Berichrom® Heparin - Medcorp

Berichrom ® Héparine
Domaine d’utilisation et indication
Berichrom Héparine est un test chromogénique pour la détermination de l’activité d’héparine
dans le plasma et pour la surveillance des héparinothérapies.
Intérêt diagnostique
L’héparine accélère considérablement l’inactivation du facteur Xa de la coagulation et de la
thrombine par l’antithrombine III. Ainsi les préparations d’héparine non-fractionnées et de
bas poids moléculaires trouvent-elles une large application thérapeutique comme anticoagulants.
Malgré une posologie identique, de nombreux facteurs influencent l’effet de
l’héparine variable d’un patient à l’autre. Le test Berichrom Héparine permet le suivi des
traitements utilisant aussi bien des héparines de bas poids moléculaires (HBPM) que des
héparines non-fractionnées (HNF).
Principe de la méthode
Pendant la phase d’incubation, le facteur Xa est inactivé par l’AT III. Cette réaction est
catalysée par l’héparine. Du sulfate de dextran (SD) libère de nouveau l’héparine liée à
des facteurs interférants, et la rend ainsi mesurable. Le F Xa qui subsiste après la phase
d’incubation est mesuré dans un test cinétique par l’augmentation de la densité optique à
405 nm à l’aide d’un substrat chromogène.
Héparine liee
+ SD
> SD lié
+ héparine libre
héparine
F Xa + AT III échantillon
en excés
> [F Xa-AT III] + F XArésiduel
F XA
substrat chromogène
résiduel > tripeptide + colorant
Réactifs
Contenu du coffret
Coffret pour 3 x 20 semi-micro-tests, code OWLD
3 x pour 10 ml de Réactif F Xa
3 x pour 10 ml de Réactif sulfate de dextran
3 x pour 11 ml de Réactif AT III
3 x pour 12 ml de Réactif substrat
Composition
Réactif F Xa, lyophilisé; fraction plasmatique (humaine) additionnée de Tris (6 g/l), de
chlorure de sodium (12 g/l) et d’EDTA (0,74 g/l).
Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)
Réactif sulfate de dextran, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 0,02 g/l.
Réactif AT III (humain), lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 1 UI/ml
Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)
Réactif substrat, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 4 mmol/l de Z-D-Leu-
Gly-Arg-ANBA-méthylamide.
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro
2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution :
ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium
peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.
3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du Réactif Facteur Xa ou du
Réactif AT III a été testé vis-à-vis de l’antigène de surface de l'Hépatite B, de l’anticorps
anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorps anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés
négatifs ont été utilisés.
Par ailleurs, au cours du processus de fabrication, les produits d’origine humaine en
solution sont chauffés 10 heures à +60°C pour inactiver les virus.
Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent être
manipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure
où l’on ne peut exclure totalement un risque d’infection 3 .
Préparation des réactifs
Réactif sulfate de dextran: reconstituer le lyophilisat avec la quantité d’eau distillée indiquée
sur l’étiquette.
Réactif Facteur Xa: reconstituer le lyophilisat avec la quantité de sulfate de dextran
reconstitué indiquée sur l’étiquette, et porter le réactif à +37 °C avant son emploi.
Réactif AT III: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, puis le
porter à la température ambiante avant son emploi.
Réactif substrat: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, et le
porter à +37°C avant son emploi.
Stabilités et conditions de conservation
Dans leur conditionnement d’origine non ouvert, les réactifs se conservent à +2/+8°C jusqu’à
la date de péremption indiquée sur l’étiquette.
Stabilités après reconstitution:
Température Facteur Xa AT III reactif-substrat
+37°C 4 heures – 1 semaine
+15/+25°C 3 jours 1 semaine 2 semaines
+2/+8°C 2 semaines 2 semaines 6 semaines
–20°C 2 mois 2 mois 6 mois
Les solutions peuvent être congelées jusqu’à 3 fois dans leur flacon d’origine.
Autres réactifs nécessaires
Plasma standard humain, code ORKL
Acide acétique à 20% (uniquement pour la méthode en deux points)
Echantillons de patients
Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 mol/l)
avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de
mousse. Centrifuger aussitôt pendant au moins 10 min à au moins 1500 g.
Stabilité de l’échantillon:
à –20 °C: 1 mois
à +15/+25 °C 8 heures
Les plasmas congelés a –20°C doivent être décongelés en 10 min à 37°C, et testés dans
les 8 heures qui suivent.
