Berichrom® Heparin - Medcorp

Berichrom ® Heparin
Intended Use and Application
Berichrom Heparin is a chromogenic assay for the determination of the activity of heparin
in plasma and for the monitoring of heparin therapy.
Summary and Explanation
Heparin considerably accelerates the inactivation of coagulation factor Xa and thrombin by
antithrombin III. For this reason unfractionated and low-molecular-weight heparin preparations
are widely used as therapeutic anticoagulants. Due to numerous influences the effect
of an identical dose of heparin varies from patient to patient. Using Berichrom Heparin it is
possible to monitor therapy both with low-molecular-weight (LMW) and unfractionated
heparin preparations.
Principle of the Method
Factor Xa is inactivated by AT III during the incubation phase of the test. This reaction is
catalyzed by heparin. Dextran sulfate (DS) releases heparin which has bound to interfering
factors and thus makes it accessible to the assay. The quantity of F Xa remaining after the
incubation phase is determined via the increase in absorbance at 405 nm, using a
chromogenic substrate in a kinetic test.
heparin bound
+ DS
heparin
F Xa + AT III sample
excess
F XA
Chromogenic substrate
residue
OWLD G11 E0532 (1211) H 1
> DS bound
+ heparin free
> [F Xa-AT III] + F XAresidue
> tripeptide + dye
Reagents
Materials provided
Test kit for 3 x 20 semi-micro tests, Code No. OWLD
3 x for 10 ml Factor Xa Reagent
3 x for 10 ml Dextran Sulfate Reagent
3 x for 11 ml AT III Reagent
3 x for 12 ml Substrate Reagent
Composition
Factor Xa Reagent: lyophilized; human plasma fraction with the additives Tris (6 g/l), sodium
chloride (12 g/l) and EDTA (0.74 g/l)
Preservatives: sodium azide (< 1 g/l)
Dextran Sulfate Reagent, lyophilized; concentration in the working solution: 0.02 g/l.
AT III Reagent (human), lyophilized; concentration in the working solution: 1 IU/ml.
Preservatives: sodium azide (< 1 g/l)
Substrate Reagent, lyophilized; concentration in the working solution: 4 mmol/l Z-D-leugly-arg-ANBA-methyl
amide.
Warnings and precautions
1. For In Vitro Diagnostic Use.
2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution:
Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form
explosive azides when contacting heavy metals such as copper or lead!
3. Each individual blood donation for use in manufacture of the Factor Xa Reagent or AT III
Reagent is tested for hepatitis B surface antigen, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2 by
FDA-required test. Only donations with negative findings are used for manufacture.
Furthermore, during the production process, the materials of human origin are heated
in solution at +60°C for 10 hours for the purpose of virus inactivation.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained
from human blood should always be handled with due care, observing the precautions
recommended for biohazardous material 3 .
Reagent preparation
Dextran Sulfate Reagent: Dissolve in the labelled amount of distilled water.
Factor Xa Reagent: Dissolve in the labelled amount of reconstituted Dextran Sulfate Reagent
and warm to 37°C before use.
AT III Reagent: Dissolve in the labelled amount of distilled water and warm to room
temperature before use.
Substrate Reagent: Dissolve in the labelled amount of distilled water and warm to 37 °C
before use.
Storage and stability
Store the test kit unopened at +2 to +8 °C and use by the expiration date given on the label.
Stability after reconstitution:
Temperature Factor Xa AT III Substrate Reagent
+37°C 4 hours – 1 week
+15°C to +25 °C 3 days 1 week 2 weeks
+2 to +8°C 2 weeks 2 weeks 6 weeks
–20°C 2 months 2 months 6 months
In the original vial the solutions can be frozen up to 3 times.
Materials required but not provided
Standard Human Plasma, Code No. ORKL
Acetic acid 20% (only for the two-point method)
Specimens
To obtain the plasma, carefully mix 1 part sodium citrate solution (0.11 mol/l) with 9 parts
venous blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately at no less than
1500 x g for at least 10 min.
Stability of the sample:
–20°C
1 month
+15 to +25°C 8 hours
Plasma stored at –20°C is to be thawed within 10 minutes at 37 °C after which the assay is
to be performed within 8 hours.
Method
Procedure
cuvette: 1 cm path length
wavelength: 405 nm
test temperature: +37°C
Pre-warm the Factor Xa Reagent, Substrate Reagent and the plastic cuvettes/tubes to
37°C, and the AT III Reagent to room temperature (+15° to +25 °C).
Edition August 2000
Kinetic method
Plasma sample 150 µl
AT III Reagent 150 µl
Factor Xa Reagent 500 µl
Mix and incubate for exactly 1 min at 37°C
Substrate Reagent 100 µl
Mix and determine ∆A 405 nm/min
Test mixture for the kinetic test on the Chromotimer: Using the same incubation times the
volumes of the solutions used have to be halved.
