Berichrom® Heparin - Medcorp

Berichrom ® Heparina
Campo de aplicação e objectivo
Berichrom Heparina é um teste cromogénico para determinação da actividade de heparina
no plasma e na vigilância da terapia pela heparina.
Significado diagnóstico
Heparina acelera notavelmente a inactivação do factor Xa (F Xa) e da trombina por meio
de antitrombina (AT) III. Preparados de heparina não fraccionados e de baixo peso molecular
têm por isso larga difusão terapêutica como anticoagulantes. Por múltiplas razões, o efeito
da heparina varia muito de indivíduo para indivíduo, não obstante igual posologia. O teste
Berichrom Heparina permite controlar tratamentos pela heparina, não só por heparinas de
baixo peso molecular (HBPM) mas também por heparinas não fraccionadas (HNF).
Princípio metodológico
Durante a fase de incubação, o F Xa é inactivado por AT III. Esta reacção é catalisada pela
heparina. Sulfato de dextrano (SD) liberta novamente a heparina ligada a factores
interferentes, tornando-a assim mensurável. Mediante um substrato cromógeno, o F Xa
residual após a fase de incubação é medido num teste cinético na base do aumento da
extinção a 405 nm.
Heparina ligada
+ SD
> SD ligado
+ Heparina livre
Heparina
F Xa + AT III amostra
excesso
> [F Xa-AT III] + F Xaresidual
F XA
Substrato cromógeno
residual > tripéptido + corante
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
Testkit para 3 x 20 determinações semimicro, código OWLD
3 x para 10 ml Reagente F Xa
3 x para 10 ml Reagente sulfato de dextrano
3 x para 1 ml Reagente AT III
3 x para 2ml Reagente substrato
Composição
Reagente F Xa: liofilizado; fracção plasmática (humana) com adição de tampão Tris (6 g/l),
cloreto de sódio (12 g/l) e EDTA (0,74 g/l)
Conservante: azida de sódio (< 1 g/l)
Reagente sulfato de dextrano, liofilizado; concentração da solução de uso: 0,02 g/l
Reagente AT III (humano), liofilizado; concentração da solução de uso: 1 UI/ml
Conservante: azida de sódio (< 1 g/l)
Reagente substrato, liofilizado; concentração da solução de uso: Z-D-Leu-Gli-Arg-ANBAmetilo-amida
4 mmol/l.
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro.
2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de
azida de sódio:
Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas!
Com metais pesados, como cobre ou chumbo, a azida de sódio pode formar azidas
explosivas!
3. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de Reagente Factor Xa ou
Reagente AT III foi sujeita a testes de detecção de HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 e anti-
HIV2. Utilizadas foram unicamente preparações achadas negativas.
Além disso, no decurso da fabricação, todos os materiais de origem humana são
aquecidos durante 10 horas em solução a +60 °C para inactivação de vírus.
Não obstante, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manejados
com as precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em
caso de risco biológico, uma vez que nunca se pode excluir inteiramente o risco de
contaminação por agentes patogénicos 3 .
Preparação dos reagentes
Reagente sulfato de dextrano: reconstituir o liofilizado com a quantidade de água destilada
indicada no rótulo.
Reagente F Xa: reconstituir o liofilizado com a quantidade de sulfato de dextrano
reconstituído indicada no rótulo e levar a +37 °C antes do uso.
Reagente AT III: reconstituir com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e levar
à temperatura ambiente antes do uso.
Reagente substrato: reconstituir com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e
levar a +37 °C antes do uso.
Estabilidade e condições de conservação
Não abertos, e conservados entre +2 e +8 °C, os reagentes mantêm-se utilizáveis até à
data indicada no rótulo.
Estabilidade após reconstituição:
Temperatura F Xa AT III Reagente substrato
+37 °C 4 horas – 1 semana
+15 a +25°C 3 dias 1 semana 2 semanas
+2 a +8°C 2 semanas 2 semanas 6 semanas
–20°C 2 meses 2 meses 6 meses
As soluções podem ser congeladas até 3 vezes nos frascos originais.
Outro material necessário
Plasma humano standard, código ORKL
Ácido acético a 20% (só para o método de dois pontos)
Amostras
Para obtenção do plasma, misturar cuidadosamente, evitando formação de espuma, 1
parte de solução de citrato de sódio (0,11 mol/l) com 9 partes de sangue venoso. Centrifugar
imediatamente durante 10 min, pelo menos, a uma velocidade de, pelo menos, 1.500 x g.
Estabilidade da amostra:
–20 °C 1 mês
+15 a +25 °C 8 horas
Plasmas conservados a -20 °C devem ser descongelados dentro de 10 min a 37 °C e o
teste realizado dentro das 8 horas seguintes.
