BerichromÂ® Heparin - Medcorp

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Berichrom ® Heparin Anwendungsbereich und -zweck Berichrom Heparin ist ein chromogener Test zur Bestimmung der Aktivität von Heparin in Plasma und zur Überwachung der Heparintherapie. Diagnostische Bedeutung Heparin beschleunigt die Inaktivierung von Gerinnungsfaktor Xa und Thrombin durch Antithrombin III erheblich. Daher finden unfraktionierte und niedermolekulare Heparin-Präparate verbreitete therapeutische Anwendung als Antikoagulans. Infolge vielfacher Einflüsse schwankt die Heparinwirkung von Patient zu Patient trotz gleicher Dosierung. Mit Berichrom Heparin kann die Therapie sowohl mit niedermolekularen (LMW) als auch mit unfraktionierten Heparin-Präparaten verfolgt werden. Prinzip der Methode Faktor Xa wird in der Inkubationsphase durch AT III inaktiviert. Diese Reaktion wird durch Heparin katalysiert. Dextransulfat (DS) setzt an Störfaktoren gebundenes Heparin wieder frei und macht es der Bestimmung zugänglich. Der nach der Inkubationsphase verbliebene Faktor Xa wird in einem kinetischen Test über die Extinktionszunahme bei 405 nm mittels eines chromogenen Substrats bestimmt. Heparin gebunden + DS > DS gebunden + Heparin frei Heparin F Xa + AT III Probe Überschuß > [F Xa-AT III] + F XARest F XA Chromogenes Substrat Rest > Tripeptid + Farbstoff Reagenzien Inhalt der Handelspackung Testkit für 3 x 20 Halbmikro-Ansätze, Bestell Nr. OWLD 3 x für 10 ml Faktor Xa-Reagenz 3 x für 10 ml Dextransulfat-Reagenz 3 x für 11 ml ATIII-Reagenz 3 x für 12 ml Substrat-Reagenz Zusammensetzung Faktor Xa-Reagenz: lyophilisiert; Plasma-Fraktion (human) mit Zusatz von Tris (6 g/l), Natriumchlorid (12 g/l) und EDTA (0,74 g/l) Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l) Dextransulfat-Reagenz, lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: 0,02 g/l. AT III-Reagenz (human), lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: 1 IU/ml. Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l) Substrat-Reagenz, lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: Z-D-Leu-Gly-Arg- ANBA-methyl-amid 4 mmol/l. Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung 2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostica ist zu beachten: Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden. 3. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Faktor Xa-Reagenz oder AT III- Reagenz vorgesehen war, wurde auf Hepatitis Bs-Antigen, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Außerdem werden die Ausgangsmaterialien humanen Ursprungs beim Herstellungsprozess zur Virusinaktivierung in Lösung 10 Stunden bei +60°C erhitzt. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden 3 . Vorbereitung der Reagenzien Dextransulfat-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen. Faktor Xa-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge des rekonstituierten Dextransulfat-Reagenzes einlösen und vor Gebrauch auf 37°C temperieren. AT III-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und vor Gebrauch auf Raumtemperatur temperieren. Substrat-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und vor Gebrauch auf 37°C temperieren. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Der Testkit ist, ungeöffnet bei +2 bis +8°C gelagert, bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum verwendbar. Haltbarkeit nach Rekonstitution: Temperatur Faktor Xa AT III Substrat-Reagenz +37 °C 4 Stunden – 1 Woche +15°C bis +25°C 3 Tage 1 Woche 2 Wochen +2 bis +8°C 2 Wochen 2 Wochen 6 Wochen –20°C 2 Monate 2 Monate 6 Monate Die Lösungen können in der Originalflasche bis zu 3mal eingefroren werden. Zusätzlich benötigte Materialien Standard-Human-Plasma, Bestell-Nr. ORKL Essigsäure 20%ig (nur für die Zweipunkt-Methode) Untersuchungsmaterial Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung 0,11 mol/l mit 9 Teilen Venenblut sorgfältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort mindestens10 min bei mindestens 1500 x g zentrifugieren. Stabilität der Probe: –20°C 1 Monat +15 bis +25°C 8 Stunden Bei –20 °C gelagerte Plasmen innerhalb von 10 min bei 37 °C auftauen und die Bestimmung dann innerhalb von 8 Stunden durchführen. Methodik Testdurchführung Küvette: 1 cm Schichtdicke Wellenlänge: 405 nm Testtemperatur: +37 °C Faktor Xa-Reagenz, Substrat-Reagenz sowie die Kunststoffküvetten bzw. -röhrchen auf 37°C, ATIII-Reagenz auf Raumtemperatur (+15° bis +25°C) vorwärmen. Kinetische Methode Probe 150 µl ATIII-Reagenz 150 µl Faktor Xa-Reagenz 500 µl mischen und genau 1 min bei 37°C inkubieren. Substrat-Reagenz 100 µl mischen und ∆E 405 nm /min bestimmen. Testansatz für Chromotimer: Bei gleichen Inkubationszeiten ist das Volumen der verwendeten Lösungen zu halbieren. Manuelle Zweipunkt-Methode (Halbmikroansatz) Probe Probenleerwert Essigsäure 20% – 500 µl Probe 150 µl 150 µl ATIII-Reagenz 150 µl 150 µl Faktor Xa-Reagenz 500 µl 500 µl mischen und genau 1 min bei 37°C inkubieren. Substrat-Reagenz 100 µl 100 µl sofort mischen und nach genau 1 min Zugabe von: Essigsäure 20% 500 µl sofort mischen und die Extinktion innerhalb von 2 Stunden gegen den Probenleerwert bestimmen. Auswertung Die Auswertung erfolgt anhand einer Bezugskurve, die vorher mit dem verwendeten Heparin- Präparat und der gleichen Analysenmethode zu erstellen ist. Das zur in der Therapie verwendete Heparin-Präparat wird mit isotonischer Kochsalzlösung (0,9%) auf 10 IU/ml verdünnt. 100 µl dieser Verdünnung mit 900 µl heparinfreiem Pool- oder Standardplasma (z.B. Standard-Human-Plasma) verdünnen, um eine Konzentration von 1 IU/ml zu erhalten. Die Verdünnungen für die Bezugskurve (Bereich 0-1 IU Heparin/ml) erhält man nach folgender Tabelle: Heparin- Normal- oder Heparinplasma Konzentration Standardplasma 1 IU/ml IU/ml µl µl 1,01 1110 1000 0,75 1250 750 0,51 1500 1500 0,25 1750 1250 0,11 1900 1100 0,11 1000 1110 Anmerkungen 1. Eine Volumenverdopplung oder -halbierung hat keine Auswirkung auf die Auswertung. 2. Das Plasma wird unverdünnt eingesetzt. Wenn die Werte oberhalb des kalibrierten Meßbereichs liegen, ist mit der ATIII-Lösung oder einem heparinfreien Normalplasma (z.B. Standard-Human-Plasma) zu verdünnen. Die erhaltenen Ergebnisse sind entsprechend umzurechnen. 3. Wenn die Heparin-Konzentration sehr niedrig liegt, kann durch die Verlängerung der Inkubationszeit auf 3 Minuten die Empfindlichkeit des Testsystems gesteigert werden. Es muß dann an einer Referenzkurve ausgewertet werden, die ebenfalls mit einer 3- minütigen Inkubation und zusätzlichen Standardverdünnungen erstellt wurde. 4. Spezielle Automatenvorschriften sind auf Anfrage erhältlich. Interne Qualitätskontrolle Für jede Meßreihe sollten mindestens zwei Kontrollen mit unterschiedlichen Heparin-Konzentrationen mitgeführt werden. Werden die erwarteten Werte nicht gefunden, so können die Ergebnisse der Patientenproben nicht verwertet werden. Als Kontrolle kann verwendet werden: Ein heparinfreies Normalplasma (z.B. Kontroll-Plasma N). Damit kann die Stabilität des Reagenzes und der Null-Punkt der Referenzkurve überprüft werden. Ein mit dem zu messenden Heparin-Präparat auf eine entsprechende Konzentration (z.B. 0,5 IU/ml) gebrachtes Normalplasma (z.B. Kontroll-Plasma N). Damit können Sensitivität und Wiederfindung überprüft werden. Einschränkungen und Fehlerquellen Die Inkubationszeiten müssen genau eingehalten werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Leistungsmerkmale des Tests Empfindlichkeit Die Nachweisgrenze für ein unfraktioniertes Heparin lag bei 0,05 IU/ml. Spezifität Die Heparin-Bestimmung mit Berichrom Heparin wird durch Plättchenfaktor 4 (PF4) nicht gestört. Präzision und Reproduzierbarkeit Für Heparinkonzentrationen von 0,5 IU/ml liegt der Variationskoeffizient in der Serie zwischen 4,0 und 7,0% und von Tag zu Tag zwischen 6,9 und 7,1%. Methodenvergleich Bei einem Vergleich von Berichrom Heparin mit einer anderen chromogenen Methode wurden Korrelationskoeffizienten von 0,94 und 0,97 gefunden. Literatur 1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin. Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596 2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410 3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395) Hersteller: Vertreiber Schweiz: Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg Dade Behring AG Bonnstrasse 9 CH-3186 Düdingen Schweiz OWLD G11 E0532 (1211) H 2 Ausgabe August 2000