Manual two-point method (semi-micro test)
Sample Sample blank
Acetic acid 20% – 500 µl
Sample 150 µl 150 µl
AT III Reagent 150 µl 150 µl
Factor Xa Reagent 500 µl 500 µl
Mix and incubate for exactly 1 min at 37°C (timed by instrument)
Substrate Reagent 100 µl 100 µl
Mix immediately and after exactly 1 min add: (timed by instrument)
Acetic acid 20% 500 µl
Mix immediately and determine the absorbance against the blank
within 2 hours.
Evaluation
The results are evaluated using a reference curve which must be established prior to the
test using the heparin preparation administered for therapy and the same method of analysis.
Dilute the treatment heparin to 10 IU/ml with isotonic saline (0.9%), then dilute 100 µl of the
resulting dilution with 900 µl of heparin-free pooled plasma or standard plasma (e.g. Standard
Human Plasma) to obtain a concentration of 1 IU/ml. The dilutions required for establishing
the reference curve (range 0 to 1 IU heparin/ml) are obtained as follows:
heparin normal or standard heparinized
concentration plasma plasma 1 IU/ml
IU/ml µl µl
1.01 1110 1000
0.75 1250 1750
0.51 1500 1500
0.25 1750 1250
0.11 1900 1100
0.11 1000 1110
Notes
1. Doubling or halving the volumes used in the assay mixtures has no effect on the
evaluation.
2. The plasma is used in undiluted form. If the values are above the calibrated measurement
range, the sample must be diluted with the AT III solution or a heparin-free normal
plasma (e.g. Standard Human Plasma); the results obtained are then to be corrected for
the dilution factor.
3. If the heparin concentration is very low, the sensitivity of the test system can be increased
by prolonging the incubation period to 3 minutes. In this case te results must be evaluated
using a reference curve which has similarly been established using a 3-minute incubation
period and additional standard dilutions.
4. Special assay protocols for autoanalyzers are available on request.
Internal quality control
Quality control materials containing at least two levels of heparin should be included with
each batch of product sample. If the control materials do not produce the expected results,
patient results must not be reported.
The following can be used for quality control:
A heparin-free normal plasma (e.g. Control Plasma N). This provides a check on the stability
of the reagent and on the zero-point of the reference curve.
A normal plasma adjusted to an appropriate concentration (e.g. 0.5 IU/ml) with the heparin
to be assayed. This provides a check on the sensitivity and recovery.
Limitations and interferences
The incubation periods must be exactly observed in order to obtain reproducible results.
Specific Performance Characteristics
Sensitivity
The limit of detection for an unfractionated heparin is 0.05 IU/ml.
Specificity
The heparin determination using Berichrom Heparin is not disturbed by platelet factor 4
(PF4).
Precision and reproducibility
For heparin concentrations of 0.5 IU/ml the coefficient of variation in the series falls between
4.0 and 7.0% and from day to day between 6.9 and 7.1%.
Method comparison
In a comparison of Berichrom Heparin with another chromogenic method correlation
coefficients of 0.94 and 0.97 were found.
Bibliography
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
Manufacturer:
USA Distributor:
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg/Germany
Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.

Berichrom ® Heparin
Anwendungsbereich und -zweck
Berichrom Heparin ist ein chromogener Test zur Bestimmung der Aktivität von Heparin in
Plasma und zur Überwachung der Heparintherapie.
Diagnostische Bedeutung
Heparin beschleunigt die Inaktivierung von Gerinnungsfaktor Xa und Thrombin durch
Antithrombin III erheblich. Daher finden unfraktionierte und niedermolekulare Heparin-Präparate
verbreitete therapeutische Anwendung als Antikoagulans. Infolge vielfacher Einflüsse
schwankt die Heparinwirkung von Patient zu Patient trotz gleicher Dosierung. Mit
Berichrom Heparin kann die Therapie sowohl mit niedermolekularen (LMW) als auch mit
unfraktionierten Heparin-Präparaten verfolgt werden.
Prinzip der Methode
Faktor Xa wird in der Inkubationsphase durch AT III inaktiviert. Diese Reaktion wird durch
Heparin katalysiert. Dextransulfat (DS) setzt an Störfaktoren gebundenes Heparin wieder
frei und macht es der Bestimmung zugänglich. Der nach der Inkubationsphase verbliebene
Faktor Xa wird in einem kinetischen Test über die Extinktionszunahme bei 405 nm mittels
eines chromogenen Substrats bestimmt.
Heparin gebunden
+ DS
> DS gebunden
+ Heparin frei
Heparin
F Xa + AT III Probe
Überschuß
> [F Xa-AT III] + F XARest
F XA
Chromogenes Substrat
Rest > Tripeptid + Farbstoff
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
Testkit für 3 x 20 Halbmikro-Ansätze, Bestell Nr. OWLD
3 x für 10 ml Faktor Xa-Reagenz
3 x für 10 ml Dextransulfat-Reagenz
3 x für 11 ml ATIII-Reagenz
3 x für 12 ml Substrat-Reagenz
Zusammensetzung
Faktor Xa-Reagenz: lyophilisiert; Plasma-Fraktion (human) mit Zusatz von Tris (6 g/l),
Natriumchlorid (12 g/l) und EDTA (0,74 g/l)
Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l)
Dextransulfat-Reagenz, lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: 0,02 g/l.
