Revista Fedhemo NÂº 31 - Hemofilia

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Ciencia FEDHEMO Nº 31 22 patógenos y depredadores han hecho posible esto en plantas cultivables. También algunas bacterias y hongos se han seleccionado genéticamente, por ejemplo, la levadura del pan y la cerveza, el Penicillium para la obtención de la penicilina o el Tolypocladium inflatum gams para la obtención de la ciclosporina, un inmunosupresor que evita los rechazos en transplantes. La nueva era en la que nos encontramos nos permite ir más allá de la aplicación de los postulados genéticos clásicos y la selección genética; podemos manipular directamente el material genético propio de un organismo para obtener, en el laboratorio, un nuevo organismo diseñado específicamente –a partir del ya preestablecido por la naturaleza– para cubrir una determinada necesidad humana. Esta manipulación, en el más estricto y ético sentido del término, se conoce como Ingeniería Genética Molecular que permite la mejora genética de plantas y animales, la obtención de tejidos humanos en el laboratorio, la terapia génica de distintas patologías humanas o la obtención de sustancias terapéuticamente activas tanto a partir de cultivos de células como a partir de animales transgénicos. BIOTECNOLOGIA Y ANIMALES TRANSGENICOS La Ingeniería Genética Molecular permite modificar la composición genética de una célula, es decir, ese patrimonio heredado que va a condicionar los distintos caracteres y funciones fisiológicas en un ser vivo. Nos referimos al término transgénico cuando hacemos mención a un organismo o célula en los que hemos introducido un ADN (ácido desoxirribonucleico) llamado también transgén. Así, podemos hablar de bacterias transgénicas, hongos transgénicos, células transgénicas en general o de animales transgénicos. El nuevo organismo puede utilizarse entonces como “fábrica” para la obtención de determinadas sustancias, generalmente proteínas de mamíferos, a gran escala y de una forma natural. La Biotecnología es, por tanto, el área de investigación sobre la aplicación de la tecnología del ADN recombinante mediante técnicas de Ingeniería Genética con fines terapéuticos y/o comerciales, prometiendo ser la industria biotecnológica en el futuro, la base de los países desarrollados, con fines de mejora del bienestar humano. Pero, por desgracia y como muchas de las veces la ambición de poder forma parte de la condición humana, no podemos olvidar que estas técnicas se aplican ya con fines contrarios como armas biológicas. Existe una amplia diversidad de técnicas para introducir un ADN foráneo –o transgén– en una célula (Figura 1) (Crystal, 1995), por ejemplo, la transformación o introducción abriendo un poro en la membrana, la microinyección, la infección con virus que portan el ADN o el bombardeo de partículas recubiertas del ADN. En cualquier caso la ruta de transformación más estable y más habitual suele ser la integración en el cromosoma celular. Figura 1. Métodos de introducción de un ADN para la obtención de una célula transgénica. Este tipo de metodología para la obtención de células transgénicas es la utilizada para la fabricación de los factores recombinantes y aunque se trata de un protocolo menos laborioso que el de la preparación de animales transgénicos, los rendimientos son bajos y, por tanto, su coste es muy elevado. El segundo tipo de metodología es la obtención de animales transgénicos (Referencias Web1 y Web2) mediante la inyección de vectores plasmídicos –fragmentos de ADN bacteriano– específicos, que portan el gen de interés, en huevos fecundados. De esta forma, se genera un huevo transgénico y el ADN se incorpora en las células germinales transmitiéndose a la descendencia derivada de esa célula. Por ejemplo, la leche de mamíferos transgénicos (Figura 2), que se obtiene muy fácilmente, se puede utilizar como vehículo de expresión de proteínas foráneas mediante secreción de forma natural sin necesidad de sacrificar al animal y que de otra forma sería muy poco rentable de obtener. PRODUCCION DE FACTORES HUMANOS DE LA COAGULACION VIII Y IX TRANSGENICOS La hemofilia es causada por la deficiencia de los factores de la coagulación sanguínea VIII o IX que intervienen en la cascada de la coagulación sanguínea. Es una enfermedad ligada al cromosoma X (Xq28 para factor VIII y Xq27 para factor IX), de rasgos rece-
Figura 2. Obtención de proteínas transgénicas en mamíferos. El gen de interés que produce la proteína transgénica terapéutica, se sitúa entre los genes promotores que solo se expresan en tejido mamario. Posteriormente, esta construcción se inyecta en los pronúcleos –etapa previa al núcleo en un óvulo recién fecundado– de oveja o ratón. Estos óvulos modificados se implantan en madres adoptivas y se seleccionan los descendientes que porten el transgén que producirá, solamente en la leche, grandes cantidades de la proteína que finalmente se purifica por métodos convencionales. sivos con manifestaciones clínicas hemorrágicas y daño articular, que se transmite por las mujeres y es padecida por los varones. Esta deficiencia se debe a mutaciones en los genes que codifican estas proteínas. En 1952 Biggs (Biggs, 1952) y Aggeler (Aggeler, 1952) describieron y distinguieron los dos tipos de hemofilias (Tabla I), la de tipo A o clásica, y la de tipo B o enfermedad de Christmas que cursan, respectivamente, con una deficiencia de los factores de la coagulación VIII y IX. Otras características diferenciales son el peso molecular de esas dos proteínas, el tamaño del ADN que las codifica, su vida media o su concentración fisiológica normal en plasma. El tratamiento racional de la hemofilia se basó, en un principio, en las transfusiones de sangre o plasma. Posteriormente, se utilizaron los factores antihemofílicos purificados a partir del plasma humano y, por último y en nuestro presente, con los factores recombinantes obtenidos por ingeniería genética en células modificadas de mamífero. Ahora, Chen y colaboradores utilizando ratones transgénicos (Chen y col., 2002) han obtenido la expresión de factor VIII humano, biológicamente activo, purificado de la leche murina. En la Figura 3a se muestra la construcción génica plasmídica –ya que deriva de un material genético bacteriano o plásmido– utilizada para la preparación del ratón transgénico y que porta el gen de la alfa lactoalbúmina bovina como promotor tejido-específico mamario y el gen para factor VIII humano. Este plásmido se microinyecta en los pronúcleos de un óvulo fecundado de ratón, se implanta en madres adoptivas y al final se cuantifica el factor VIII secretado en la leche de la progenie transgénica. De esta forma, se encontró una concentración entre 7 y 50,2 miligramos por litro de leche (35 a 200 veces la concentración normal en plasma), detectándose una actividad coagulante mayor a 13,4 unidades por mililitro capaz de restaurar la coagulación de un plasma humano deficiente en factor VIII. Por su parte, Huang y col. (Huang y col., 2002), mediante una metodología semejante, han producido Tipo Frecuencia a Proteína Concentración en plasma (ng/ml) c Vida media (horas) (kDa), (bp) b Normal Leve Moderada Severa A 1:6000 B 1:30000 Factor VIII (280) (7056) Factor IX (68) (1389) TABLA I Hemofilias de tipo A y de tipo B 200 20 4 < 2 ~10 5000 500 100 < 50 ~20 a Referido a individuos varones nacidos vivos. b Tamaño molecular de la proteína expresado en kilodaltones y del ácido desoxirribonucleico, que la codifica, expresado en pares de bases nucleotídicas. c Concentraciones de cada uno de los factores VIII o IX en su nivel normal y en distintos estados de gravedad de la enfermedad: leve, moderada o severa. FEDHEMO Nº 31 Ciencia 23
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