Berichrom ® Héparine Domaine d’utilisation et indication Berichrom Héparine est un test chromogénique pour la détermination de l’activité d’héparine dans le plasma et pour la surveillance des héparinothérapies. Intérêt diagnostique L’héparine accélère considérablement l’inactivation du facteur Xa de la coagulation et de la thrombine par l’antithrombine III. Ainsi les préparations d’héparine non-fractionnées et de bas poids moléculaires trouvent-elles une large application thérapeutique comme anticoagulants. Malgré une posologie identique, de nombreux facteurs influencent l’effet de l’héparine variable d’un patient à l’autre. Le test Berichrom Héparine permet le suivi des traitements utilisant aussi bien des héparines de bas poids moléculaires (HBPM) que des héparines non-fractionnées (HNF). Principe de la méthode Pendant la phase d’incubation, le facteur Xa est inactivé par l’AT III. Cette réaction est catalysée par l’héparine. Du sulfate de dextran (SD) libère de nouveau l’héparine liée à des facteurs interférants, et la rend ainsi mesurable. Le F Xa qui subsiste après la phase d’incubation est mesuré dans un test cinétique par l’augmentation de la densité optique à 405 nm à l’aide d’un substrat chromogène. Héparine liee + SD > SD lié + héparine libre héparine F Xa + AT III échantillon en excés > [F Xa-AT III] + F XArésiduel F XA substrat chromogène résiduel > tripeptide + colorant Réactifs Contenu du coffret Coffret pour 3 x 20 semi-micro-tests, code OWLD 3 x pour 10 ml de Réactif F Xa 3 x pour 10 ml de Réactif sulfate de dextran 3 x pour 11 ml de Réactif AT III 3 x pour 12 ml de Réactif substrat Composition Réactif F Xa, lyophilisé; fraction plasmatique (humaine) additionnée de Tris (6 g/l), de chlorure de sodium (12 g/l) et d’EDTA (0,74 g/l). Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l) Réactif sulfate de dextran, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 0,02 g/l. Réactif AT III (humain), lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 1 UI/ml Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l) Réactif substrat, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 4 mmol/l de Z-D-Leu- Gly-Arg-ANBA-méthylamide. Mises en garde et précautions d’emploi 1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro 2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb. 3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du Réactif Facteur Xa ou du Réactif AT III a été testé vis-à-vis de l’antigène de surface de l'Hépatite B, de l’anticorps anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorps anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés. Par ailleurs, au cours du processus de fabrication, les produits d’origine humaine en solution sont chauffés 10 heures à +60°C pour inactiver les virus. Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent être manipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où l’on ne peut exclure totalement un risque d’infection 3 . Préparation des réactifs Réactif sulfate de dextran: reconstituer le lyophilisat avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette. Réactif Facteur Xa: reconstituer le lyophilisat avec la quantité de sulfate de dextran reconstitué indiquée sur l’étiquette, et porter le réactif à +37 °C avant son emploi. Réactif AT III: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, puis le porter à la température ambiante avant son emploi. Réactif substrat: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, et le porter à +37°C avant son emploi. Stabilités et conditions de conservation Dans leur conditionnement d’origine non ouvert, les réactifs se conservent à +2/+8°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette. Stabilités après reconstitution: Température Facteur Xa AT III reactif-substrat +37°C 4 heures – 1 semaine +15/+25°C 3 jours 1 semaine 2 semaines +2/+8°C 2 semaines 2 semaines 6 semaines –20°C 2 mois 2 mois 6 mois Les solutions peuvent être congelées jusqu’à 3 fois dans leur flacon d’origine. Autres réactifs nécessaires Plasma standard humain, code ORKL Acide acétique à 20% (uniquement pour la méthode en deux points) Echantillons de patients Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 mol/l) avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de mousse. Centrifuger aussitôt pendant au moins 10 min à au moins 1500 g. Stabilité de l’échantillon: à –20 °C: 1 mois à +15/+25 °C 8 heures Les plasmas congelés a –20°C doivent être décongelés en 10 min à 37°C, et testés dans les 8 heures qui suivent. Méthode Réalisation du test Cuve: 1 cm de trajet optique Longueur d’onde: 405 nm Température du test: +37°C Préchauffer le réactif Facteur Xa, le réactif substrat ainsi que les cuves ou tubes plastique à +37°C, et le réactif AT III à la température ambiante (+15/+25°C). Méthode cinétique Echantillon 150 µl