AT III-Reagenz (human), lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: 1 IU/ml.
Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l)
Substrat-Reagenz, lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: Z-D-Leu-Gly-Arg-
ANBA-methyl-amid 4 mmol/l.
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung
2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostica ist zu beachten:
Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann
mit Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden.
3. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Faktor Xa-Reagenz oder AT III-
Reagenz vorgesehen war, wurde auf Hepatitis Bs-Antigen, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1
und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem
Befund verwendet.
Außerdem werden die Ausgangsmaterialien humanen Ursprungs beim Herstellungsprozess
zur Virusinaktivierung in Lösung 10 Stunden bei +60°C erhitzt.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen
nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt
unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt
werden 3 .
Vorbereitung der Reagenzien
Dextransulfat-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen.
Faktor Xa-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge des rekonstituierten
Dextransulfat-Reagenzes einlösen und vor Gebrauch auf 37°C temperieren.
AT III-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und vor
Gebrauch auf Raumtemperatur temperieren.
Substrat-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und
vor Gebrauch auf 37°C temperieren.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Der Testkit ist, ungeöffnet bei +2 bis +8°C gelagert, bis zu dem auf dem Etikett angegebenen
Datum verwendbar.
Haltbarkeit nach Rekonstitution:
Temperatur Faktor Xa AT III Substrat-Reagenz
+37 °C 4 Stunden – 1 Woche
+15°C bis +25°C 3 Tage 1 Woche 2 Wochen
+2 bis +8°C 2 Wochen 2 Wochen 6 Wochen
–20°C 2 Monate 2 Monate 6 Monate
Die Lösungen können in der Originalflasche bis zu 3mal eingefroren werden.
Zusätzlich benötigte Materialien
Standard-Human-Plasma, Bestell-Nr. ORKL
Essigsäure 20%ig (nur für die Zweipunkt-Methode)
Untersuchungsmaterial
Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung 0,11 mol/l mit 9 Teilen Venenblut sorgfältig
unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort mindestens10 min bei mindestens
1500 x g zentrifugieren.
Stabilität der Probe:
–20°C
1 Monat
+15 bis +25°C 8 Stunden
Bei –20 °C gelagerte Plasmen innerhalb von 10 min bei 37 °C auftauen und die Bestimmung
dann innerhalb von 8 Stunden durchführen.
Methodik
Testdurchführung
Küvette: 1 cm Schichtdicke
Wellenlänge: 405 nm
Testtemperatur: +37 °C
Faktor Xa-Reagenz, Substrat-Reagenz sowie die Kunststoffküvetten bzw. -röhrchen auf
37°C, ATIII-Reagenz auf Raumtemperatur (+15° bis +25°C) vorwärmen.
Kinetische Methode
Probe 150 µl
ATIII-Reagenz 150 µl
Faktor Xa-Reagenz 500 µl
mischen und genau 1 min bei 37°C inkubieren.
Substrat-Reagenz 100 µl
mischen und ∆E 405 nm
/min bestimmen.
Testansatz für Chromotimer: Bei gleichen Inkubationszeiten ist das Volumen der verwendeten
Lösungen zu halbieren.
Manuelle Zweipunkt-Methode (Halbmikroansatz)
Probe Probenleerwert
Essigsäure 20% – 500 µl
Probe 150 µl 150 µl
ATIII-Reagenz 150 µl 150 µl
Faktor Xa-Reagenz 500 µl 500 µl
mischen und genau 1 min bei 37°C inkubieren.
Substrat-Reagenz 100 µl 100 µl
sofort mischen und nach genau 1 min Zugabe von:
Essigsäure 20% 500 µl
sofort mischen und die Extinktion innerhalb von 2 Stunden gegen den Probenleerwert
bestimmen.
Auswertung
Die Auswertung erfolgt anhand einer Bezugskurve, die vorher mit dem verwendeten Heparin-
Präparat und der gleichen Analysenmethode zu erstellen ist. Das zur in der Therapie verwendete
Heparin-Präparat wird mit isotonischer Kochsalzlösung (0,9%) auf 10 IU/ml verdünnt.
100 µl dieser Verdünnung mit 900 µl heparinfreiem Pool- oder Standardplasma (z.B.
