AC 2005 Vol-1.pdf - Cecmed - Infomed
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34<br />
Métodos para la evaluación...<br />
Según la Farmacopea Europea [31], el<br />
empleo de ratones B6D2F1 de 8 semanas,<br />
es adecuado para el desarrollo del ensayo<br />
en ratones normocitémicos con una dosis<br />
única. Igualmente señala el uso de la<br />
citometría de flujo para el recuento de<br />
reticulocitos. Otros reportes [36, 37]<br />
plantean con buenos resultados, el uso de<br />
ratones hembras CF1 y BALB/c de 8<br />
semanas con múltiples inyecciones, así<br />
como distintas variantes para el conteo no<br />
automatizado de reticulocitos.<br />
Métodos para el conteo de reticulocitos<br />
El número de reticulocitos en circulación<br />
es un indicador temprano del estatus<br />
funcional de la eritropoyesis.<br />
El contenido de RNA de los hematíes es<br />
directamente proporcional a la edad<br />
celular, siendo mayor en las células más<br />
jóvenes y ausente en la forma madura.<br />
Heilmeyer y Wethauser (1932) [38],<br />
clasificaron los reticulocitos en 4 estados<br />
(I, II, III y IV), reflejando el incremento de<br />
la madurez eritroide basado en el patrón de<br />
precipitación de RNA teñido con azul de<br />
metileno. Los reticulocitos son eritrocitos<br />
inmaduros que han perdido el núcleo, pero<br />
que contienen organelos residuales (es<br />
decir, ribosomas y mitocondrias), los<br />
cuales contienen ácido ribonucleico<br />
(RNA) y ácido desoxirribonucleico<br />
(DNA), aspecto que los hace fácilmente<br />
reconocibles por microscopía. [25, 33]. El<br />
conteo del número de reticulocitos resulta<br />
de gran valor en la clínica en el<br />
diagnóstico de la anemia.<br />
Métodos manuales y automatizados han<br />
sido aplicados para la medición de<br />
reticulocitos en ratones tratados con<br />
rhEPO. El conteo visual usando tinciones<br />
supravitales tales como azul brillante de<br />
cresil (BSB), se ha reportado que puede<br />
tener amplia variabilidad intra-observador,<br />
que es de larga duración y frecuentemente<br />
no confiable [39, 40]. No obstante, otros<br />
autores plantean que esta variación, puede<br />
minimizarce al realizar la lectura de tres<br />
láminas independientes del mismo animal.<br />
Este método es un aún ampliamente usado<br />
en laboratorios químicos clínicos.<br />
Por otro lado, se reporta la hemolisis<br />
selectiva y el conteo de reticulocitos en<br />
cámara de Neubauer los cuales han<br />
mostrado correlación y resultados<br />
equivalentes al método automatizado [30,<br />
40, 41]. Aunque la hemolisis, se ha<br />
señalado, también constituye una técnica<br />
muy larga y trabajosa necesitándose dos o<br />
más ensayos independientes para alcanzar<br />
la precisión necesaria.<br />
El método automatizado se ha desarrollado<br />
en procedimientos basados en la<br />
fluorescencia o absorbancia de colorantes<br />
(naranja de tiazol y azul de metileno<br />
respectivamente) que interactúan con el<br />
RNA del reticulocito. La precisión y<br />
exactitud del conteo han sido<br />
marcadamente<br />
desarrolladas,<br />
adicionándose numerosos parámetros a la<br />
investigación [40,42].<br />
En el método estándar para el recuento de<br />
reticulocitos que utiliza el colorante vital<br />
Nuevo Azul de Metileno, las muestras de<br />
sangre se tiñen con este reactivo, se<br />
prepara un extendido y luego las células<br />
teñidas se cuentan con un microscopio de<br />
luz [43]. Sin embargo, este método es muy<br />
laborioso y está limitado por el error de<br />
muestreo estadístico inherente a un<br />
recuento de mil células. Cuando se<br />
emplean modificaciones del mismo, se ha<br />
reportado disminución aún más de la<br />
reproducibilidad [44].<br />
La variabilidad que se reporta en general<br />
en el conteo manual de reticulocitos entre<br />
observadores y el reducido valor de células<br />
contadas, ha sido atribuido a<br />
inconsistencia en la clasificación de la<br />
mayor parte de los reticulocitos maduros