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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA MANUAL DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA GENÉTICA ELABORADO POR: Dr. Jesús Agustín Badillo Corona Dra. María del Carmen Oliver Salvador Dr. Claudio Garibay Orijel IBt. César Agustín Jiménez Sierra IBt. Hector Molina Jiménez México D. F. Agosto 2009
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL<br />
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA<br />
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS<br />
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA<br />
MANUAL DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA GENÉTICA<br />
ELABORADO POR:<br />
Dr. Jesús Agustín Badillo Corona<br />
Dra. María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador<br />
Dr. Claudio Garibay Orijel<br />
IBt. César Agustín Jiménez Sierra<br />
IBt. Hector Molina Jiménez<br />
México D. F. Agosto 2009
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
<strong>Laboratorio</strong> <strong>de</strong> Ingeniería Genética<br />
Titulo<br />
Relación <strong>de</strong> prácticas<br />
Sesiones*<br />
Transformación genética <strong>de</strong> plantas <strong>de</strong> tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando<br />
Agrobacterium tumefaciens<br />
13<br />
1. Preparación <strong>de</strong> material y medios <strong>de</strong> cultivo<br />
2. Cultivo <strong>de</strong> Agrobacterium en medio sólido<br />
3. Cultivo <strong>de</strong> Agrobacterium en medio líquido<br />
4. Preparación <strong>de</strong> Agrobacterium y modificación genética <strong>de</strong> N. tabacum<br />
5. Transferencia <strong>de</strong> explantes a medio <strong>de</strong> selección<br />
6. Preparación <strong>de</strong> material y medios <strong>de</strong> cultivo<br />
7. Transferencia <strong>de</strong> explantes a medio <strong>de</strong> selección fresco<br />
8. Transferencia <strong>de</strong> transformadas a medio para formar raíces<br />
9. Diseño <strong>de</strong> primers<br />
10. PCR confirmatoria <strong>de</strong> la inserción <strong><strong>de</strong>l</strong> transgén<br />
11. Análisis <strong>de</strong> productos <strong>de</strong> PCR en gel <strong>de</strong> agarosa<br />
12. Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
13. Presentación y discusión <strong>de</strong> resultados<br />
Análisis <strong>de</strong> la expresión <strong>de</strong> un gen exógeno en E. coli<br />
8<br />
a. Preparación <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> cultivo y material para la práctica<br />
b. Preparación <strong>de</strong> células competentes <strong>de</strong> E. coli BL21<br />
c. Transformación <strong>de</strong> las células <strong>de</strong> E.coli BL21 con el vector pET16b y<br />
comprobación <strong>de</strong> la inserción <strong>de</strong> este<br />
d. Selección <strong>de</strong> células transformadas<br />
e. Inducción <strong><strong>de</strong>l</strong> gen gfp<br />
f. Separación <strong>de</strong> las proteínas en gel <strong>de</strong> poliacrilamida<br />
g. Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
h. Presentación y discusión <strong>de</strong> resultados<br />
*La sesiones necesarias para la realización <strong>de</strong> cada práctica no son necesariamente continuas.<br />
<strong>Manual</strong> elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Claudio Garibay Orijel, César Agustín<br />
Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez<br />
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Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
<strong>Laboratorio</strong> <strong>de</strong> Ingeniería Genética<br />
Práctica 1<br />
Transformación genética <strong>de</strong> plantas <strong>de</strong> tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando<br />
Agrobacterium tumefaciens<br />
1. INTRODUCCION<br />
La modificación genética <strong>de</strong> plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la<br />
generación <strong>de</strong> especies resistentes a condiciones <strong>de</strong> estrés (sequía, estrés osmótico, etc.),<br />
la mejora nutricional <strong>de</strong> la especies (aumento en el contenido <strong>de</strong> aminoácidos o<br />
precursores <strong>de</strong> vitaminas, etc.), obtención <strong>de</strong> plantas para fitoremediación (remoción <strong>de</strong><br />
metales pesados), la obtención <strong>de</strong> varieda<strong>de</strong>s con flores <strong>de</strong> color no convencional, la<br />
producción <strong>de</strong> alguna proteína o metabolito con propieda<strong>de</strong>s terapéuticas (vacunas,<br />
anticuerpos, alcaloi<strong>de</strong>s, etc.).<br />
Esta última es <strong>de</strong> gran interés para los Ingenieros Biotecnólogos ya que la producción <strong>de</strong><br />
metabolitos y proteínas en plantas presenta varias ventajas en comparación con el resto<br />
<strong>de</strong> los sistemas <strong>de</strong> producción. Algunas <strong>de</strong> estas ventajas son: el costo <strong>de</strong> producción es<br />
en muchos casos menor, hay una mayor facilidad <strong>de</strong> escalamiento, proteínas más<br />
complejas (anticuerpos, proteínas con varios enlaces disulfuro, proteína que requieren un<br />
procesamiento postraduccional, etc.) pue<strong>de</strong>n ser producidas. Adicionalmente, las semillas<br />
