Berichrom® Heparin - Medcorp
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Berichrom ® Héparine<br />
Domaine d’utilisation et indication<br />
Berichrom Héparine est un test chromogénique pour la détermination de l’activité d’héparine<br />
dans le plasma et pour la surveillance des héparinothérapies.<br />
Intérêt diagnostique<br />
L’héparine accélère considérablement l’inactivation du facteur Xa de la coagulation et de la<br />
thrombine par l’antithrombine III. Ainsi les préparations d’héparine non-fractionnées et de<br />
bas poids moléculaires trouvent-elles une large application thérapeutique comme anticoagulants.<br />
Malgré une posologie identique, de nombreux facteurs influencent l’effet de<br />
l’héparine variable d’un patient à l’autre. Le test Berichrom Héparine permet le suivi des<br />
traitements utilisant aussi bien des héparines de bas poids moléculaires (HBPM) que des<br />
héparines non-fractionnées (HNF).<br />
Principe de la méthode<br />
Pendant la phase d’incubation, le facteur Xa est inactivé par l’AT III. Cette réaction est<br />
catalysée par l’héparine. Du sulfate de dextran (SD) libère de nouveau l’héparine liée à<br />
des facteurs interférants, et la rend ainsi mesurable. Le F Xa qui subsiste après la phase<br />
d’incubation est mesuré dans un test cinétique par l’augmentation de la densité optique à<br />
405 nm à l’aide d’un substrat chromogène.<br />
Héparine liee<br />
+ SD<br />
> SD lié<br />
+ héparine libre<br />
héparine<br />
F Xa + AT III échantillon<br />
en excés<br />
> [F Xa-AT III] + F XArésiduel<br />
F XA<br />
substrat chromogène<br />
résiduel > tripeptide + colorant<br />
Réactifs<br />
Contenu du coffret<br />
Coffret pour 3 x 20 semi-micro-tests, code OWLD<br />
3 x pour 10 ml de Réactif F Xa<br />
3 x pour 10 ml de Réactif sulfate de dextran<br />
3 x pour 11 ml de Réactif AT III<br />
3 x pour 12 ml de Réactif substrat<br />
Composition<br />
Réactif F Xa, lyophilisé; fraction plasmatique (humaine) additionnée de Tris (6 g/l), de<br />
chlorure de sodium (12 g/l) et d’EDTA (0,74 g/l).<br />
Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)<br />
Réactif sulfate de dextran, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 0,02 g/l.<br />
Réactif AT III (humain), lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 1 UI/ml<br />
Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)<br />
Réactif substrat, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 4 mmol/l de Z-D-Leu-<br />
Gly-Arg-ANBA-méthylamide.<br />
Mises en garde et précautions d’emploi<br />
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro<br />
2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution :<br />
ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium<br />
peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.<br />
3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du Réactif Facteur Xa ou du<br />
Réactif AT III a été testé vis-à-vis de l’antigène de surface de l'Hépatite B, de l’anticorps<br />
anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorps anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés<br />
négatifs ont été utilisés.<br />
Par ailleurs, au cours du processus de fabrication, les produits d’origine humaine en<br />
solution sont chauffés 10 heures à +60°C pour inactiver les virus.<br />
Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent être<br />
manipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure<br />
où l’on ne peut exclure totalement un risque d’infection 3 .<br />
Préparation des réactifs<br />
Réactif sulfate de dextran: reconstituer le lyophilisat avec la quantité d’eau distillée indiquée<br />
sur l’étiquette.<br />
Réactif Facteur Xa: reconstituer le lyophilisat avec la quantité de sulfate de dextran<br />
reconstitué indiquée sur l’étiquette, et porter le réactif à +37 °C avant son emploi.<br />
Réactif AT III: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, puis le<br />
porter à la température ambiante avant son emploi.<br />
Réactif substrat: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, et le<br />
porter à +37°C avant son emploi.<br />
Stabilités et conditions de conservation<br />
Dans leur conditionnement d’origine non ouvert, les réactifs se conservent à +2/+8°C jusqu’à<br />
la date de péremption indiquée sur l’étiquette.<br />
Stabilités après reconstitution:<br />
Température Facteur Xa AT III reactif-substrat<br />
+37°C 4 heures – 1 semaine<br />
+15/+25°C 3 jours 1 semaine 2 semaines<br />
+2/+8°C 2 semaines 2 semaines 6 semaines<br />
–20°C 2 mois 2 mois 6 mois<br />
Les solutions peuvent être congelées jusqu’à 3 fois dans leur flacon d’origine.<br />
Autres réactifs nécessaires<br />
Plasma standard humain, code ORKL<br />
Acide acétique à 20% (uniquement pour la méthode en deux points)<br />
Echantillons de patients<br />
Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 mol/l)<br />
avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de<br />
mousse. Centrifuger aussitôt pendant au moins 10 min à au moins 1500 g.<br />
Stabilité de l’échantillon:<br />
à –20 °C: 1 mois<br />
à +15/+25 °C 8 heures<br />
Les plasmas congelés a –20°C doivent être décongelés en 10 min à 37°C, et testés dans<br />
les 8 heures qui suivent.<br />
Méthode<br />
Réalisation du test<br />
Cuve:<br />
1 cm de trajet optique<br />
