Berichrom® Heparin - Medcorp

Berichrom ® Heparina
Campo de aplicación y finalidad de su empleo
Berichrom Heparina es una prueba cromógena para la determinación de la actividad
heparínica en el plasma y para el control de la terapéutica heparínica.
Importancia diagnóstica
La heparina acelera considerablemente la inactivacion del factor de coagulación Xa y de
la trombina mediante la antitrombina III. Por ello, el uso de los preparados de heparina sin
fraccionar y de bajo peso molecular encuentran un dilatado campo de aplicación como
anticoagulantes. Aun con la misma dosificación, el efecto de la heparina varía de un paciente
a otro, pues está sometido a la influencia de múltiples factores. Con Berichrom Heparina
se puede controlar tanto la terapéutica con preparados heparínicos de bajo peso molecular
(LMW) como con preparados de heparina sin fraccionar.
Principio del método
El factor Xa es inactivado por el reactivo AT III durante la fase de incubación. Esta reacción
es catalizada mediante heparina. El dextransulfato (DS) libera la heparina fijada en los
factores de perturbación y hace posible su determinación. El factor Xa restante después
de la fase de incubación se determina en una prueba cinética mediante el aumento de la
extinción a 405 nm utilizando un sustrato cromógeno.
heparina fijada
+ DS
> DS fijado
+ heparina libre
heparina
F Xa + AT III muestra
excedente
> [F Xa-AT III] + F XAresto
F XA
sustrato cromógeno
resto > tripéptido + colorante
Reactivos
Contenido del envase
Equipo de prueba para 3 x 20 semimicrodeterminaciones, N° de pedido OWLD
3 x para 10 ml de Reactivo Factor Xa
3 x para 10 ml de Reactivo de dextransulfato
3 x para 11 ml de Reactivo AT III
3 x para 12 ml de Reactivo sustrato
Composición
Reactivo de Factor Xa, liofilizado; fracción de plasma (humano) con adición de Tris
(6 g/l), cloruro de sodio (12 g/l) y EDTA (0,74 g/l)
Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l)
Reactivo de dextransulfato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 0,02 g/l
Reactivo AT III (humano), liofilizado; concentración en la solución de uso: 1 UI/ml
Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l)
Reactivo sustrato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 4 mmol/l de Z-D-Leu-
Gly-Arg-ANBA-metilamida
Advertencias y medidas de precaución
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro
2. En el manejo de diagnóticos in-vitro que contengan azida sódica se debe observar:
No ingerir y evitar el contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar
azidas explosivas con metales pesados como cobre y plomo.
3. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación del Reactivo de Factor
Xa o de Reactivo AT III ha sido investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-
HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados
negativos.
Además, durante el proceso de fabricación de los materiales de origen humano, los
virus son inactivados por calentamiento de la solución durante 10 horas a +60°C.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana
deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de
seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede
excluir completamente la existencia de agentes patógenos 3 .
Preparación de los reactivos
Reactivo de dextransulfato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la
etiqueta.
Reactivo de Factor Xa: disolver con la cantidad de reactivo de dextransulfato reconstituido
indicada en la etiqueta y calentar a +37 °C antes de usarlo.
Reactivo AT III: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y llevar a
la temperatura ambiente antes de usarlo.
Reactivo sustrato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y
calentar a +37°C antes de usarlo.
Estabilidad y almacenaje
El equipo de prueba, en su envase aún cerrado y conservado entre +2 y +8°C, es utilizable
hasta la fecha indicada en la etiqueta.
Estabilidad después de la reconstitución:
Temperatura Factor Xa AT III Reactivo sustrato
+37°C 4 horas – 1 semana
entre +15 y +25°C 3 días 1 semana 2 semanas
entre +2 y +8 °C 2 semanas 2 semanas 6 semanas
a –20 °C 2 meses 2 meses 6 meses
Las soluciones pueden ser congeladas hasta 3 veces en el frasco original.
Materiales adicionales necesarios
Plasma humano estándar, N° de pedido ORKL
Acido acético al 20% (solamente para el método de dos puntos)
Material a investigar
Para obtener el plasma, mezclar cuidadosamente, evitando la formacion de espuma,
1 parte de solucion de citrato de sodio 0,11 mol/l con 9 partes de sangre venosa. Centrifugar
inmediamente por lo menos durante 10 min. a por lo menos 1500 x g.
Estabilidad de la muestra:
a –20 °C
1 mes
entre +15 y +25°C 8 horas
Los plasmas mantenidos a –20 °C deben ser descongelados en el plazo de 10 min a +37°C
y la determinación debe ser realizada dentro de las 8 horas subsiguientes.