y granos pue<strong>de</strong>n ser utilizados como sitio <strong>de</strong> almacenamiento.<br />
La modificación genética <strong>de</strong> plantas pue<strong>de</strong> llevarse a cabo utilizando diferentes métodos<br />
los cuales pue<strong>de</strong>n ser químicos, físicos o biológicos. Entre los métodos químicos se<br />
encuentra el método mediante el cual se permeabiliza la membrana con polietilenglicol<br />
(PEG) con lo cual se facilita la introducción <strong><strong>de</strong>l</strong> material genético. Sin embargo, el<br />
tratamiento con PEG tiene la <strong>de</strong>sventaja <strong>de</strong> que requiere <strong>de</strong> protoplastos en lugar <strong>de</strong><br />
células con pared celular intacta (los protoplastos respon<strong>de</strong>n <strong>de</strong> manera menos eficiente<br />
en cultivo in vitro). Entre los métodos físicos se encuentran principalmente la<br />
microinyección y el bombar<strong>de</strong>o <strong>de</strong> micropartículas (también conocido como biobalística).<br />
Este último, que consiste en la introducción <strong><strong>de</strong>l</strong> material genético al interior <strong><strong>de</strong>l</strong> núcleo<br />
utilizando micropartículas aceleradas <strong>de</strong> oro o tungsteno, ha cobrado particular<br />
importancia en la última década, a pesar <strong><strong>de</strong>l</strong> costo elevado, <strong>de</strong>bido a que es altamente<br />
efectivo y reproducible.<br />
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A pesar <strong>de</strong> ello, el método por excelencia para la modificación genética nuclear <strong>de</strong><br />
plantas es el que utiliza Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens y otras especies<br />
relacionadas como A. rhizogenes y A. vitis, son patógenos no <strong>de</strong>structivos <strong>de</strong> plantas que<br />
tienen la capacidad <strong>de</strong> integrar establemente parte <strong>de</strong> su material genético <strong>de</strong>ntro <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
genoma <strong>de</strong> su hospe<strong>de</strong>ro. El impacto <strong>de</strong> este hallazgo ha tenido gran<strong>de</strong>s aplicaciones en<br />
diversos campos <strong>de</strong> la biología vegetal, agricultura y biotecnología [1].<br />
Des<strong>de</strong> el año 1970 hasta la fecha se ha estudiado a <strong>de</strong>talle el mecanismo por el cual A.<br />
tumefaciens induce la formación <strong>de</strong> tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha<br />
sido fundamental para su uso como herramienta en la ingeniería genética <strong>de</strong> plantas.<br />
Durante el proceso <strong>de</strong> infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte <strong>de</strong><br />
su ADN (ADN <strong>de</strong> transferencia; T-DNA) el cual es integrado <strong>de</strong>ntro <strong><strong>de</strong>l</strong> genoma <strong>de</strong> la<br />
planta. Los genes <strong><strong>de</strong>l</strong> T-DNA son expresados en su hospe<strong>de</strong>ro e inducen la formación <strong>de</strong><br />
tumores y la síntesis <strong>de</strong> aminoácidos no proteicos llamados opinas los cuales son<br />
utilizados por A. tumefaciens como fuente <strong>de</strong> carbono y nitrógeno. El T-DNA esta<br />
localizado en el plásmido Ti (Plásmido inductor <strong>de</strong> tumor; tumor inducing plasmid), que<br />
a<strong>de</strong>más contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e incorporación<br />
<strong><strong>de</strong>l</strong> fragmento <strong>de</strong> ADN en el genoma <strong>de</strong> la planta. La especie A. rhizogenes produce el<br />
crecimiento vigoroso <strong>de</strong> las raíces infectadas mediante un mecanismo semejante al <strong>de</strong> A.<br />
tumefaciens. En este caso el plásmido que contiene el T-DNA es llamado Ri (plásmido<br />
inductor <strong>de</strong> raíces; root inducing plasmid).<br />
Un hallazgo crucial que permitió el diseño <strong>de</strong> vectores para la transformación<br />
genética <strong>de</strong> plantas mediante el uso <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Agrobacterium es el hecho que sólo<br />
las secuencias bor<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>l</strong> T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo.<br />
Algunos o todos los genes bacterianos <strong><strong>de</strong>l</strong> T-DNA pue<strong>de</strong>n ser removidos originando<br />
vectores <strong>de</strong>sarmados, los cuales pue<strong>de</strong>n transformar células vegetales sin los síntomas<br />
generales <strong>de</strong> la infección bacteriana [3].<br />
2. OBJETIVOS<br />
2.1 Objetivo general<br />
<br />
Conocer y aplicar la metodología para llevar a cabo la modificación genética<br />
nuclear <strong>de</strong> Nicotiana tabacum (planta <strong><strong>de</strong>l</strong> tabaco) utilizando Agrobacterium<br />
tumefaciens.<br />
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2.2 Objetivos específicos<br />
<br />
<br />
<br />
Conocer el principio básico <strong>de</strong> la modificación genética nuclear <strong>de</strong> plantas<br />
utilizando un vector binario.<br />
Conocer y llevar a cabo la metodología básica para la obtención <strong>de</strong> plántulas<br />
modificadas genéticamente.<br />
Conocer y llevar a cabo la metodología para la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> plantas<br />
modificadas genéticamente.<br />