Standard-Human-Plasma) verdünnen, um eine Konzentration von 1 IU/ml zu erhalten. Die
Verdünnungen für die Bezugskurve (Bereich 0-1 IU Heparin/ml) erhält man nach folgender
Tabelle:
Heparin- Normal- oder Heparinplasma
Konzentration Standardplasma 1 IU/ml
IU/ml µl µl
1,01 1110 1000
0,75 1250 750
0,51 1500 1500
0,25 1750 1250
0,11 1900 1100
0,11 1000 1110
Anmerkungen
1. Eine Volumenverdopplung oder -halbierung hat keine Auswirkung auf die Auswertung.
2. Das Plasma wird unverdünnt eingesetzt. Wenn die Werte oberhalb des kalibrierten
Meßbereichs liegen, ist mit der ATIII-Lösung oder einem heparinfreien Normalplasma
(z.B. Standard-Human-Plasma) zu verdünnen. Die erhaltenen Ergebnisse sind entsprechend
umzurechnen.
3. Wenn die Heparin-Konzentration sehr niedrig liegt, kann durch die Verlängerung der
Inkubationszeit auf 3 Minuten die Empfindlichkeit des Testsystems gesteigert werden.
Es muß dann an einer Referenzkurve ausgewertet werden, die ebenfalls mit einer 3-
minütigen Inkubation und zusätzlichen Standardverdünnungen erstellt wurde.
4. Spezielle Automatenvorschriften sind auf Anfrage erhältlich.
Interne Qualitätskontrolle
Für jede Meßreihe sollten mindestens zwei Kontrollen mit unterschiedlichen Heparin-Konzentrationen
mitgeführt werden. Werden die erwarteten Werte nicht gefunden, so können
die Ergebnisse der Patientenproben nicht verwertet werden.
Als Kontrolle kann verwendet werden:
Ein heparinfreies Normalplasma (z.B. Kontroll-Plasma N). Damit kann die Stabilität des
Reagenzes und der Null-Punkt der Referenzkurve überprüft werden.
Ein mit dem zu messenden Heparin-Präparat auf eine entsprechende Konzentration (z.B.
0,5 IU/ml) gebrachtes Normalplasma (z.B. Kontroll-Plasma N). Damit können Sensitivität
und Wiederfindung überprüft werden.
Einschränkungen und Fehlerquellen
Die Inkubationszeiten müssen genau eingehalten werden, um reproduzierbare Ergebnisse
zu erhalten.
Leistungsmerkmale des Tests
Empfindlichkeit
Die Nachweisgrenze für ein unfraktioniertes Heparin lag bei 0,05 IU/ml.
Spezifität
Die Heparin-Bestimmung mit Berichrom Heparin wird durch Plättchenfaktor 4 (PF4) nicht
gestört.
Präzision und Reproduzierbarkeit
Für Heparinkonzentrationen von 0,5 IU/ml liegt der Variationskoeffizient in der Serie zwischen
4,0 und 7,0% und von Tag zu Tag zwischen 6,9 und 7,1%.
Methodenvergleich
Bei einem Vergleich von Berichrom Heparin mit einer anderen chromogenen Methode
wurden Korrelationskoeffizienten von 0,94 und 0,97 gefunden.
Literatur
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
Hersteller:
Vertreiber Schweiz:
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
Dade Behring AG
Bonnstrasse 9
CH-3186 Düdingen
Schweiz
OWLD G11 E0532 (1211) H 2
Ausgabe August 2000

Berichrom ® Héparine
Domaine d’utilisation et indication
Berichrom Héparine est un test chromogénique pour la détermination de l’activité d’héparine
dans le plasma et pour la surveillance des héparinothérapies.
Intérêt diagnostique
L’héparine accélère considérablement l’inactivation du facteur Xa de la coagulation et de la
thrombine par l’antithrombine III. Ainsi les préparations d’héparine non-fractionnées et de
bas poids moléculaires trouvent-elles une large application thérapeutique comme anticoagulants.
Malgré une posologie identique, de nombreux facteurs influencent l’effet de
l’héparine variable d’un patient à l’autre. Le test Berichrom Héparine permet le suivi des
traitements utilisant aussi bien des héparines de bas poids moléculaires (HBPM) que des
héparines non-fractionnées (HNF).
Principe de la méthode
Pendant la phase d’incubation, le facteur Xa est inactivé par l’AT III. Cette réaction est
catalysée par l’héparine. Du sulfate de dextran (SD) libère de nouveau l’héparine liée à
des facteurs interférants, et la rend ainsi mesurable. Le F Xa qui subsiste après la phase
d’incubation est mesuré dans un test cinétique par l’augmentation de la densité optique à
405 nm à l’aide d’un substrat chromogène.
Héparine liee
+ SD
> SD lié
+ héparine libre
héparine
F Xa + AT III échantillon
en excés
> [F Xa-AT III] + F XArésiduel
F XA
substrat chromogène
résiduel > tripeptide + colorant
Réactifs
Contenu du coffret
Coffret pour 3 x 20 semi-micro-tests, code OWLD
3 x pour 10 ml de Réactif F Xa
3 x pour 10 ml de Réactif sulfate de dextran
3 x pour 11 ml de Réactif AT III
3 x pour 12 ml de Réactif substrat
Composition
Réactif F Xa, lyophilisé; fraction plasmatique (humaine) additionnée de Tris (6 g/l), de
chlorure de sodium (12 g/l) et d’EDTA (0,74 g/l).
Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)
Réactif sulfate de dextran, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 0,02 g/l.
Réactif AT III (humain), lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 1 UI/ml
Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)
Réactif substrat, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 4 mmol/l de Z-D-Leu-
Gly-Arg-ANBA-méthylamide.
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro
2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution :
ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium
peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.
3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du Réactif Facteur Xa ou du
Réactif AT III a été testé vis-à-vis de l’antigène de surface de l'Hépatite B, de l’anticorps
anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorps anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés
négatifs ont été utilisés.
Par ailleurs, au cours du processus de fabrication, les produits d’origine humaine en
solution sont chauffés 10 heures à +60°C pour inactiver les virus.
Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent être
manipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure
où l’on ne peut exclure totalement un risque d’infection 3 .
Préparation des réactifs
Réactif sulfate de dextran: reconstituer le lyophilisat avec la quantité d’eau distillée indiquée
sur l’étiquette.
Réactif Facteur Xa: reconstituer le lyophilisat avec la quantité de sulfate de dextran
reconstitué indiquée sur l’étiquette, et porter le réactif à +37 °C avant son emploi.
Réactif AT III: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, puis le
porter à la température ambiante avant son emploi.
Réactif substrat: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, et le
porter à +37°C avant son emploi.
Stabilités et conditions de conservation
Dans leur conditionnement d’origine non ouvert, les réactifs se conservent à +2/+8°C jusqu’à
la date de péremption indiquée sur l’étiquette.
Stabilités après reconstitution:
Température Facteur Xa AT III reactif-substrat
+37°C 4 heures – 1 semaine
+15/+25°C 3 jours 1 semaine 2 semaines
+2/+8°C 2 semaines 2 semaines 6 semaines
–20°C 2 mois 2 mois 6 mois
Les solutions peuvent être congelées jusqu’à 3 fois dans leur flacon d’origine.
Autres réactifs nécessaires
Plasma standard humain, code ORKL
Acide acétique à 20% (uniquement pour la méthode en deux points)
Echantillons de patients
Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 mol/l)
avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de
mousse. Centrifuger aussitôt pendant au moins 10 min à au moins 1500 g.
Stabilité de l’échantillon:
à –20 °C: 1 mois
à +15/+25 °C 8 heures
Les plasmas congelés a –20°C doivent être décongelés en 10 min à 37°C, et testés dans
les 8 heures qui suivent.
Méthode
Réalisation du test
Cuve:
1 cm de trajet optique
Longueur d’onde: 405 nm
Température du test: +37°C
Préchauffer le réactif Facteur Xa, le réactif substrat ainsi que les cuves ou tubes plastique
à +37°C, et le réactif AT III à la température ambiante (+15/+25°C).
Méthode cinétique
Echantillon 150 µl
Réactif AT III 150 µl
Réactif Facteur Xa 500 µl
Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C
Réactif substrat 100 µl
Mélanger et mesurer la ∆ D.O. 405 nm
/min.
Protocole sur le Chromotimer: pour les mêmes temps d’incubation, diviser les volumes
indiqués par deux.
Méthode manuelle en deux points (semi-micro-test)
échantillon blanc-échantillon
Acide acétique à 20% – 500 µl
Echantillon 150 µl 150 µl
Réactif AT III 150 µl 150 µl
Réactif Facteur Xa 500 µl 500 µl
Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C.
Réactif substrat 100 µl 100 µl
Mélanger aussitôt, et après exactement 1 min, ajouter:
Acide acétique à 20% 500 µl
Mélanger aussitôt et mesurer la densité optique dans les 2 heures contre le
blanc-échantillon.
Exploitation des résultats
L’exploitation des résultats se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie préalablement
selon la même méthode avec la préparation d’héparine utilisée. Diluer la préparation
d’héparine utilisée pour la thérapie en solution saline isotonique (0,9%) et la porter à 10
UI/ml. Rediluer 100 µl de cette dilution avec 900 µl d’un pool de plasmas exempt d’héparine
ou d’un plasma standard (par ex. le Plasma standard humain), de façon à obtenir une
concentration de 1 UI/ml. Pour les dilutions à établir pour la courbe d’étalonnage (domaine
allant de 0 à 1 UI d’héparine/ml), se reporter au tableau ci-dessous:
concentration plasma normal plasma hépariné
d’héparine ou standard à 1 UI/ml
UI/ml µl µl
1,05 1000 1000
0,75 1250 1750
0,55 1500 1500
0,25 1750 1250
0,15 1900 1100
0,25 1000 1000
Remarques
1. La multiplication ou la division par deux des prises d’essai n’a pas d’influence sur
l’exploitation des résultats.