Réactif AT III 150 µl Réactif Facteur Xa 500 µl Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C Réactif substrat 100 µl Mélanger et mesurer la ∆ D.O. 405 nm /min. Protocole sur le Chromotimer: pour les mêmes temps d’incubation, diviser les volumes indiqués par deux. Méthode manuelle en deux points (semi-micro-test) échantillon blanc-échantillon Acide acétique à 20% – 500 µl Echantillon 150 µl 150 µl Réactif AT III 150 µl 150 µl Réactif Facteur Xa 500 µl 500 µl Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C. Réactif substrat 100 µl 100 µl Mélanger aussitôt, et après exactement 1 min, ajouter: Acide acétique à 20% 500 µl Mélanger aussitôt et mesurer la densité optique dans les 2 heures contre le blanc-échantillon. Exploitation des résultats L’exploitation des résultats se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie préalablement selon la même méthode avec la préparation d’héparine utilisée. Diluer la préparation d’héparine utilisée pour la thérapie en solution saline isotonique (0,9%) et la porter à 10 UI/ml. Rediluer 100 µl de cette dilution avec 900 µl d’un pool de plasmas exempt d’héparine ou d’un plasma standard (par ex. le Plasma standard humain), de façon à obtenir une concentration de 1 UI/ml. Pour les dilutions à établir pour la courbe d’étalonnage (domaine allant de 0 à 1 UI d’héparine/ml), se reporter au tableau ci-dessous: concentration plasma normal plasma hépariné d’héparine ou standard à 1 UI/ml UI/ml µl µl 1,05 1000 1000 0,75 1250 1750 0,55 1500 1500 0,25 1750 1250 0,15 1900 1100 0,25 1000 1000 Remarques 1. La multiplication ou la division par deux des prises d’essai n’a pas d’influence sur l’exploitation des résultats. 2. Utiliser le plasma non dilué. Si les valeurs trouvées sont supérieures au domaine de mesure étalonné, diluer les échantillons avec la solution d’AT III ou un plasma normal exempt d’héparine (par ex. le Plasma standard humain). Diviser ensuite les résultats selon le facteur de dilution utilisé. 3. Lorsque la concentration d’héparine est très faible, on peut augmenter la sensibilité du test en allongeant le temps d’incubation à 3 minutes. Il faut alors exploiter les résultats sur une courbe d’étalonnage établie avec également 3 minutes d’incubation et avec des dilutions du standard complémentaires. 4. Les protocoles spécifiques pour automates sont envoyés sur demande. Contrôle de qualité interne Pour chaque série de mesures, introduire au moins deux contrôles ayant des concentrations d’héparine différentes. Si les valeurs attendues ne sont pas retrouvées, les résultats des échantillons de patients ne peuvent pas être exploités. Comme contrôle on peut utiliser: Un plasma normal exempt d’héparine (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de la stabilité du réactif et du point zéro de la courbe d’étalonnage. Un plasma normal amené à la concentration voulue (par ex. 0,5 UI/ml) à l’aide de l’héparine à mesurer (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de sensibilité et de restitution. Limites du test et sources d’erreurs Les temps d’incubation doivent être scrupuleusement respectés si l’on veut obtenir des résultats reproductibles. Caractéristiques du test Sensibilité La limite de mise en évidence pour une héparine non-fractionnée est de 0,05 UI/ml. Spécificité Le dosage de l’héparine à l’aide du test Berichrom Héparine n’est pas perturbé par le facteur 4 plaquettaire (PF4). Précision et reproductibilité A des concentrations d’héparine de 0,5 UI/ml, le coefficient de corrélation dans la série varie de 4,0% à 7,0%, et le coefficient de corrélation de jour à jour varie de 6,9% à 7,1%. Comparaison avec une autre méthode Une comparaison du Berichrom Héparine avec une autre méthode chromogénique a donné des coefficients de corrélation entre 0,94 et 0,97. Littérature 1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin. Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596 2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410 3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395) France: Fabriqué par Dade Behring Marburg GmbH, Marburg (Allemagne), et commercialisé en France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du Capitaine Guynemer, 92903 Paris-La Défense Ce test est enregistré auprès de l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé OWLD G11 E0532 (1211) H 3 Edition Août 2000
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