3. MATERIALES<br />
3. 1 Materiales biológicos<br />
• Plásmido pROK CRE. Este plásmido es un <strong>de</strong>rivado <strong><strong>de</strong>l</strong> plásmido pBIN 19, el<br />
cual contiene el gen CRE fusionado a la secuencia <strong><strong>de</strong>l</strong> péptido <strong>de</strong> transferencia<br />
RbcS y se encuentra bajo el control <strong><strong>de</strong>l</strong> promotor 35S. Contiene a<strong>de</strong>más el gen<br />
nptII que codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere<br />
resistencia a kanamicina en las células portadoras <strong><strong>de</strong>l</strong> gen.<br />
• Cepa <strong>de</strong> A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plásmido binario <strong>de</strong>sarmado<br />
que porta los genes vir.<br />
• Plantas <strong>de</strong> N. tabacum cultivadas en condiciones <strong>de</strong> asepsia en un cuarto <strong>de</strong><br />
cultivo a 25°C durante 4-6 semanas.<br />
• Primers para la amplificación total o parcial por PCR <strong><strong>de</strong>l</strong> gen nptII.<br />
3.2 Equipos<br />
• Campana <strong>de</strong> flujo laminar, autoclave, potenciómetro, balanza analítica, agitadora<br />
orbital, incubadora a 37°C, parrilla, micro centrifuga,<br />
3. 3 Material <strong>de</strong> laboratorio<br />
• Matraces Erlenmeyer, vasos <strong>de</strong> precipitados <strong>de</strong> 250 mL, juego <strong>de</strong> micropipetas,<br />
cajas Petri <strong>de</strong>sechables, algodón, bisturí, pinzas <strong>de</strong> disección, papel filtro, papel<br />
aluminio, tubos <strong>de</strong>sechables <strong>de</strong> 1.5 mL, tubos <strong>de</strong>sechables <strong>de</strong> 50 mL, un<br />
horadador <strong>de</strong> 0.5 cm <strong>de</strong> diámetro.<br />
3.4 Reactivos y medios <strong>de</strong> cultivos<br />
• Medio LB, Ampicilina 100 mg/mL, Carbamicilina 500 mg/mL, Kanamicina 100<br />
mg/mL, etanol al 70%, solución <strong>de</strong> hipoclorito <strong>de</strong> sodio 5.5 % <strong>de</strong> cloro libre<br />
• (solución al 10% <strong>de</strong> cloro comercial), HCl 1.0 N, NaOH 1N, agua grado biología<br />
molecular.<br />
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4. MÉTODOS<br />
Primera sesión. Preparación <strong>de</strong> material y medios <strong>de</strong> cultivo<br />
Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composición <strong>de</strong><br />
soluciones y reactivos)<br />
ampicilina 100 mg/mL<br />
kanamicina 100 mg/mL<br />
estreptomicina 100 mg/mL<br />
carbamicilina 500 mg/mL<br />
Medio LB<br />
Medio NBM<br />
5 cajas Petri con medio LB y antibióticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina<br />
300 µg/mL.<br />
5 cajas Petri con un disco <strong>de</strong> papel filtro que cubra toda la superficie<br />
50 mL x 5 en matraces <strong>de</strong> 250 mL <strong>de</strong> medio LB liquido con antibióticos:<br />
kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.<br />
50 mL x 5 en matraces <strong>de</strong> 250 mL <strong>de</strong> medio MS0<br />
5 cajas Petri con medio NBM sin antibióticos<br />
5 cajas Petri con medio NBM con antibióticos: kanamicina 100 µg/mL y<br />
carbamicilina 500 µg/mL.<br />
Segunda sesión. Cultivo <strong>de</strong> Agrobacterium en medio sólido.<br />
1. Tomar el stock <strong>de</strong> la cepa <strong>de</strong> A. tumefaciens LBA4404 y sembrar por estría<br />
simple en una <strong>de</strong> las placas con medio LB con kanamicina y estreptomicina.<br />
2. Control positivo. Inocular una cepa silvestre <strong>de</strong> Agrobacterium en otra placa con<br />
medio LB con kan y estr.<br />
3. Incubar ambas cajas a 28 ºC por 36-48 h.<br />
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Tercera sesión. Cultivo <strong>de</strong> Agrobacterium en medio líquido.<br />
1. Transferir una colonia <strong>de</strong> Agrobacterium a un matraz <strong>de</strong> 250 mL con 50 mL <strong>de</strong><br />
medio LB con kan 50 mg/L, estrep 300 mg/mL e incubar en agitación constante (200<br />
rpm) a 28ºC durante 36-48 h.<br />
Cuarta sesión. Preparación <strong>de</strong> Agrobacterium y modificación genética <strong>de</strong> N.<br />
tabacum<br />
1. Centrifugar el cultivo <strong>de</strong> A. tumefaciens obtenido como resultado <strong><strong>de</strong>l</strong> trabajo<br />
experimental <strong>de</strong> la tercera sesión a 7500 rpm por 10 min a 4 ºC en un tubo <strong>de</strong><br />
estéril <strong>de</strong> 50 mL.<br />
2. Decantar el sobrenadante<br />
3. Resuspen<strong>de</strong>r la pastilla celular en 5 mL <strong>de</strong> MS0 (mantener en hielo).<br />
4. Cortar 3-4 hojas <strong>de</strong> plántulas <strong>de</strong> tabaco cultivadas en condiciones <strong>de</strong> asepsia.<br />
5. Colocar las hojas sobre el papel filtro contenido en las cajas Petri.<br />
6. Cortar las hojas con el bisturí y pinzas (o con un horadador) para obtener<br />
explantes <strong>de</strong> 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente. Realizar este paso <strong>de</strong> forma<br />
rápida evitando dañar <strong>de</strong> manera excesiva el tejido.<br />
7. Recuperar los explantes e incubarlos directamente en la suspensión <strong>de</strong> A.<br />
tumefaciens agitando ocasionalmente durante 30 min.<br />
8. Recuperar los explantes con unas pinzas, secar por contacto ligero en papel filtro<br />
estéril.<br />
