BerichromÂ® Heparin - Medcorp

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Berichrom ® Eparina Settori d’impiego e funzione Determinazione dell’attività dell’eparina nel plasma per il controllo della terapia eparinica. Significato diagnostico L’eparina accelera notevolmente l’inattivazione del fattore di coagulazione Xa e della trombina tramite l’antitrombina III. I preparati eparinici non frazionati e quelli a basso peso molecolare hanno pertanto un diffuso impiego terapeutico come anticoagulanti. In considerazione dei molteplici effetti l’azione dell’eparina può essere diversa da paziente a paziente a parità di dosaggio. Con il Berichrom ® Eparina e possibile seguire terapie che impiegano sia eparine a basso peso molecolare (LMW) sia preparati eparinici non frazionati. Principio del metodo Il fattore Xa viene inattivato dall’AT III durante la fase di incubazione del test. Questa reazione viene catalizzata dall’eparina. Il solfato di destrano (DS) rilascia di nuovo l’eparina legata a fattori interferenti e in questo modo rende possibile la determinazione. Il F Xa residuo dopo la fase dell’incubazione viene determinato mediante un test cinetico in base all’aumento dell’estinzione a 405 nm utilizzando un substrato cromogenico. Eparina legata + DS > DS legato + Eparina libera eparina F Xa + AT III campione eccesso > [F Xa-AT III] + F Xaresiduo F XA Substrato cromogenico residuo > Tripeptide + colorante Reagenti Contenuto della confezione Kit da 3 x 20 determinazioni semimicro, codice WLD 3 flaconi da 10 mL di reagente F Xa 3 flaconi da 10 mL di reagente solfato di destrano 3 flaconi da 11 mL di reagente AT III 3 flaconi da 12 mL di reagente substrato Composizione Reagente F Xa, liofilizzato; frazione di plasma (umano) con l’aggiunta di Tampone Tris (6 g/L), cloruro di sodio (12 g/L) e EDTA (0,74 g/L). Conservanti: sodio azide (< 1 g/L) Reagente solfato di destrano, liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso: 0,02 g/L. Reagente AT III (umana), liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso: 1 UI/mL. Agents de conservation: sodio azide (< 1 g/L) Reagente substrato, liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso: Z-D-Leu-Gli-Arg- ANBA-metilamide 4 mmol/L. Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in-vitro 2. Quando si impiegano diagnostici in vitro contenenti sodio azide osservare le seguenti precauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose. La sodio azide a contatto con metalli pesanti, come rame e/o piombo, può formare azidi esplosive. 3. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione del reagente F Xa o del reagente AT III è stata esaminata per la ricerca dell’antigene di superficie del virus dell’epatite B e degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2 secondo i test richiesti dall'FDA. Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati per la produzione. Solo i prelievi che risultano negativi vengono impiegati per la produzione. Inoltre i derivati di origine umana durante la fase di produzione vengono riscaldati in soluzione per 10 ore a +60°C per l’inattivazione del virus. Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni 3 . Preparazione dei reagenti Reagente solfato di destrano: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sulla etichetta. Reagente Fattore Xa: sciogliere con il reagente di solfato di destrano ricostituito secondo la quantità indicata sulla etichetta e portare a 37°C prima dell’uso. Reagente AT III: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sull’etichetta e portare a temperatura ambiente prima dell’uso. Reagente substrato: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sull`etichetta e portare a 37°C prima dell’uso. Conservazione e validità Il kit può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta, se conservato sigillato a +2°/+8°C. Validità dopo ricostituzione: Temperatura Fattore Xa AT III Reagente-Substrato +37 °C 4 ore – 1 settimana +15/+25 °C 3 giorni 1 settimana 2 settimane +2/+8 °C 2 settimane 2 settimane 6 settimane –20°C 2 mesi 2 mesi 6 mesi Le soluzioni possono essere congelate nella confezione originale per un massimo di 3 volte. Materiale necessario supplementare Plasma umano standard, codice RKL Acido acetico al 20% (soltanto per il metodo a due punti) Campioni in esame Mescolare accuratamente, evitando la formazione di schiuma, 1 parte della soluzione di citrato di sodio (0,11 mol/L) con 9 parti di sangue venoso. Centrifugare subito per almeno 10 min. ad almeno 1500 x g. Stabilità del campione: 1 mese a –20°C 8 ore a +15°/+25°C Scongelare entro 10 min a 37°C i plasmi conservati a –20°C ed effettuare la determinazione entro 8 ore. Metodica Esecuzione del test Cuvetta: 1 cm di percorso ottico Lunghezza d’onda: 405 nm Temperatura del test: +37°C Portare a temperatura di +37°C il reagente F Xa, il reagente substrato e le cuvette e/o provette di plastica e portare a temperatura ambiente (+15 °/+25°C) il Reagente AT III. Metodo cinetico Campione 150 µL Reagente AT III 150 µL Reagente Fattore Xa 500 µL Mescolare ed incubare a +37°C esattamente per 1 min Reagente substrato 100 µL Mescolare e determinare il ∆ E 405 nm /min. Esecuzione del test con il Chromotimer: mantenendo gli stessi tempi di incubazione dimezzare il volume delle soluzioni impiegate. Metodo manuale a due punti (determinazione semimicro) campione bianco campione Acido acetico al 20% – 500 µL Campione 150 µL 150 µL Reagente AT III 150 µL 150 µL Reagente fattore Xa 500 µL 500 µL Mescolare ed incubare a +37°C esattamente per 1 min. Reagente substrato 100 µL 100 µL Mescolare immediatamente e dopo 1 min esatto aggiungere: Acido acetico al 20% 500 µL Mescolare immediatamente e determinare entro 2 ore l’estinzione contro il bianco campione. Valutazione I risultati vengono valutati sulla base di una curva di calibrazione allestita mediante il preparato eparinico utilizzato per la terapia rispettando gli stessi tempi di incubazione. Diluire tale preparato a 10 UI/mL con soluzione isotonica salina (0,9%). Diluire quindi 100 µL della diluizione risultante con 900 µL di una miscela di plasmi o con plasma standard esenti da eparina (ad es. Plasma umano standard) per ottenere una concentrazione di 1 UI/mL. Le diluizioni richieste per preparare la curva di calibrazione (ambito da 0 a 1 UI di eparina/ mL) si possono desumere dalla seguente tabella: Concentrazione Plasma standard o Plasma eparinizzato di eparina normale 1 UI/mL UI/mL µL µL 1,05 1000 1000 0,75 1250 1750 0,55 1500 1500 0,25 1750 1250 0,15 1900 1100 0,25 1000 1000 Note 1. Il raddoppio o il dimezzamento dei volumi nel test non influenza la valutazione o il fattore interno del laboratorio. 2. Il plasma viene utilizzato indiluito. Se i valori sono al di sopra dell’ambito di misura corrispondente alla calibrazione, il plasma deve essere prediluito con la soluzione AT III o con un plasma normale senza eparina (ad es plasma umano standard). I risultati ottenuti devono essere convertiti corrispondentemente. 3. Se la concentrazione di eparina è molto bassa, la sensibilita del sistema per il test può essere aumentata prolungando il tempo di incubazione a 3 minuti. Si deve quindi fare una valutazione sulla base della curva di riferimento, calcolata con un tempo di incubazione di 3 minuti. 4. Su richiesta si possono ricevere speciali protocolli per l’esecuzione in automazione. Controllo di qualità interno Per ciascuna serie di valutazioni devono essere condotti almeno due controlli con differenti concentrazioni di eparina. Se non vengono riscontrati i valori attesi, i risultati dei campioni dei pazienti non possono essere utilizzati. Come controlli possono essere utilizzati: un plasma normale non contenente eparina (ad es. plasma di controllo N). Mediante tale controllo è possibile esaminare sia la stabilità del reagente sia il punto zero della curva; un plasma normale (ad es. plasma di controllo N) portato ad una concentrazione adeguata (ad es. 0,5 UI/mL) con l’eparina da dosare. Mediante tale controllo è possibile valutare sia la sensibilità che la riproducibilità. Limitazioni e fonti di errore Per ottenere risultati riproducibili è necessario attenersi esattamente ai tempi di incubazione. Caratteristiche del test Sensibilità Il limite di identificazione per l’eparina non frazionata è 0,05 UI/mL. Specificità La determinazione dell’eparina con il Berichrom Eparina non viene influenzata dal fattore piastrinico 4 (PF4). Precisione e riproducibilità Con una concentrazione eparinica di 0,5 UI/mL, il coefficiente di variazione nella serie è tra 4,0 e 7,0% e quello inter-assay tra 6,9 e 7,1%. Confronto tra metodi Dal confronto fra Berichrom Eparina e altri metodi cromogenici sono stati trovati coefficienti di correlazione di 0,94 e 0,97. Bibliografia 1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin. Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596 2. Teien, A. N. e Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10, (1977) 399–410 3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U.S. Department of Health and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395) Confezioni originali: Rappresentante per l'Italia: Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg Dade Behring SPA Via Lampedusa 11/A 20141 Milano/Italy OWLD G11 E0532 (1211) H 4 Edizione Agosto 2000