2. Utiliser le plasma non dilué. Si les valeurs trouvées sont supérieures au domaine de
mesure étalonné, diluer les échantillons avec la solution d’AT III ou un plasma normal
exempt d’héparine (par ex. le Plasma standard humain). Diviser ensuite les résultats
selon le facteur de dilution utilisé.
3. Lorsque la concentration d’héparine est très faible, on peut augmenter la sensibilité du
test en allongeant le temps d’incubation à 3 minutes. Il faut alors exploiter les résultats
sur une courbe d’étalonnage établie avec également 3 minutes d’incubation et avec des
dilutions du standard complémentaires.
4. Les protocoles spécifiques pour automates sont envoyés sur demande.
Contrôle de qualité interne
Pour chaque série de mesures, introduire au moins deux contrôles ayant des concentrations
d’héparine différentes. Si les valeurs attendues ne sont pas retrouvées, les résultats des
échantillons de patients ne peuvent pas être exploités.
Comme contrôle on peut utiliser:
Un plasma normal exempt d’héparine (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de
la stabilité du réactif et du point zéro de la courbe d’étalonnage.
Un plasma normal amené à la concentration voulue (par ex. 0,5 UI/ml) à l’aide de l’héparine
à mesurer (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de sensibilité et de restitution.
Limites du test et sources d’erreurs
Les temps d’incubation doivent être scrupuleusement respectés si l’on veut obtenir des
résultats reproductibles.
Caractéristiques du test
Sensibilité
La limite de mise en évidence pour une héparine non-fractionnée est de 0,05 UI/ml.
Spécificité
Le dosage de l’héparine à l’aide du test Berichrom Héparine n’est pas perturbé par le
facteur 4 plaquettaire (PF4).
Précision et reproductibilité
A des concentrations d’héparine de 0,5 UI/ml, le coefficient de corrélation dans la série
varie de 4,0% à 7,0%, et le coefficient de corrélation de jour à jour varie de 6,9% à 7,1%.
Comparaison avec une autre méthode
Une comparaison du Berichrom Héparine avec une autre méthode chromogénique a donné
des coefficients de corrélation entre 0,94 et 0,97.
Littérature
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
France:
Fabriqué par Dade Behring Marburg GmbH, Marburg (Allemagne), et commercialisé
en France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du
Capitaine Guynemer, 92903 Paris-La Défense
Ce test est enregistré auprès de l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Produits de Santé
OWLD G11 E0532 (1211) H 3
Edition Août 2000

Berichrom ® Eparina
Settori d’impiego e funzione
Determinazione dell’attività dell’eparina nel plasma per il controllo della terapia eparinica.
Significato diagnostico
L’eparina accelera notevolmente l’inattivazione del fattore di coagulazione Xa e della
trombina tramite l’antitrombina III. I preparati eparinici non frazionati e quelli a basso peso
molecolare hanno pertanto un diffuso impiego terapeutico come anticoagulanti. In
considerazione dei molteplici effetti l’azione dell’eparina può essere diversa da paziente a
paziente a parità di dosaggio. Con il Berichrom ® Eparina e possibile seguire terapie che
impiegano sia eparine a basso peso molecolare (LMW) sia preparati eparinici non frazionati.
Principio del metodo
Il fattore Xa viene inattivato dall’AT III durante la fase di incubazione del test. Questa reazione
viene catalizzata dall’eparina. Il solfato di destrano (DS) rilascia di nuovo l’eparina legata a
fattori interferenti e in questo modo rende possibile la determinazione. Il F Xa residuo dopo
la fase dell’incubazione viene determinato mediante un test cinetico in base all’aumento
dell’estinzione a 405 nm utilizzando un substrato cromogenico.
Eparina legata
+ DS
> DS legato
+ Eparina libera
eparina
F Xa + AT III campione
eccesso
> [F Xa-AT III] + F Xaresiduo
F XA
Substrato cromogenico
residuo > Tripeptide + colorante
Reagenti
Contenuto della confezione
Kit da 3 x 20 determinazioni semimicro, codice WLD
3 flaconi da 10 mL di reagente F Xa
3 flaconi da 10 mL di reagente solfato di destrano
3 flaconi da 11 mL di reagente AT III
3 flaconi da 12 mL di reagente substrato
Composizione
Reagente F Xa, liofilizzato; frazione di plasma (umano) con l’aggiunta di Tampone Tris (6
g/L), cloruro di sodio (12 g/L) e EDTA (0,74 g/L).
Conservanti: sodio azide (< 1 g/L)
Reagente solfato di destrano, liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso:
0,02 g/L.
Reagente AT III (umana), liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso: 1 UI/mL.
Agents de conservation: sodio azide (< 1 g/L)
Reagente substrato, liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso: Z-D-Leu-Gli-Arg-
ANBA-metilamide 4 mmol/L.
Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in-vitro
2. Quando si impiegano diagnostici in vitro contenenti sodio azide osservare le seguenti
precauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose.
La sodio azide a contatto con metalli pesanti, come rame e/o piombo, può formare azidi
esplosive.
3. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione del reagente F Xa o del reagente
AT III è stata esaminata per la ricerca dell’antigene di superficie del virus dell’epatite B e
degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2 secondo i test richiesti dall'FDA. Solo i
campioni risultati negativi sono stati impiegati per la produzione.
Solo i prelievi che risultano negativi vengono impiegati per la produzione. Inoltre i derivati
di origine umana durante la fase di produzione vengono riscaldati in soluzione per 10
ore a +60°C per l’inattivazione del virus.
Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie
precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è
possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni 3 .
Preparazione dei reagenti
Reagente solfato di destrano: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sulla etichetta.
Reagente Fattore Xa: sciogliere con il reagente di solfato di destrano ricostituito secondo la
quantità indicata sulla etichetta e portare a 37°C prima dell’uso.
Reagente AT III: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sull’etichetta e portare a
temperatura ambiente prima dell’uso.
Reagente substrato: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sull`etichetta e portare
a 37°C prima dell’uso.
Conservazione e validità
Il kit può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta, se conservato
sigillato a +2°/+8°C.
Validità dopo ricostituzione:
Temperatura Fattore Xa AT III Reagente-Substrato
+37 °C 4 ore – 1 settimana
+15/+25 °C 3 giorni 1 settimana 2 settimane
+2/+8 °C 2 settimane 2 settimane 6 settimane
–20°C 2 mesi 2 mesi 6 mesi
Le soluzioni possono essere congelate nella confezione originale per un massimo di
3 volte.
Materiale necessario supplementare
Plasma umano standard, codice RKL
Acido acetico al 20% (soltanto per il metodo a due punti)
Campioni in esame
Mescolare accuratamente, evitando la formazione di schiuma, 1 parte della soluzione di
citrato di sodio (0,11 mol/L) con 9 parti di sangue venoso. Centrifugare subito per almeno
10 min. ad almeno 1500 x g.
Stabilità del campione:
1 mese a –20°C
8 ore a +15°/+25°C
Scongelare entro 10 min a 37°C i plasmi conservati a –20°C ed effettuare la determinazione
entro 8 ore.
Metodica
Esecuzione del test
Cuvetta:
1 cm di percorso ottico
Lunghezza d’onda: 405 nm
Temperatura del test: +37°C
Portare a temperatura di +37°C il reagente F Xa, il reagente substrato e le cuvette e/o
provette di plastica e portare a temperatura ambiente (+15 °/+25°C) il Reagente AT III.
Metodo cinetico
Campione 150 µL
Reagente AT III 150 µL
Reagente Fattore Xa 500 µL
Mescolare ed incubare a +37°C esattamente per 1 min
Reagente substrato 100 µL
Mescolare e determinare il ∆ E 405 nm
/min.
Esecuzione del test con il Chromotimer: mantenendo gli stessi tempi di incubazione
dimezzare il volume delle soluzioni impiegate.
Metodo manuale a due punti (determinazione semimicro)
campione bianco campione
Acido acetico al 20% – 500 µL
Campione 150 µL 150 µL
Reagente AT III 150 µL 150 µL
Reagente fattore Xa 500 µL 500 µL
Mescolare ed incubare a +37°C esattamente per 1 min.
Reagente substrato 100 µL 100 µL
Mescolare immediatamente e dopo 1 min esatto aggiungere:
Acido acetico al 20% 500 µL
Mescolare immediatamente e determinare entro 2 ore l’estinzione contro il bianco
campione.
Valutazione
I risultati vengono valutati sulla base di una curva di calibrazione allestita mediante il preparato
eparinico utilizzato per la terapia rispettando gli stessi tempi di incubazione. Diluire
tale preparato a 10 UI/mL con soluzione isotonica salina (0,9%). Diluire quindi 100 µL della
diluizione risultante con 900 µL di una miscela di plasmi o con plasma standard esenti da
eparina (ad es. Plasma umano standard) per ottenere una concentrazione di 1 UI/mL.
Le diluizioni richieste per preparare la curva di calibrazione (ambito da 0 a 1 UI di eparina/
mL) si possono desumere dalla seguente tabella:
Concentrazione Plasma standard o Plasma eparinizzato
di eparina normale 1 UI/mL
UI/mL µL µL
1,05 1000 1000
0,75 1250 1750
0,55 1500 1500
0,25 1750 1250
0,15 1900 1100
0,25 1000 1000
Note
1. Il raddoppio o il dimezzamento dei volumi nel test non influenza la valutazione o il fattore
interno del laboratorio.
2. Il plasma viene utilizzato indiluito. Se i valori sono al di sopra dell’ambito di misura
corrispondente alla calibrazione, il plasma deve essere prediluito con la soluzione AT III
o con un plasma normale senza eparina (ad es plasma umano standard). I risultati
ottenuti devono essere convertiti corrispondentemente.
