se lee en un espectrofotómetro de ELISA a 545 nm, ver Figura 15 en apéndice B. 2.6.4 Cálculo de la actividad antirradical. La actividad antirradical (AAR) se calculó como porcentaje de decoloración del radical 2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH•), usando la ecuación siguiente: % AAR = ( Acontrol Amuestra ) 100 ( ) A control Donde: AAR = actividad antirradical A muestra = absorbencia de la muestra a 545 nm A control = absorbencia del control (ausencia del antioxidante) 2.7 Análisis estadístico de los resultados Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para determinar si existía diferencia significativa, en el poder reductor y actividad antirradical, entre los diferentes extractos orgánicos de semilla de H. terebinthinaceus. El estudio se realizó sobre los datos obtenidos a las concentraciones más altas. 25
2.8 Estudio fitoquímico 2.8.1 Determinación de fenoles totales. Se preparó una solución stock de 1 mg/mL de ácido gálico. Se prepararon las siguientes diluciones para obtener la curva de calibración ver Apéndice C. A 20 μL del extracto o estándar correspondiente, por triplicado, se le agregaron 1.5 mL de agua destilada, 100 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu, después de 5 minutos se agregaron 300 μL de solución de carbonato de sodio al 20 %, se dejó reposar por 2 h a temperatura ambiente o 30 min a 40°C. Posteriormente se midió la absorbencia a 765 nm. La concentración de fenoles se calcula con base en la curva de calibración y se expresó como mg equivalentes de ácido gálico/mL, Tabla 1. Tabla 1. Diluciones para preparar la curva de calibración de fenoles totales Concentración mg/mL Solución stock (L) Agua destilada (L) 0.00 0 1000 0.05 50 950 0.10 100 900 0.15 150 850 0.20 200 800 0.25 250 750 0.30 300 700 0.40 400 600 0.45 450 550 0.50 500 500 2.8.2 Determinación de flavonoides. Se preparó una solución stock de 0.1 mg/mL de rutina. Posteriormente se prepararon las diluciones para la curva de calibración, Tabla 2 ver Apéndice C. A 100 μL del extracto o estándar correspondiente, por triplicado, se le agregaron 1 mL de CH 3 OH y 50 L de 2-aminoetil difenilborato al 1%, se dejó 26
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ecomienda cubrir <strong>de</strong> aluminio el vaso o recipiente que contenga <strong>la</strong> solución,<br />
para protección contra <strong>la</strong> luz.<br />
2.6.3 Método <strong>de</strong> DPPH•. En una p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> 96 pozos, se añadieron 20 μL <strong>de</strong><br />
extracto y 0.2 mL <strong>de</strong>l radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•, 125 μM). Se<br />
agregaron 0.02 mL <strong>de</strong> BHT (100 μM) como estándar y como absorbencia<br />
control 0.02 mL <strong>de</strong> DMSO y a cada una se le aña<strong>de</strong>n 0.2 mL <strong>de</strong> 2,2-difenil-1-<br />
picrilhidracilo (DPPH•, 125 μM). Las muestras y los estándares se preparan por<br />
triplicado. La p<strong>la</strong>ca se mantiene cubierta y en <strong>la</strong> oscuridad a temperatura<br />
ambiente por 30 minutos y pasado este tiempo, se lee en un espectrofotómetro<br />
<strong>de</strong> ELISA a 545 nm, ver Figura 15 en apéndice B.<br />
2.6.4 Cálculo <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>actividad</strong> antirradical. La <strong>actividad</strong> antirradical (AAR)<br />
se calculó como porcentaje <strong>de</strong> <strong>de</strong>coloración <strong>de</strong>l radical 2,2-difenil-1-<br />
picrilhidracilo (DPPH•), usando <strong>la</strong> ecuación siguiente:<br />
% AAR =<br />
( Acontrol<br />
Amuestra<br />
) 100 ( )<br />
A<br />
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AAR = <strong>actividad</strong> antirradical<br />
A muestra = absorbencia <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra a 545 nm<br />
A control = absorbencia <strong>de</strong>l control (ausencia <strong>de</strong>l <strong>antioxidante</strong>)<br />
2.7 Análisis estadístico <strong>de</strong> los resultados<br />
Se realizó un análisis <strong>de</strong> varianza (ANOVA) para <strong>de</strong>terminar si existía<br />
diferencia significativa, en el po<strong>de</strong>r reductor y <strong>actividad</strong> antirradical, entre los<br />
diferentes <strong>extractos</strong> orgánicos <strong>de</strong> semil<strong>la</strong> <strong>de</strong> H. terebinthinaceus. El estudio se<br />
realizó sobre los datos obtenidos a <strong>la</strong>s concentraciones más altas.<br />
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