evaluación de la actividad antioxidante de extractos orgánicos de ...
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pueden dar resultados variables dependiendo de su especificidad (Fukumoto y Mazza, 2000). Los siguientes son ejemplos de los modelos in vitro más frecuentemente usados para la evaluación de la actividad antioxidante total. a) Método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•) (Brand-Williams et al.; 1995). Limitado por su reproducibilidad interensayos. b) Ensayo FRAP, (Del inglés ferric-reducing antioxidant power), (Benzie y Strain, 1996). Mide la capacidad de reducción. c) Método ORAC, (Del inglés Oxygen Radical Absorbance Capacity) (Cao et al., 1997). Cada antioxidante analizado presenta comportamientos muy dispares. d) Método del 6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina (ABTS) (Re et al., 1999). La capacidad de captura de radicales libres en este método no es un reflejo de su verdadera actividad antioxidante. e) Método del N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (Fogliano et al., 1999). Método con reproducibilidad interensayo alta, útil para medios no lipídicos. A continuación se describen los métodos utilizados en el presente trabajo: 1.10.1 Análisis del poder reductor férrico/antioxidante (FRAP). El análisis de FRAP fue introducido por Benzie y Strain (Benzie y Strain, 1996; Pulido-Bravo y Saura-Calixto, 2000) para medir la actividad antioxidante total y se basa en la capacidad de los polifenoles para reducir Fe 3+ a Fe 2+ . Este método fue modificado recientemente para su uso en microplacas de 96-pozos (Tsao y Deng, 2004), dando una reproducibilidad mejor y un rendimiento de procesamiento más alto de muestras. El análisis se basa en el poder reductor de un antioxidante que reduce el ion férrico (Fe 3+ ) al ion ferroso (Fe 2+ ); formando un complejo azul. Una absorción alta a una longitud de onda de 700 15
nm indica un poder de reducción alto del fitoquímico, es decir una actividad antioxidante alta (Roginsky y Lissi, 2005). El valor de FRAP se ha usado para determinar la actividad antioxidante de vinos rojos (Arnous et al., 2001). El trabajo de Schleisier et al., (2002) fue diseñado para determinar la actividad antioxidante en jugos y extractos de té en equivalentes de Fe 2+ . El índice inicial absoluto de la reducción de la ferrilmetilmioglobina determinado por espectroscopía en la región visible fue sugerido para caracterizar la actividad antioxidante de flavonoides individuales (Silva et al., 2002). 1.10.2 Método del DPPH•. Brand-Williams et al., (1995) evaluaron la actividad de compuestos específicos o extractos usando el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•) en una solución metanólica. La reducción del DPPH• se monitorea por la disminución en la absorbencia a una longitud de onda característica. En su forma de radical libre, el DPPH• absorbe a 515 nm y cuando sufre reducción por un antioxidante, esta absorción desaparece. En consecuencia, la desaparición del DPPH• proporciona un índice para estimar la capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales. El modelo que explica la actividad de un compuesto como antirradical se ejemplifica con la siguiente ecuación: DPP H + ( A H ) n DPP H H + ( A ) n Donde AH es un antioxidante que actúa como antirradical donando átomos de hidrógeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares estables que detendrán la reacción en cadena, tal es el caso de los fenoles. El nuevo radical formado (A ) puede interactuar con otro radical para formar moléculas estables (DPPH-A, A-A). La reacción entre el DPPH• y un compuesto depende de la conformación estructural del mismo, por lo que las comparaciones cuantitativas no siempre son apropiadas. 16
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nm indica un po<strong>de</strong>r <strong>de</strong> reducción alto <strong>de</strong>l fitoquímico, es <strong>de</strong>cir una <strong>actividad</strong><br />
<strong>antioxidante</strong> alta (Roginsky y Lissi, 2005).<br />
El valor <strong>de</strong> FRAP se ha usado para <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> <strong>actividad</strong> <strong>antioxidante</strong><br />
<strong>de</strong> vinos rojos (Arnous et al., 2001). El trabajo <strong>de</strong> Schleisier et al., (2002) fue<br />
diseñado para <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> <strong>actividad</strong> <strong>antioxidante</strong> en jugos y <strong>extractos</strong> <strong>de</strong> té en<br />
equivalentes <strong>de</strong> Fe 2+ . El índice inicial absoluto <strong>de</strong> <strong>la</strong> reducción <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
ferrilmetilmioglobina <strong>de</strong>terminado por espectroscopía en <strong>la</strong> región visible fue<br />
sugerido para caracterizar <strong>la</strong> <strong>actividad</strong> <strong>antioxidante</strong> <strong>de</strong> f<strong>la</strong>vonoi<strong>de</strong>s individuales<br />
(Silva et al., 2002).<br />
1.10.2 Método <strong>de</strong>l DPPH•. Brand-Williams et al., (1995) evaluaron <strong>la</strong><br />
<strong>actividad</strong> <strong>de</strong> compuestos específicos o <strong>extractos</strong> usando el radical libre estable<br />
2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•) en una solución metanólica. La reducción<br />
<strong>de</strong>l DPPH• se monitorea por <strong>la</strong> disminución en <strong>la</strong> absorbencia a una longitud <strong>de</strong><br />
onda característica. En su forma <strong>de</strong> radical libre, el DPPH• absorbe a 515 nm y<br />
cuando sufre reducción por un <strong>antioxidante</strong>, esta absorción <strong>de</strong>saparece. En<br />
consecuencia, <strong>la</strong> <strong>de</strong>saparición <strong>de</strong>l DPPH• proporciona un índice para estimar <strong>la</strong><br />
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explica <strong>la</strong> <strong>actividad</strong> <strong>de</strong> un compuesto como antirradical se ejemplifica con <strong>la</strong><br />
siguiente ecuación:<br />
DPP H + ( A H ) n DPP H H + ( A ) n<br />
Don<strong>de</strong> AH es un <strong>antioxidante</strong> que actúa como antirradical donando<br />
átomos <strong>de</strong> hidrógeno, dando como resultado radicales con estructuras<br />
molecu<strong>la</strong>res estables que <strong>de</strong>tendrán <strong>la</strong> reacción en ca<strong>de</strong>na, tal es el caso <strong>de</strong> los<br />
fenoles. El nuevo radical formado (A ) pue<strong>de</strong> interactuar con otro radical para<br />
formar molécu<strong>la</strong>s estables (DPPH-A, A-A). La reacción entre el DPPH• y un<br />
compuesto <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> conformación estructural <strong>de</strong>l mismo, por lo que <strong>la</strong>s<br />
comparaciones cuantitativas no siempre son apropiadas.<br />
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