9. Colocar en las cajas con medio NBM con la epi<strong>de</strong>rmis inferior hacia arriba.<br />
Presionar ligeramente para que los explantes entren en contacto con el medio.<br />
10. Incubar los explantes a 25 ºC con un fotoperiodo <strong>de</strong> 16 h luz durante 48 h.<br />
Quinta sesión. Transferencia <strong>de</strong> explantes a medio <strong>de</strong> selección<br />
1. Después <strong>de</strong> 48 h tomar los explantes (cuarta sesión) y transferirlos a las cajas <strong>de</strong><br />
Petri con medio NBM (kan 100 µg/mL, car 200 µg/mL). Tener cuidado <strong>de</strong> que los<br />
explantes mantengan la misma orientación y <strong>de</strong> dañarlos lo menos posible.<br />
2. Colocar las cajas en incubación a 25 ºC con un fotoperiodo <strong>de</strong> 16 h luz durante 3-<br />
4 semanas.<br />
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Sexta sesión. Preparación <strong>de</strong> material y medios <strong>de</strong> cultivo<br />
1. Preparar el siguiente material:<br />
Medio NBM<br />
5 cajas Petri con medio LB y antibióticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina<br />
300 µg/mL.<br />
5 cajas Petri con un disco <strong>de</strong> papel filtro que cubra toda la superficie<br />
50 mL x 5 en matraces <strong>de</strong> 250 mL <strong>de</strong> medio LB liquido con antibióticos:<br />
kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.<br />
50 mL x 5 en matraces <strong>de</strong> 250 mL <strong>de</strong> medio MS0<br />
5 cajas Petri con medio NBM sin antibióticos<br />
5 cajas Petri con medio NBM con antibióticos: kanamicina 100 µg/mL y<br />
carbamicilina 500 µg/mL.<br />
Séptima sesión. Transferencia <strong>de</strong> explantes a medio <strong>de</strong> selección fresco<br />
a. Después <strong>de</strong> 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con<br />
kanamicina 100 µg/mL. Tener cuidado <strong>de</strong> mantener la misma orientación y <strong>de</strong> no<br />
dañar el tejido. Si los explantes se han expandido mucho y son <strong>de</strong>masiado<br />
gran<strong>de</strong>s, transferirlos a dos cajas.<br />
Octava sesión. Transferencia <strong>de</strong> transformadas a medio para formar raíces<br />
a. Conforme vayan apareciendo, transferir los brotes resistentes a kanamicina a<br />
medio MSB5 con kanamicina (100 mg/ml) y carbamicilina (200 mg/ml) para<br />
favorecer la formación <strong>de</strong> raíces.<br />
Novena sesión. PCR confirmatoria <strong>de</strong> la inserción <strong><strong>de</strong>l</strong> transgén<br />
a. Tomar una porción <strong>de</strong> brote no mayor a 1 mm e incubarla con 20 µL <strong>de</strong> solución<br />
(2 µL buffer 10X, µL dNTP 2mM, 2.5 µL <strong>de</strong> primer F (3pm/ µL), 2.5 µL <strong>de</strong><br />
primer R (3pm/ µL), 3 µL MgCl 2 25mM, 1 µL Taq pol 1u/µmol y 7 µmol agua).<br />
Realizar estos pasos en hielo.<br />
b. Realizar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo <strong>de</strong> 5 min a 94 °C, 35<br />
ciclos <strong>de</strong> 30s a 94°C, 30 s a 55°C, 30s a 72°C y 1 ciclo <strong>de</strong> 5 min a 72°C.<br />
c. Almacenar a -70°C o a -20°C.<br />
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<strong>Laboratorio</strong> <strong>de</strong> Ingeniería Genética<br />
Décima sesión. Análisis <strong>de</strong> productos <strong>de</strong> PCR en gel <strong>de</strong> agarosa<br />
a. Prepara un gel <strong>de</strong> agarosa al 1% siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.<br />
b. En el pozo número 1 <strong><strong>de</strong>l</strong> gel correr el marcador <strong>de</strong> peso molecular<br />
c. Correr el producto <strong>de</strong> PCR obtenido en la novena sesión en un gel <strong>de</strong> agarosa al<br />
1%.<br />
d. Correr también controles negativos y positivos a la par.<br />
e. Teñir el gel con Rojo Texas.<br />
Undécima sesión. Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
Esta sesión será <strong>de</strong>dicada al análisis <strong>de</strong> resultados <strong>de</strong> forma grupal con la mo<strong>de</strong>ración <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
profesor.<br />
Duodécima sesión. Presentación y discusión <strong>de</strong> resultados<br />
Presentación y discusión <strong>de</strong> los resultados por parte <strong>de</strong> los estudiantes <strong>de</strong> forma grupal.<br />
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<strong>Laboratorio</strong> <strong>de</strong> Ingeniería Genética<br />
5. Cuestionario y recomendaciones para el informe<br />
1-. Mencionar 5 recomendaciones para la elaboración <strong>de</strong> primers.<br />
2-. ¿Qué primers se utilizaron en la práctica? Y ¿cuál es el objetivo <strong>de</strong> su uso en la<br />
presente práctica?<br />
3-. ¿Qué es el T-DNA?<br />
4-. Mencionar 5 componentes básicos <strong><strong>de</strong>l</strong> sistema binario <strong>de</strong> vectores utilizado en la<br />
práctica<br />
5-. Mencionar otros métodos <strong>de</strong> transformación <strong>de</strong> plantas así como sus ventajas y<br />
<strong>de</strong>sventajas.<br />
6-. ¿Cuál es el objetivo <strong>de</strong> modificar genéticamente las plantas?<br />
7-. ¿Logró transformar plántulas <strong>de</strong> N.tabacum? ¿Cómo se observan estas<br />
fenotípicamente en comparación con las líneas silvestres? ¿Cómo se observa esto en el<br />
gel <strong>de</strong> electroforesis?<br />