Berichrom ® Heparina Campo de aplicación y finalidad de su empleo Berichrom Heparina es una prueba cromógena para la determinación de la actividad heparínica en el plasma y para el control de la terapéutica heparínica. Importancia diagnóstica La heparina acelera considerablemente la inactivacion del factor de coagulación Xa y de la trombina mediante la antitrombina III. Por ello, el uso de los preparados de heparina sin fraccionar y de bajo peso molecular encuentran un dilatado campo de aplicación como anticoagulantes. Aun con la misma dosificación, el efecto de la heparina varía de un paciente a otro, pues está sometido a la influencia de múltiples factores. Con Berichrom Heparina se puede controlar tanto la terapéutica con preparados heparínicos de bajo peso molecular (LMW) como con preparados de heparina sin fraccionar. Principio del método El factor Xa es inactivado por el reactivo AT III durante la fase de incubación. Esta reacción es catalizada mediante heparina. El dextransulfato (DS) libera la heparina fijada en los factores de perturbación y hace posible su determinación. El factor Xa restante después de la fase de incubación se determina en una prueba cinética mediante el aumento de la extinción a 405 nm utilizando un sustrato cromógeno. heparina fijada + DS > DS fijado + heparina libre heparina F Xa + AT III muestra excedente > [F Xa-AT III] + F XAresto F XA sustrato cromógeno resto > tripéptido + colorante Reactivos Contenido del envase Equipo de prueba para 3 x 20 semimicrodeterminaciones, N° de pedido OWLD 3 x para 10 ml de Reactivo Factor Xa 3 x para 10 ml de Reactivo de dextransulfato 3 x para 11 ml de Reactivo AT III 3 x para 12 ml de Reactivo sustrato Composición Reactivo de Factor Xa, liofilizado; fracción de plasma (humano) con adición de Tris (6 g/l), cloruro de sodio (12 g/l) y EDTA (0,74 g/l) Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l) Reactivo de dextransulfato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 0,02 g/l Reactivo AT III (humano), liofilizado; concentración en la solución de uso: 1 UI/ml Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l) Reactivo sustrato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 4 mmol/l de Z-D-Leu- Gly-Arg-ANBA-metilamida Advertencias y medidas de precaución 1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro 2. En el manejo de diagnóticos in-vitro que contengan azida sódica se debe observar: No ingerir y evitar el contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar azidas explosivas con metales pesados como cobre y plomo. 3. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación del Reactivo de Factor Xa o de Reactivo AT III ha sido investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti- HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos. Además, durante el proceso de fabricación de los materiales de origen humano, los virus son inactivados por calentamiento de la solución durante 10 horas a +60°C. Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes patógenos 3 . Preparación de los reactivos Reactivo de dextransulfato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta. Reactivo de Factor Xa: disolver con la cantidad de reactivo de dextransulfato reconstituido indicada en la etiqueta y calentar a +37 °C antes de usarlo. Reactivo AT III: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y llevar a la temperatura ambiente antes de usarlo. Reactivo sustrato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y calentar a +37°C antes de usarlo. Estabilidad y almacenaje El equipo de prueba, en su envase aún cerrado y conservado entre +2 y +8°C, es utilizable hasta la fecha indicada en la etiqueta. Estabilidad después de la reconstitución: Temperatura Factor Xa AT III Reactivo sustrato +37°C 4 horas – 1 semana entre +15 y +25°C 3 días 1 semana 2 semanas entre +2 y +8 °C 2 semanas 2 semanas 6 semanas a –20 °C 2 meses 2 meses 6 meses Las soluciones pueden ser congeladas hasta 3 veces en el frasco original. Materiales adicionales necesarios Plasma humano estándar, N° de pedido ORKL Acido acético al 20% (solamente para el método de dos puntos) Material a investigar Para obtener el plasma, mezclar cuidadosamente, evitando la formacion de espuma, 1 parte de solucion de citrato de sodio 0,11 mol/l con 9 partes de sangre venosa. Centrifugar inmediamente por lo menos durante 10 min. a por lo menos 1500 x g. Estabilidad de la muestra: a –20 °C 1 mes entre +15 y +25°C 8 horas Los plasmas mantenidos a –20 °C deben ser descongelados en el plazo de 10 min a +37°C y la determinación debe ser