Méthode
Réalisation du test
Cuve:
1 cm de trajet optique
Longueur d’onde: 405 nm
Température du test: +37°C
Préchauffer le réactif Facteur Xa, le réactif substrat ainsi que les cuves ou tubes plastique
à +37°C, et le réactif AT III à la température ambiante (+15/+25°C).
Méthode cinétique
Echantillon 150 µl
Réactif AT III 150 µl
Réactif Facteur Xa 500 µl
Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C
Réactif substrat 100 µl
Mélanger et mesurer la ∆ D.O. 405 nm
/min.
Protocole sur le Chromotimer: pour les mêmes temps d’incubation, diviser les volumes
indiqués par deux.
Méthode manuelle en deux points (semi-micro-test)
échantillon blanc-échantillon
Acide acétique à 20% – 500 µl
Echantillon 150 µl 150 µl
Réactif AT III 150 µl 150 µl
Réactif Facteur Xa 500 µl 500 µl
Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C.
Réactif substrat 100 µl 100 µl
Mélanger aussitôt, et après exactement 1 min, ajouter:
Acide acétique à 20% 500 µl
Mélanger aussitôt et mesurer la densité optique dans les 2 heures contre le
blanc-échantillon.
Exploitation des résultats
L’exploitation des résultats se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie préalablement
selon la même méthode avec la préparation d’héparine utilisée. Diluer la préparation
d’héparine utilisée pour la thérapie en solution saline isotonique (0,9%) et la porter à 10
UI/ml. Rediluer 100 µl de cette dilution avec 900 µl d’un pool de plasmas exempt d’héparine
ou d’un plasma standard (par ex. le Plasma standard humain), de façon à obtenir une
concentration de 1 UI/ml. Pour les dilutions à établir pour la courbe d’étalonnage (domaine
allant de 0 à 1 UI d’héparine/ml), se reporter au tableau ci-dessous:
concentration plasma normal plasma hépariné
d’héparine ou standard à 1 UI/ml
UI/ml µl µl
1,05 1000 1000
0,75 1250 1750
0,55 1500 1500
0,25 1750 1250
0,15 1900 1100
0,25 1000 1000
Remarques
1. La multiplication ou la division par deux des prises d’essai n’a pas d’influence sur
l’exploitation des résultats.
2. Utiliser le plasma non dilué. Si les valeurs trouvées sont supérieures au domaine de
mesure étalonné, diluer les échantillons avec la solution d’AT III ou un plasma normal
exempt d’héparine (par ex. le Plasma standard humain). Diviser ensuite les résultats
selon le facteur de dilution utilisé.
3. Lorsque la concentration d’héparine est très faible, on peut augmenter la sensibilité du
test en allongeant le temps d’incubation à 3 minutes. Il faut alors exploiter les résultats
sur une courbe d’étalonnage établie avec également 3 minutes d’incubation et avec des
dilutions du standard complémentaires.
4. Les protocoles spécifiques pour automates sont envoyés sur demande.
Contrôle de qualité interne
Pour chaque série de mesures, introduire au moins deux contrôles ayant des concentrations
d’héparine différentes. Si les valeurs attendues ne sont pas retrouvées, les résultats des
échantillons de patients ne peuvent pas être exploités.
Comme contrôle on peut utiliser:
Un plasma normal exempt d’héparine (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de
la stabilité du réactif et du point zéro de la courbe d’étalonnage.
Un plasma normal amené à la concentration voulue (par ex. 0,5 UI/ml) à l’aide de l’héparine
à mesurer (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de sensibilité et de restitution.
Limites du test et sources d’erreurs
Les temps d’incubation doivent être scrupuleusement respectés si l’on veut obtenir des
résultats reproductibles.
Caractéristiques du test
Sensibilité
La limite de mise en évidence pour une héparine non-fractionnée est de 0,05 UI/ml.
Spécificité
Le dosage de l’héparine à l’aide du test Berichrom Héparine n’est pas perturbé par le
facteur 4 plaquettaire (PF4).
Précision et reproductibilité
A des concentrations d’héparine de 0,5 UI/ml, le coefficient de corrélation dans la série
varie de 4,0% à 7,0%, et le coefficient de corrélation de jour à jour varie de 6,9% à 7,1%.
Comparaison avec une autre méthode
Une comparaison du Berichrom Héparine avec une autre méthode chromogénique a donné
des coefficients de corrélation entre 0,94 et 0,97.
Littérature
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
France:
Fabriqué par Dade Behring Marburg GmbH, Marburg (Allemagne), et commercialisé
en France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du
Capitaine Guynemer, 92903 Paris-La Défense
Ce test est enregistré auprès de l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Produits de Santé
OWLD G11 E0532 (1211) H 3
Edition Août 2000