8-. ¿Cuál es el objetivo <strong>de</strong> realizar una PCR en la práctica?, ¿podría eliminar este paso?,<br />
¿bajo que condiciones?<br />
El informe <strong>de</strong> la práctica <strong>de</strong>be contener los resultados <strong>de</strong> los todos los equipos y hacer la<br />
discusión y conclusiones <strong>de</strong> los experimentos realizados.<br />
6. BIBLIOGRAFIA.<br />
[1] Val<strong>de</strong>rrama Fonseca A. M ; Arango Isaza R. ; Afanador Kafuri L. Transformación <strong>de</strong><br />
plantas mediada por Agrobacterium: “Ingeniería genética natural aplicada”.<br />
Rev.Fac.Nal.Agr.Me<strong><strong>de</strong>l</strong>lín.Vol.58, No.1.p.2569-2585.2005.<br />
[2] Tzfira, t.; Vaidya, m. and Citovsky, V. Increasing plant susceptibility to<br />
Agrobacterium infection by overexpression of the Arabidopsis nuclear protein VIP1.<br />
Proceedings of the Natural Aca<strong>de</strong>my of Sciences USA. Vol. 99, No.16 (2002); p.10435-<br />
10440.<br />
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Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez<br />
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<strong>Laboratorio</strong> <strong>de</strong> Ingeniería Genética<br />
[3] Garfinkel, D. J. et al. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the TDNA<br />
by site-directed mutagenesis. Cell. Vol. 27 (1981); p. 143-153.<br />
[4]Bioline. HyperLad<strong>de</strong>r I. Bandas <strong>de</strong> referencia para un gel <strong>de</strong> 1% agarosa.<br />
www.bioline.com/images/gui<strong>de</strong>s/lad<strong>de</strong>rgui<strong>de</strong>/HL1_PopUp.jpg Consulta: 14/Junio/2009<br />
[5] Hansen, G. and Chilton, M-D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe,<br />
in Current Topics in Microbiology and Immunology (Vol. 240), Plant Biotechnology<br />
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Práctica 2<br />
Análisis <strong>de</strong> la expresión <strong>de</strong> un gen exógeno en E. coli<br />
1-. INTRODUCCION<br />
La producción <strong>de</strong> proteínas para diversas aplicaciones ha ido en aumento, pasando <strong>de</strong> la<br />
escala experimental hasta la industrial, en algunos casos. Para ello se han estudiado y<br />
<strong>de</strong>sarrollado diversos sistemas <strong>de</strong> expresión. De todos estos, los sistemas <strong>de</strong> expresión<br />
bacterianos son los más atractivos <strong>de</strong>bido a su rápido crecimiento con alta <strong>de</strong>nsidad en<br />
sustratos <strong>de</strong> bajo costo, genomas ampliamente caracterizados y un creciente número <strong>de</strong><br />
vectores y cepas hospe<strong>de</strong>ras mutantes (Terpe 2006).<br />
E. coli y sistema <strong>de</strong> expresión T7<br />
El sistema bacteriano más utilizado es el que emplea a Escherichia coli, en especial E.<br />
coli BL21 la cual es usada principalmente para la producción <strong>de</strong> proteínas dado que es<br />
una cepa ampliamente estudiada, a<strong>de</strong>más posee algunas características en su genotipo<br />
que la hacen idónea para dicho propósito, <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las que <strong>de</strong>stacan las siguientes:<br />
lon: <strong>de</strong>ficiente en esta proteasa que <strong>de</strong>grada las proteínas heterólogas<br />
ompT negativa <strong>de</strong>grada proteínas extracelulares<br />
F- incapaz <strong>de</strong> generar una sola hebra <strong>de</strong> DNA<br />
gal: <strong>de</strong>ficiente en el metabolismo <strong>de</strong> galactosa<br />
dcm: <strong>de</strong>ficiente en metilación <strong>de</strong> citocinas<br />
Posee un gen <strong>de</strong> RNA pol T7<br />
Con las propieda<strong>de</strong>s antes mencionadas y aprovechando la expresión <strong>de</strong> la RNA pol T7<br />
se pue<strong>de</strong> emplear en conjunto con esta cepa un vector que posea un promotor <strong><strong>de</strong>l</strong> mismo<br />
bacteriófago (T7), por lo cual el sistema <strong>de</strong> vectores pET son la opción a<strong>de</strong>cuada para<br />
introducir transgenes <strong>de</strong> interés.<br />
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Vectores pET<br />
Es una familia <strong>de</strong> vectores <strong>de</strong>rivada <strong><strong>de</strong>l</strong> plásmido pBR322. Poseen una secuencia<br />
consenso <strong>de</strong> alta afinidad a la T7 Pol, y <strong>de</strong> muy baja afinidad a la polimerasa <strong>de</strong> E. coli.<br />
El gen <strong>de</strong> interés esta clonado <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> esta región promotora, por lo que su expresión<br />
en cepas que carecen <strong>de</strong> la polimerasa <strong><strong>de</strong>l</strong> bacteriófago T7 es sumamente baja.<br />
Cuando se conjuga una cepa como BL21 y un plásmido <strong>de</strong> la familia pET se tiene alto<br />
control sobre la expresión <strong>de</strong> la proteína <strong>de</strong> interés pues esta solamente es inducida<br />
cuando se aña<strong>de</strong> al medio <strong>de</strong> cultivo un inductor <strong><strong>de</strong>l</strong> operón lac. Generalmente se utiliza<br />
un inductor “gratuito” como el IPTG.<br />
2-. OBJETIVOS<br />
2.1-. General:<br />
• Expresar un gen exógeno en una cepa <strong>de</strong> E. coli BL21.<br />
2.2-. Específicos:<br />
• Preparar células competentes <strong>de</strong> E. coli BL21<br />
• Transformar células competentes con el plásmido pET16b<br />