Longueur d’onde: 405 nm<br />
Température du test: +37°C<br />
Préchauffer le réactif Facteur Xa, le réactif substrat ainsi que les cuves ou tubes plastique<br />
à +37°C, et le réactif AT III à la température ambiante (+15/+25°C).<br />
Méthode cinétique<br />
Echantillon 150 µl<br />
Réactif AT III 150 µl<br />
Réactif Facteur Xa 500 µl<br />
Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C<br />
Réactif substrat 100 µl<br />
Mélanger et mesurer la ∆ D.O. 405 nm<br />
/min.<br />
Protocole sur le Chromotimer: pour les mêmes temps d’incubation, diviser les volumes<br />
indiqués par deux.<br />
Méthode manuelle en deux points (semi-micro-test)<br />
échantillon blanc-échantillon<br />
Acide acétique à 20% – 500 µl<br />
Echantillon 150 µl 150 µl<br />
Réactif AT III 150 µl 150 µl<br />
Réactif Facteur Xa 500 µl 500 µl<br />
Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C.<br />
Réactif substrat 100 µl 100 µl<br />
Mélanger aussitôt, et après exactement 1 min, ajouter:<br />
Acide acétique à 20% 500 µl<br />
Mélanger aussitôt et mesurer la densité optique dans les 2 heures contre le<br />
blanc-échantillon.<br />
Exploitation des résultats<br />
L’exploitation des résultats se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie préalablement<br />
selon la même méthode avec la préparation d’héparine utilisée. Diluer la préparation<br />
d’héparine utilisée pour la thérapie en solution saline isotonique (0,9%) et la porter à 10<br />
UI/ml. Rediluer 100 µl de cette dilution avec 900 µl d’un pool de plasmas exempt d’héparine<br />
ou d’un plasma standard (par ex. le Plasma standard humain), de façon à obtenir une<br />
concentration de 1 UI/ml. Pour les dilutions à établir pour la courbe d’étalonnage (domaine<br />
allant de 0 à 1 UI d’héparine/ml), se reporter au tableau ci-dessous:<br />
concentration plasma normal plasma hépariné<br />
d’héparine ou standard à 1 UI/ml<br />
UI/ml µl µl<br />
1,05 1000 1000<br />
0,75 1250 1750<br />
0,55 1500 1500<br />
0,25 1750 1250<br />
0,15 1900 1100<br />
0,25 1000 1000<br />
Remarques<br />
1. La multiplication ou la division par deux des prises d’essai n’a pas d’influence sur<br />
l’exploitation des résultats.<br />
2. Utiliser le plasma non dilué. Si les valeurs trouvées sont supérieures au domaine de<br />
mesure étalonné, diluer les échantillons avec la solution d’AT III ou un plasma normal<br />
exempt d’héparine (par ex. le Plasma standard humain). Diviser ensuite les résultats<br />
selon le facteur de dilution utilisé.<br />
3. Lorsque la concentration d’héparine est très faible, on peut augmenter la sensibilité du<br />
test en allongeant le temps d’incubation à 3 minutes. Il faut alors exploiter les résultats<br />
sur une courbe d’étalonnage établie avec également 3 minutes d’incubation et avec des<br />
dilutions du standard complémentaires.<br />
4. Les protocoles spécifiques pour automates sont envoyés sur demande.<br />
Contrôle de qualité interne<br />
Pour chaque série de mesures, introduire au moins deux contrôles ayant des concentrations<br />
d’héparine différentes. Si les valeurs attendues ne sont pas retrouvées, les résultats des<br />
échantillons de patients ne peuvent pas être exploités.<br />
Comme contrôle on peut utiliser:<br />
Un plasma normal exempt d’héparine (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de<br />
la stabilité du réactif et du point zéro de la courbe d’étalonnage.<br />
Un plasma normal amené à la concentration voulue (par ex. 0,5 UI/ml) à l’aide de l’héparine<br />
à mesurer (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de sensibilité et de restitution.<br />
Limites du test et sources d’erreurs<br />
Les temps d’incubation doivent être scrupuleusement respectés si l’on veut obtenir des<br />
résultats reproductibles.<br />
Caractéristiques du test<br />
Sensibilité<br />
La limite de mise en évidence pour une héparine non-fractionnée est de 0,05 UI/ml.<br />
Spécificité<br />
Le dosage de l’héparine à l’aide du test Berichrom Héparine n’est pas perturbé par le<br />
facteur 4 plaquettaire (PF4).<br />
Précision et reproductibilité<br />
A des concentrations d’héparine de 0,5 UI/ml, le coefficient de corrélation dans la série<br />
varie de 4,0% à 7,0%, et le coefficient de corrélation de jour à jour varie de 6,9% à 7,1%.<br />
Comparaison avec une autre méthode<br />
Une comparaison du Berichrom Héparine avec une autre méthode chromogénique a donné<br />
des coefficients de corrélation entre 0,94 et 0,97.<br />
Littérature<br />
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma <strong>Heparin</strong>.<br />
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596<br />
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic <strong>Heparin</strong> Assay Method: Increased<br />
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410<br />
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health<br />
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)<br />
France:<br />
Fabriqué par Dade Behring Marburg GmbH, Marburg (Allemagne), et commercialisé<br />
en France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du<br />
Capitaine Guynemer, 92903 Paris-La Défense<br />
Ce test est enregistré auprès de l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des<br />
Produits de Santé<br />
OWLD G11 E0532 (1211) H 3<br />
Edition Août 2000