realizada dentro de las 8 horas subsiguientes. Método realización de la prueba Cubeta: trayectoria óptica de 1 cm Longitud de onda: 405 nm Temperatura de la prueba: +37 °C Precalentar el Reactivo de factor Xa, el Reactivo sustrato, así como las cubetas y los tubos plásticos a +37°C y llevar el Reactivo AT III a la temperatura ambiente (entre +15 y +25°C). Método cinético Muestra 150 µl Reactivo AT III 150 µl Reactivo de factor Xa 500 µl mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C. Reactivo sustrato 100 µl mezclar y determinar la ∆ E 405 nm /min Determinación en el Chromotimer: Para los mismos tiempos de incubación hay que reducir a la mitad el volumen de las soluciones empleadas. Método manual de dos puntos (semimicro determinación) Muestra Valor de la muestra testigo Acido acético al 20% – 500 µl Muestra 150 µl 150 µl Reactivo AT III 150 µl 150 µl Reactivo de factor Xa 500 µl 500 µl mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C. Reactivo sustrato 100 µl 100 µl mezclar de inmediato y luego de exactamente 1 min agregar: Acido acético al 20% 500 µl mezclar de inmediato y, dentro del plazo de 2 horas, determinar la extinción contra el valor de las muestras testigo. Valoración La valoración se efectúa utilizando una curva de referencia trazada previamente con el preparado de heparina empleado y con el mismo método analítico. El preparado heparínico a utilizar se diluye con solución isotónica de cloruro de sodio (0,9%) hasta alcanzar 10 UI/ml. Diluir 100 µl de esta dilución con 900 µl de una mezcla de plasma libre de heparina o de plasma estándar (por ej. Plasma humano estándar) a fin de lograr una concentración de 1 UI/ml. Las diluciones para la curva de referencia (zona de 0 a 1 UI de heparina/ml) se obtienen de acuerdo a la siguiente tabla: Concentración Plasma normal o Plasma heparínico de heparina plasma estándar 1 UI/ml UI/ml µl µl 1,05 1000 1000 0,75 1250 1750 0,55 1500 1500 0,25 1750 1250 0,15 1900 1100 0 15 1000 1000 Notas 1. La duplicación o la división por dos del volumen utilizado en la determinación no ejercen ninguna influencia sobre la valoración. 2. El plasma se utiliza sin diluir. Cuando los valores se encuentran por encima de la zona calibrada de medida, hay que diluirlo con la solución de AT III o con un plasma normal libre de heparina (por ej. Plasma humano estándar). Los resultados obtenidos deben ser calculados en la forma correspondiente. 3. Cuando la concentración de heparina es muy baja, se puede aumentar la sensibilidad de la prueba prolongando el tiempo de incubación a 3 minutos. En este caso hay que efectuar la valoración con una curva de referencia trazada también con una incubación de 3 minutos y diluciones adicionales del estándar. 4. Las instrucciones especiales para los aparatos automáticos se obtienen a solicitud del interesado. Control de calidad Para cada serie de medidas se deben efectuar simultáneamente por lo menos dos controles con diferentes concentraciones de heparina. Si no se obtienen los valores esperados, los resultados de las muestras de los pacientes no pueden ser valorados. Como controles se pueden utilizar: Un plasma normal libre de heparina (por ej. Plasma N de control). Con él se pueden verificar la estabilidad del reactivo y el punto cero de la curva de referencia. Un plasma normal (por ej. Plasma N de control) llevado a una determinada concentración (por ej. 0,5 UI/ml) mediante el preparado de heparina a analizar. Con él se pueden verificar la sensibilidad y la recuperación. Limitaciones y fuentes de error Respetar exactamente los tiempos de incubacion a fin de conseguir resultados reproducibles. Características de rendimiento de la prueba Sensibilidad El límite de detección para una heparina sin fraccionar es de 0,05 UI/ml. Especificidad La determinación de heparina con Berichrom Heparina no es perturbada por el factor plaquetario 4 (FP4). Precisión y reproducibilidad Para las concentraciones de heparina de 0,5 UI/ml el coeficiente de variacion en la serie se halla entre 4,0 y 7,0% y de un dÅa al otro, entre 6,9 y 7,1%. Comparación de métodos En una comparación de Berichrom Heparina con otro método cromógeno se encontraron coeficientes de correlación de 0,94 y 0,97. Bibliografía 1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin. Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596 2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410 3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395) Fabricante: Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg/Germany OWLD G11 E0532 (1211) H 5 Edición Agosto 2000
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