• Seleccionar células transformadas por cultivo en medio con penicilina<br />
• Inducir la expresión <strong>de</strong> transgén.<br />
• Detectar la proteína <strong>de</strong> interés en PAGE.<br />
3-. MATERIAL<br />
3.1-. BIOLOGICOS:<br />
Cepa E.coli BL21, vector pET16b con el gen <strong>de</strong> la proteína ver<strong>de</strong> fluorescente gfp <strong>de</strong><br />
Aquea victoria.<br />
3.2-. EQUIPOS<br />
Autoclave, cámaras para electroforesis en gel <strong>de</strong> agarosa, centrifuga, agitadora <strong>de</strong><br />
matraces, incubadora a 37°C<br />
3.3-. MATERIAL DE LABORATORIO<br />
<strong>Manual</strong> elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Claudio Garibay Orijel, César Agustín<br />
Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez<br />
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Matraces, micropipetas y puntas, cajas petri, tubos eppendorf <strong>de</strong> 0.5 mL y <strong>de</strong> 1.5 mL,<br />
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Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez<br />
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4. METODOLOGÍA<br />
Sesión 1. Preparación <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> cultivo y material para la práctica.<br />
Preparar el siguiente material:<br />
• 4 matraces <strong>de</strong> 250 mL con 50 mL <strong>de</strong> medio LB<br />
• 2 tubos <strong>de</strong> 25 mL con 5 mL <strong>de</strong> medio LB<br />
• 500 mL <strong>de</strong> Cloruro <strong>de</strong> Calcio 0.1 M.<br />
• Tubos <strong>de</strong> 1.5 mL y <strong>de</strong> 0.5 mL y puntas estériles <strong>de</strong> 200 µL y 1000 µL<br />
Sesión 2. Preparación <strong>de</strong> células competentes <strong>de</strong> E. coli BL21<br />
Uno <strong>de</strong> los pasos cruciales en cualquier metodología <strong>de</strong> Biología Molecular es la<br />
obtención <strong>de</strong> células competentes, listas para po<strong>de</strong>r amplificar plásmidos o para sobre<br />
producir proteínas <strong>de</strong> interés. El método para hacer células competentes por cloruro <strong>de</strong><br />
calcio es uno <strong>de</strong> los más rutinarios y eficientes, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> ser extremadamente barato.<br />
1. Incubar E. coli a 37°C por 16 h en placas <strong>de</strong> agar LB<br />
2. Transferir una colonia <strong>de</strong> E. coli a 5 mL <strong>de</strong> medio LB e incubar a 37°C con agitación<br />
a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).<br />
3. Transferir 0.5 mL <strong><strong>de</strong>l</strong> cultivo a 50 mL <strong>de</strong> medio LB e incubar a 37°C con agitación,<br />
hasta que la <strong>de</strong>nsidad óptica a 590 nm sea <strong>de</strong> 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)<br />
4. Transferir 50 mL <strong>de</strong> células a un tubo <strong>de</strong> propileno frío y estéril y mantenerlo por 10<br />
min a 4°C.<br />
5. Centrifugar a 6000 rpm por 10 min<br />
6. Decantar el sobrenadante<br />
7. Resuspen<strong>de</strong>r el paquete celular en 25 mL <strong>de</strong> CaCl 2 estéril (0.1 M, frío)<br />
8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4°C.<br />
9. Centrifugar a 6000 rpm por 10 min a 4°C.<br />
10. Decantar el sobrenadante<br />
11. Con la ayuda <strong>de</strong> una pipeta pero con extremo cuidado, resuspen<strong>de</strong>r el paquete celular<br />
en 1-2 mL <strong>de</strong> CaCl 2 estéril (0.1 M, frío).<br />
12. Las células competentes pue<strong>de</strong>n ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-48<br />
h a 4ºC.<br />
13. Para periodos <strong>de</strong> almacenamiento más largos, guardar en alícuotas <strong>de</strong> 100 µL en<br />
tubos estériles <strong>de</strong> 1.5 mL.<br />
14. Guardar la células competentes a -70ºC. Las células se mantienen viables por<br />
aproximadamente 3 meses.<br />
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Sesión 3. Transformación <strong>de</strong> las células <strong>de</strong> E.coli BL21 con el vector pET16b y<br />
comprobación <strong>de</strong> la inserción <strong>de</strong> este.<br />
1. Tomar una alícuota <strong>de</strong> células competentes y <strong>de</strong>jar <strong>de</strong>scongelar en hielo.<br />
2. Manteniendo las células en hielo, adicionar 1-5 µL <strong><strong>de</strong>l</strong> vector.<br />
3. Mezclar suavemente con la punta <strong>de</strong> la pipeta.<br />
4. Mantener en hielo por 5-10 min.<br />
5. Opcional: Transferir el tubo a un baño <strong>de</strong> agua a 42°C por 30 s.<br />
5 a. Adicionar 1 mL <strong>de</strong> medio rico en nutrientes SOC.<br />
5 b. Incubar por 1 h a 37°C con agitación suave.<br />
6. Tomar 100 µL <strong>de</strong> las células competentes y sembra por extensión con varilla en<br />
medio LB suplementado con el antibiótico a<strong>de</strong>cuado.<br />
7. Si se realizó el paso 5, tomar 50, 100 y 200 µL y sembrar igual que en el paso 6.<br />
8. Incubar las cajas a 37°C durante toda la noche (12-16 h).<br />
9. Llevar a cabo los controles correspondientes<br />
Sesión 4. Selección <strong>de</strong> células transformadas.<br />
1. Hacer observaciones <strong>de</strong> las cajas Petri. Poner especial atención a los controles.<br />
2. Almacenar las cajas a 4°C hasta el momento <strong>de</strong> usarlas<br />
3. Tomar una colonia y transferirla a un tubo con 5 mL <strong>de</strong> medio LB con ampicilina<br />