Método
realización de la prueba
Cubeta:
trayectoria óptica de 1 cm
Longitud de onda: 405 nm
Temperatura de la prueba: +37 °C
Precalentar el Reactivo de factor Xa, el Reactivo sustrato, así como las cubetas y los tubos
plásticos a +37°C y llevar el Reactivo AT III a la temperatura ambiente (entre +15 y +25°C).
Método cinético
Muestra 150 µl
Reactivo AT III 150 µl
Reactivo de factor Xa 500 µl
mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C.
Reactivo sustrato 100 µl
mezclar y determinar la ∆ E 405 nm
/min
Determinación en el Chromotimer: Para los mismos tiempos de incubación hay que reducir
a la mitad el volumen de las soluciones empleadas.
Método manual de dos puntos (semimicro determinación)
Muestra Valor de la
muestra testigo
Acido acético al 20% – 500 µl
Muestra 150 µl 150 µl
Reactivo AT III 150 µl 150 µl
Reactivo de factor Xa 500 µl 500 µl
mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C.
Reactivo sustrato 100 µl 100 µl
mezclar de inmediato y luego de exactamente 1 min agregar:
Acido acético al 20% 500 µl
mezclar de inmediato y, dentro del plazo de 2 horas, determinar la extinción contra el
valor de las muestras testigo.
Valoración
La valoración se efectúa utilizando una curva de referencia trazada previamente con el
preparado de heparina empleado y con el mismo método analítico. El preparado heparínico
a utilizar se diluye con solución isotónica de cloruro de sodio (0,9%) hasta alcanzar
10 UI/ml. Diluir 100 µl de esta dilución con 900 µl de una mezcla de plasma libre de heparina
o de plasma estándar (por ej. Plasma humano estándar) a fin de lograr una concentración
de 1 UI/ml. Las diluciones para la curva de referencia (zona de 0 a 1 UI de heparina/ml) se
obtienen de acuerdo a la siguiente tabla:
Concentración Plasma normal o Plasma heparínico
de heparina plasma estándar 1 UI/ml
UI/ml µl µl
1,05 1000 1000
0,75 1250 1750
0,55 1500 1500
0,25 1750 1250
0,15 1900 1100
0 15 1000 1000
Notas
1. La duplicación o la división por dos del volumen utilizado en la determinación no ejercen
ninguna influencia sobre la valoración.
2. El plasma se utiliza sin diluir. Cuando los valores se encuentran por encima de la zona
calibrada de medida, hay que diluirlo con la solución de AT III o con un plasma normal
libre de heparina (por ej. Plasma humano estándar). Los resultados obtenidos deben
ser calculados en la forma correspondiente.
3. Cuando la concentración de heparina es muy baja, se puede aumentar la sensibilidad
de la prueba prolongando el tiempo de incubación a 3 minutos. En este caso hay que
efectuar la valoración con una curva de referencia trazada también con una incubación
de 3 minutos y diluciones adicionales del estándar.
4. Las instrucciones especiales para los aparatos automáticos se obtienen a solicitud del
interesado.
Control de calidad
Para cada serie de medidas se deben efectuar simultáneamente por lo menos dos controles
con diferentes concentraciones de heparina. Si no se obtienen los valores esperados, los
resultados de las muestras de los pacientes no pueden ser valorados.
Como controles se pueden utilizar:
Un plasma normal libre de heparina (por ej. Plasma N de control). Con él se pueden verificar
la estabilidad del reactivo y el punto cero de la curva de referencia.
Un plasma normal (por ej. Plasma N de control) llevado a una determinada concentración
(por ej. 0,5 UI/ml) mediante el preparado de heparina a analizar. Con él se pueden verificar
la sensibilidad y la recuperación.
Limitaciones y fuentes de error
Respetar exactamente los tiempos de incubacion a fin de conseguir resultados reproducibles.
Características de rendimiento de la prueba
Sensibilidad
El límite de detección para una heparina sin fraccionar es de 0,05 UI/ml.
Especificidad
La determinación de heparina con Berichrom Heparina no es perturbada por el factor
plaquetario 4 (FP4).
Precisión y reproducibilidad
Para las concentraciones de heparina de 0,5 UI/ml el coeficiente de variacion en la serie
se halla entre 4,0 y 7,0% y de un dÅa al otro, entre 6,9 y 7,1%.
Comparación de métodos
En una comparación de Berichrom Heparina con otro método cromógeno se encontraron
coeficientes de correlación de 0,94 y 0,97.
Bibliografía
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
Fabricante: Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg/Germany
OWLD G11 E0532 (1211) H 5
Edición Agosto 2000