Método
Procedimento
Cuvete
1 cm de trajecto óptico
Comprimento de onda: 405 nm
Temperatura de teste: +37 °C
Levar previamente o reagente Factor Xa e o reagente substrato, assim como os tubos ou
cuvetes de plástico, a 37 °C e o reagente AT III à temperatura ambiente (+15 a +25 °C).
Método cinético
Amostra 150 µl
Reagente AT III 150 µl
Reagente Factor Xa 500 µl
misturar e deixar incubar exactamente 1 min a +37 °C
Reagente substrato 100 µl
misturar e medir a ∆ E 405 nm
/min
Protocolo para o Chromotimer: para os mesmos tempos de incubação, usar a metade dos
volumes indicados.
Método de dois pontos (determinação semimicro)
Amostra
Branco
Ácido acético al 20% – 500 µl
Amostra 150 µl 150 µl
Reagente AT III 150 µl 150 µl
Reagente Factor Xa 500 µl 500 µl
misturar e deixar incubar exactamente durante 1 min a +37°C.
Reagente substrato 100 µl 100 µl
misturar imediatamente e após exactamente 1 min, adicionar:
Ácido acético a 20% 500 µl
misturar imediatamente e determinar a extinção dentro de 2 horas em confronto com
o branco.
Avaliação dos resultados
A avaliação faz-se com base numa curva de referência previamente estabelecida com o
preparado de heparina utilizado e segundo o mesmo método de análise. Diluir este a 10
UI/ml em solução salina isotónica (0,9%). Diluir então 100 µl desta diluição com 900 µl de
um plasma de pool isento de heparina ou de um plasma standard (por ex. o Plasma standard
humano), de modo a obter uma concentração de 1 UI/ml. As proporções de diluição para
a curva de referência (âmbito de 0 a 1 UI de heparina/ml) obtêm-se da seguinte tabela:
Concentração Plasma normal Plasma heparinizado
de heparina ou standard 1 UI/ml
UI/ml µl µl
1,05 1000 1000
0,75 1250 1750
0,55 1500 1500
0,25 1750 1250
0,15 1900 1100
0 15 1000 1000
Observações
1. A multiplicação ou divisão dos volumes por 2 não influi nos resultados.
2. Utilizar o plasma sem o diluir. Se os valores forem superiores ao âmbito de medição
calibrado, diluir as amostras com solução de AT III ou um plasma normal isento de
heparina (por ex. Plasma standard humano). Converter depois de modo correspondente
os resultados obtidos.
3. Se a concentração de heparina for muito fraca, pode aumentar-se a sensibilidade do
teste prolongado até 3 minutos o tempo de incubação. É então necessário determinar
os resultados com uma curva de referência estabelecida igualmente com 3 minutos de
incubação e diluições adicionais do standard.
4. Fornecem-se a pedido protocolos específicos para analisadores automáticos.
Controlo interno de qualidade
Para cada série de medições, incluir pelo menos 2 controlos com diferentes concentrações
de heparina. Se os valores esperados não forem encontrados, os resultados das amostras
de pacientes não podem ser utilizados.
Como controlo, pode utilizar-se:
um plasma normal isento de heparina (por ex. Plasma-controlo N), para o controlo da
estabilidade do reagente e do ponto zero da curva de referência;
um plasma normal (por ex. Plasma-controlo N) levado a uma concentração correspondente
(por ex. 0,5 UI/ml) ao preparado de heparina a medir, para o controlo da sensibilidade e da
reprodutibilidade.
Limitações e fontes de erro
Para se poder obter resultados reproduzíveis, é necessário respeitar exactamente os tempos
de incubação.
Características do teste
Sensibilidade
O limite de identificação para heparina não fraccionada é de 0,05 UI/ml.
Especificidade
A determinação de heparina com Berichrom Heparina não é perturbada pelo factor 4 das
plaquetas (PF4)
Precisão e reprodutibilidade
Para concentrações de heparina de 0,5 UI/ml, o coeficiente de variação varia entre 4,0 a
7,0% na série, e entre 6,9 e 7,1% no teste de dia a dia.
Comparação de métodos
Numa comparação de Berichrom Heparina com outro método cromogénico foram
encontrados coeficientes de correlação de 0,94 e 0,97%.
Bibliografia
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
Fabricante: Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg/Germany
Distribuidor: Dade Behring Portugal
Meios de Diagnóstico Médico Lda.
Estrada Nacional Lisboa/Sintra, Km 15
Apartado 145
P-2726-901 Mem Martins Codex
OWLD G11 E0532 (1211) H 6
Edição Agosto 2000
Dade Behring Marburg GmbH,
D-35041 Marburg/Germany