100 µg/mL.<br />
4. Incubar los tubos en agitación durante toda la noche (12-16 h) con agitación<br />
constante (>200 rpm) a 37°C<br />
Sesión 5. Inducción <strong><strong>de</strong>l</strong> gen gfp<br />
1. Transferir 0.5 mL <strong><strong>de</strong>l</strong> cultivo obtenido en la sesión 4 a 50 mL <strong>de</strong> medio LB (Amp<br />
100 µg/mL) en matraces <strong>de</strong> 250 mL.<br />
2. Incubar los matraces en agitación durante 4-5 h con agitación constante (>200<br />
rpm) a 37°C.<br />
3. Después <strong>de</strong> 4-5 h tomar una muestra <strong>de</strong> 1 mL<br />
a. Centrifugar por 5 min a 7500 rpm a temperatura ambiente<br />
b. Desechar el sobrenadante<br />
c. Congelar la pastilla celular a -20°C hasta su uso posterior<br />
4. Después <strong>de</strong> tomar la muestra, adicionar IPTG 1 mM y continuar incubando los<br />
matraces en agitación durante 6 h con agitación constante (>200 rpm) a 37°C.<br />
5. Tomar y procesar muestras cada hora como se <strong>de</strong>scribe en el paso 3.<br />
6. Después <strong>de</strong> 6 h esterilizar y <strong>de</strong>sechar el cultivo<br />
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Sesión 6. Separación <strong>de</strong> las proteínas en gel <strong>de</strong> poliacrilamida<br />
1. Preparar el gel <strong>de</strong> poliacrilamida siguiendo las instrucciones recibidas.<br />
2. Adicionar 5-10 µL <strong><strong>de</strong>l</strong> buffer <strong>de</strong> carga directamente a las muestras congeladas.<br />
3. Mezclar suavemente y hacer un orificio en la tapa <strong><strong>de</strong>l</strong> tubo<br />
4. Incubar por 5-10 min a 95°C en un baño <strong>de</strong> agua o en un termobloque<br />
5. Retirar <strong><strong>de</strong>l</strong> calor y colocar inmediatamente en hielo durante 10-15 min.<br />
6. Centrifugar brevemente para colectar la muestra en el fondo <strong><strong>de</strong>l</strong> tubo.<br />
7. Cargar en los pozos <strong><strong>de</strong>l</strong> gel.<br />
8. Correr el gel a 70 mA hasta que el buffer <strong>de</strong> carga llegue casi a la base <strong><strong>de</strong>l</strong> gel.<br />
9. Desmontar el equipo<br />
10. Colocar el gel en una solución <strong>de</strong> azul <strong>de</strong> Coomassie durante toda la noche.<br />
Sesión 7. Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
Esta sesión será <strong>de</strong>dicada al análisis <strong>de</strong> resultados <strong>de</strong> forma grupal con la<br />
mo<strong>de</strong>ración <strong><strong>de</strong>l</strong> profesor.<br />
Sesión 8. Presentación y discusión <strong>de</strong> resultados<br />
Presentación y discusión <strong>de</strong> los resultados por parte <strong>de</strong> los estudiantes <strong>de</strong> forma<br />
grupal.<br />
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5-. CUESTIONARIO Y RECOMENDACIONES PARA EL INFORME ESCRITO<br />
1. ¿Qué características tiene la cepa <strong>de</strong> E.coli BL21<br />
2. Mencione como funciona el sistema <strong>de</strong> vectores PET y que ventajas tiene en<br />
comparación con otros vectores<br />
3. ¿Cuál es el peso molecular <strong>de</strong> la proteína codificada?<br />
4. ¿Qué es el IPTG?<br />
5. Una vez que adicionó IPTG a la muestra, ¿Qué paso con la biomasa?, aumento,<br />
diminuyó, permaneció igual ¿cómo pue<strong>de</strong> confirmarlo?<br />
6. Incluir en su informe, al menos un artículo, reciente, sobre el tema<br />
7. ¿Cuál sería el comportamiento observado en el gel, si se continuara con la cinética?<br />
En una producción <strong>de</strong> una proteína recombinante X, cuyo material genético es insertado a<br />
la célula por un sistema <strong>de</strong> vectores PET, según lo experimentado ¿cuál es el tiempo<br />
recomendado para inactivar a las células? ¿Porqué?<br />
6. BIBLIOGRAFÍA<br />
1-. Terpe Kay (2006). Overview of bacterial expresión systems for heterologous protein<br />
production: from molecular and biochemical Fundamentals to comercial systems.<br />
Microbiol Biotechnol.<br />
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Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez<br />
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ANEXO I<br />
Medio Luria Bertani (LB) .<br />
Extracto <strong>de</strong> Levadura 5 g/L<br />
Triptona <strong>de</strong> Caseína 10 g/L<br />
Cloruro <strong>de</strong> Sodio 10 g/L<br />
pH 7.0<br />
Medio SOC<br />
Extracto <strong>de</strong> Levadura 5 g/L<br />
Triptona <strong>de</strong> Caseína 20 g/L<br />
Cloruro <strong>de</strong> Sodio 0.5 g/L<br />
Cloruro <strong>de</strong> potasio 2.5 mM<br />
pH 7.0<br />
Después <strong>de</strong> esterilizar adicionar 20 mL/L <strong>de</strong> glucosa 1 M (filtrado 0.22 µm).<br />
Antibióticos<br />
Estreptomicina<br />
Kanamicina<br />
Ampicilina<br />
Carbamicilina<br />
300 mg/ml<br />
25 mg/ml<br />
100 mg/ml<br />
200 mg/ml<br />
Medio Base Murashigue y Skoog (MS)<br />
MS I ( Macronutrientes )<br />
mg/L<br />
NH 4 NO 3 1650<br />
KNO 3 1900<br />
CaCl 2 .2H 2 O 440<br />
MgSO 4 .7H 2 O 370<br />
<strong>Manual</strong> elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Claudio Garibay Orijel, César Agustín<br />
Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez<br />
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KH 2 PO 4 170<br />
MS II ( Micronutrientes )<br />
IK 0.83<br />
H 3 BO 3 6.2<br />
MnSO 4 .4H 2 O 22.3<br />
