AC 2005 Vol-1.pdf - Cecmed - Infomed

34
Métodos para la evaluación...
Según la Farmacopea Europea [31], el
empleo de ratones B6D2F1 de 8 semanas,
es adecuado para el desarrollo del ensayo
en ratones normocitémicos con una dosis
única. Igualmente señala el uso de la
citometría de flujo para el recuento de
reticulocitos. Otros reportes [36, 37]
plantean con buenos resultados, el uso de
ratones hembras CF1 y BALB/c de 8
semanas con múltiples inyecciones, así
como distintas variantes para el conteo no
automatizado de reticulocitos.
Métodos para el conteo de reticulocitos
El número de reticulocitos en circulación
es un indicador temprano del estatus
funcional de la eritropoyesis.
El contenido de RNA de los hematíes es
directamente proporcional a la edad
celular, siendo mayor en las células más
jóvenes y ausente en la forma madura.
Heilmeyer y Wethauser (1932) [38],
clasificaron los reticulocitos en 4 estados
(I, II, III y IV), reflejando el incremento de
la madurez eritroide basado en el patrón de
precipitación de RNA teñido con azul de
metileno. Los reticulocitos son eritrocitos
inmaduros que han perdido el núcleo, pero
que contienen organelos residuales (es
decir, ribosomas y mitocondrias), los
cuales contienen ácido ribonucleico
(RNA) y ácido desoxirribonucleico
(DNA), aspecto que los hace fácilmente
reconocibles por microscopía. [25, 33]. El
conteo del número de reticulocitos resulta
de gran valor en la clínica en el
diagnóstico de la anemia.
Métodos manuales y automatizados han
sido aplicados para la medición de
reticulocitos en ratones tratados con
rhEPO. El conteo visual usando tinciones
supravitales tales como azul brillante de
cresil (BSB), se ha reportado que puede
tener amplia variabilidad intra-observador,
que es de larga duración y frecuentemente
no confiable [39, 40]. No obstante, otros
autores plantean que esta variación, puede
minimizarce al realizar la lectura de tres
láminas independientes del mismo animal.
Este método es un aún ampliamente usado
en laboratorios químicos clínicos.
Por otro lado, se reporta la hemolisis
selectiva y el conteo de reticulocitos en
cámara de Neubauer los cuales han
mostrado correlación y resultados
equivalentes al método automatizado [30,
40, 41]. Aunque la hemolisis, se ha
señalado, también constituye una técnica
muy larga y trabajosa necesitándose dos o
más ensayos independientes para alcanzar
la precisión necesaria.
El método automatizado se ha desarrollado
en procedimientos basados en la
fluorescencia o absorbancia de colorantes
(naranja de tiazol y azul de metileno
respectivamente) que interactúan con el
RNA del reticulocito. La precisión y
exactitud del conteo han sido
marcadamente
desarrolladas,
adicionándose numerosos parámetros a la
investigación [40,42].
En el método estándar para el recuento de
reticulocitos que utiliza el colorante vital
Nuevo Azul de Metileno, las muestras de
sangre se tiñen con este reactivo, se
prepara un extendido y luego las células
teñidas se cuentan con un microscopio de
luz [43]. Sin embargo, este método es muy
laborioso y está limitado por el error de
muestreo estadístico inherente a un
recuento de mil células. Cuando se
emplean modificaciones del mismo, se ha
reportado disminución aún más de la
reproducibilidad [44].
La variabilidad que se reporta en general
en el conteo manual de reticulocitos entre
observadores y el reducido valor de células
contadas, ha sido atribuido a
inconsistencia en la clasificación de la
mayor parte de los reticulocitos maduros