AC 2005 Vol-1.pdf - Cecmed - Infomed

129 Trabajo experimental
de 1µg/mL), a razón de 100 µL por
pocillo. Luego la placa se incuba 1 hora y
media a 37 °C y se realizan 3 lavados con
tampón de lavado (PBS + Tween 20 1%).
Posteriormente, se añade como bloqueo
una solución de albúmina de suero bovino
al 1% en agua destilada (100 µL por
pocillo) y se incuba a 37 °C durante media
hora. Concluido este tiempo, se aplican los
sueros de ensayo (más el control positivo),
y controles negativos (suero de conejos
obtenido antes de inmunizar), diluidos
1/50 en una solución de PBS + albúmina
de suero bovino + Tween 20 + EDTA sal
disódica, incubándose las mismas durante
hora y media a temperatura ambiente. Una
vez finalizado el tiempo de incubación, se
lava y se aplica el conjugado de IgG anti –
conejo acoplado a peroxidasa de rábano
picante (100 µL por pocillo), a una
dilución 1/10000 en el mismo diluente de
muestra. La placa, se incuba nuevamente
una hora a 37 °C. Después del
correspondiente lavado se añade como
sustrato ortofenilendiamina (OPD) (100
µL por pocillo), en tampón fosfato citrato
+ peróxido de hidrógeno y se incuba a
temperatura ambiente. Media hora más
tarde, la reacción se detiene con solución
de ácido sulfúrico 2M (50 µL por pocillo)
(hay un cambio de coloración de amarillo
a naranja – marrón), y la absorbancia de
los pocillos se lee a 492 nm en un lector de
placas. Los sueros fueron considerados
positivos de anticuerpos anti – PRP si las
absorbancias de los sueros de ensayo son
superiores a la suma de la media + 2 veces
la desviación estándar de las absorbancias
de los controles negativos [9].
El porcentaje de seroconversión se calcula
por la siguiente fórmula:
% de seroconvertidos = Ni / N x 100
Ni: cantidad de conejos seroconvertidos
por lote
N: cantidad total de conejos utilizados para
un lote
Evaluación y estandarización del ensayo
de Inmunogenicidad en conejos.
Para la evaluación del ensayo de
Inmunogenicidad de vacunas Hib en
conejos, transferido del CIGB a nuestro
laboratorio, se utilizaron 2 lotes de la
vacuna Vaxem-Hib, 0721 y 0831 (en el
momento de la evaluación no contábamos
con producción de vacuna Quimi-Hib).
Ambas muestras, fueron evaluadas bajo 2
variantes diferentes como se muestra a
continuación:
• El método del CIGB (I): Se utilizaron 5
conejos blancos de Nueva Zelandia por
lote, con inoculación de 0.5 mL por
animal a los 0 y a los 14 días y
desangrado a los 21. Este procedimiento
está más bien dirigido a monitorear la
respuesta inmunológica primaria.
• El método del NIBSC (National Institute
for Biological Standards and Control,
UK) (II): Se utilizó el mismo número de
animales y dosis idénticos, pero con
esquema de inoculación a los 0 y 28 días
y desangrado a los 42 días. Este
procedimiento está fundamentalmente
dirigido a monitorear la respuesta
inmunológica secundaria.
Para la estandarización se evaluaron los
siguientes parámetros:
• Sensibilidad/Especificidad: Se determinó
si los métodos eran capaces de generar
diferentes respuestas sobre la base de
que se estaba evaluando una vacuna
conjugada a CRM 197 bajo esquemas
diferentes. Además, se evaluó si existía
un sesgo en las respuestas de controles
positivos (suero anti-PRP de conejo
suministrado por el CIGB), controles
negativos (suero de conejo obtenido en
nuestro Vivario antes de la