ZnSO 4 .7H 2 O 8.6<br />
NaMoO 4 .2H 2 O 0.25<br />
CuSO 4 ..5H 2 O 0.025<br />
CoCl 2 .6H 2 O 0.025<br />
MS III ( Fe- EDTA )<br />
EDTA 37.3<br />
FeSO 4 .7H 2 O 27.8<br />
MS0<br />
Medio Base MS<br />
Sacarosa<br />
30 g/L<br />
pH 5.5<br />
MSB5<br />
Medio MS0<br />
Inositol<br />
1 mg/L<br />
Piridoxina<br />
0.1 mg/L<br />
Tiamina<br />
2 mg/L<br />
Ácido Nicotínico<br />
0.1 mg/L<br />
pH 6<br />
NBM<br />
Medio MSB5<br />
Ácido Naftalen Acético (NAA) 0.1 mg/L<br />
Benzil Aminopurina (BAP) 1 mg/L<br />
pH 5.9<br />
<strong>Manual</strong> elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Claudio Garibay Orijel, César Agustín<br />
Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez<br />
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<strong>Laboratorio</strong> <strong>de</strong> Ingeniería Genética<br />
ANEXO II<br />
PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD<br />
En Biología Molecular se emplean algunos reactivos químicos peligrosos, por esta razón<br />
el frasco que contiene el reactivo, <strong>de</strong>berá llevar una etiqueta que <strong>de</strong>scriba la naturaleza <strong>de</strong><br />
riesgo y los procedimientos <strong>de</strong> seguridad que <strong>de</strong>berán seguirse, cuando se trabaja en un<br />
laboratorio con técnicas <strong>de</strong> Biología <strong>de</strong> Molecular.<br />
Los químicos peligrosos se pue<strong>de</strong>n clasificar en tres categorías:<br />
Solventes orgánicos. Uno <strong>de</strong> los disolventes orgánicos más peligroso, que se emplea en<br />
Biología Molecular, es el fenol. Este es altamente corrosivo y pue<strong>de</strong> causar quemaduras<br />
severas; cuando se emplee este reactivo se <strong>de</strong>ben utilizar guantes y lentes <strong>de</strong> seguridad,<br />
su manejo <strong>de</strong>be hacerse en campana <strong>de</strong> extracción.<br />
Mutágenos y carcinógenos. La mayoría <strong>de</strong> los químicos que se unen al DNA son<br />
mutágenos y/o carcinógenos. Un ejemplo es el bromuro <strong>de</strong> etidio empleado para la<br />
<strong>de</strong>tección <strong><strong>de</strong>l</strong> DNA en geles <strong>de</strong> agarosa.<br />
Químicos tóxicos. En el laboratorio <strong>de</strong> Biología Molecular se emplea la acrilamida, este<br />
compuesto pue<strong>de</strong> tener efectos neurotóxicos (si hay contacto con la piel o por inhalación.<br />
Otro químico con el que se <strong>de</strong>be tener sumo cuidado es el laurel sulfato <strong>de</strong> sodio (SDS).<br />
Al pesar SDS se recomienda usar una mascara al terminar <strong>de</strong> pesar limpiar bien la<br />
balanza, ya que los cristales se dispersan fácilmente.<br />
El manejo a<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> cualquier compuesto tóxico reduce notablemente su peligrosidad.<br />
Por lo que se recomienda usar siempre guantes; al medir soluciones con pipeta, nunca<br />
<strong>de</strong>berá hacerse con la boca, para este fin se recomienda el uso <strong>de</strong> una propipeta y si por<br />
acci<strong>de</strong>nte se tiene contacto con alguno <strong>de</strong> estos compuestos en la piel, el área afectada<br />
<strong>de</strong>be lavarse con agua en abundancia y se informará <strong>de</strong> inmediato al encargado <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
laboratorio.<br />
Los <strong>de</strong>sperdicios conteniendo los químicos peligrosos mencionados se <strong>de</strong>ben <strong>de</strong>positar en<br />
contenedores apropiados y no mezclarse con los <strong>de</strong>sechos comunes. Y se <strong>de</strong>be tomar en<br />
cuenta las siguientes indicaciones:<br />
<strong>Manual</strong> elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Claudio Garibay Orijel, César Agustín<br />
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1. Es importante usar un sistema para el manejo a<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> residuos contaminados con<br />
bromuro <strong>de</strong> etidio (EtBrom) tanto sólidos o líquidos. No se <strong>de</strong>ben <strong>de</strong>sechar junto con los<br />
<strong>de</strong>más <strong>de</strong>sechos. Y sobre todo es importante jamás calentar el bromuro <strong>de</strong> etidio. El<br />
buffer <strong>de</strong> electroforesis se pue<strong>de</strong> re usar pero jamás usar este para preparar la agarosa<br />
pues ya contiene EtBrom. Se recomienda usarlo únicamente cuando sea estrictamente<br />
necesario. Y en lugar <strong>de</strong> este, usar otros reactivos para tinción <strong>de</strong> DNA en geles como:<br />
SYBR Green, SYBR Safe, Gel Red o Syber Gold.<br />
2. La disposición <strong>de</strong> la acrilamida <strong>de</strong>be <strong>de</strong> ser en forma similar. Y <strong>de</strong> preferencia la<br />
acrilamida que se compre <strong>de</strong>be <strong>de</strong> ser ya disuelta, en una solución al 30 % que solo<br />
requiere ser diluida. Con lo que se ahorran todos los problemas <strong>de</strong> pesarla cuando esta en<br />
polvo y disminuye los riesgos <strong>de</strong> toxicidad. Aun ya polimerizada hay siempre residuos<br />
que son tóxicos, por lo que jamás <strong>de</strong>be <strong>de</strong> ser tocada con las manos.<br />
Bibliografía<br />
Sambrook, J. & D. Russel 2001. Molecular Cloning Book 1. 3ra. ed., Cold Spring Harbor<br />
Laboratory Press USA<br />
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