3. Se la concentrazione di eparina è molto bassa, la sensibilita del sistema per il test può
essere aumentata prolungando il tempo di incubazione a 3 minuti. Si deve quindi fare
una valutazione sulla base della curva di riferimento, calcolata con un tempo di
incubazione di 3 minuti.
4. Su richiesta si possono ricevere speciali protocolli per l’esecuzione in automazione.
Controllo di qualità interno
Per ciascuna serie di valutazioni devono essere condotti almeno due controlli con differenti
concentrazioni di eparina. Se non vengono riscontrati i valori attesi, i risultati dei campioni
dei pazienti non possono essere utilizzati.
Come controlli possono essere utilizzati:
un plasma normale non contenente eparina (ad es. plasma di controllo N). Mediante tale
controllo è possibile esaminare sia la stabilità del reagente sia il punto zero della curva;
un plasma normale (ad es. plasma di controllo N) portato ad una concentrazione adeguata
(ad es. 0,5 UI/mL) con l’eparina da dosare. Mediante tale controllo è possibile valutare sia
la sensibilità che la riproducibilità.
Limitazioni e fonti di errore
Per ottenere risultati riproducibili è necessario attenersi esattamente ai tempi di incubazione.
Caratteristiche del test
Sensibilità
Il limite di identificazione per l’eparina non frazionata è 0,05 UI/mL.
Specificità
La determinazione dell’eparina con il Berichrom Eparina non viene influenzata dal fattore
piastrinico 4 (PF4).
Precisione e riproducibilità
Con una concentrazione eparinica di 0,5 UI/mL, il coefficiente di variazione nella serie è
tra 4,0 e 7,0% e quello inter-assay tra 6,9 e 7,1%.
Confronto tra metodi
Dal confronto fra Berichrom Eparina e altri metodi cromogenici sono stati trovati coefficienti
di correlazione di 0,94 e 0,97.
Bibliografia
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. e Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10, (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U.S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
Confezioni originali:
Rappresentante per l'Italia:
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
Dade Behring SPA
Via Lampedusa 11/A
20141 Milano/Italy
OWLD G11 E0532 (1211) H 4
Edizione Agosto 2000

Berichrom ® Heparina
Campo de aplicación y finalidad de su empleo
Berichrom Heparina es una prueba cromógena para la determinación de la actividad
heparínica en el plasma y para el control de la terapéutica heparínica.
Importancia diagnóstica
La heparina acelera considerablemente la inactivacion del factor de coagulación Xa y de
la trombina mediante la antitrombina III. Por ello, el uso de los preparados de heparina sin
fraccionar y de bajo peso molecular encuentran un dilatado campo de aplicación como
anticoagulantes. Aun con la misma dosificación, el efecto de la heparina varía de un paciente
a otro, pues está sometido a la influencia de múltiples factores. Con Berichrom Heparina
se puede controlar tanto la terapéutica con preparados heparínicos de bajo peso molecular
(LMW) como con preparados de heparina sin fraccionar.
Principio del método
El factor Xa es inactivado por el reactivo AT III durante la fase de incubación. Esta reacción
es catalizada mediante heparina. El dextransulfato (DS) libera la heparina fijada en los
factores de perturbación y hace posible su determinación. El factor Xa restante después
de la fase de incubación se determina en una prueba cinética mediante el aumento de la
extinción a 405 nm utilizando un sustrato cromógeno.
heparina fijada
+ DS
> DS fijado
+ heparina libre
heparina
F Xa + AT III muestra
excedente
> [F Xa-AT III] + F XAresto
F XA
sustrato cromógeno
resto > tripéptido + colorante
Reactivos
Contenido del envase
Equipo de prueba para 3 x 20 semimicrodeterminaciones, N° de pedido OWLD
3 x para 10 ml de Reactivo Factor Xa
3 x para 10 ml de Reactivo de dextransulfato
3 x para 11 ml de Reactivo AT III
3 x para 12 ml de Reactivo sustrato
Composición
Reactivo de Factor Xa, liofilizado; fracción de plasma (humano) con adición de Tris
(6 g/l), cloruro de sodio (12 g/l) y EDTA (0,74 g/l)
Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l)
Reactivo de dextransulfato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 0,02 g/l
Reactivo AT III (humano), liofilizado; concentración en la solución de uso: 1 UI/ml
Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l)
Reactivo sustrato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 4 mmol/l de Z-D-Leu-
Gly-Arg-ANBA-metilamida
Advertencias y medidas de precaución
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro
2. En el manejo de diagnóticos in-vitro que contengan azida sódica se debe observar:
No ingerir y evitar el contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar
azidas explosivas con metales pesados como cobre y plomo.
3. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación del Reactivo de Factor
Xa o de Reactivo AT III ha sido investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-
HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados
negativos.
Además, durante el proceso de fabricación de los materiales de origen humano, los
virus son inactivados por calentamiento de la solución durante 10 horas a +60°C.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana
deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de
seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede
excluir completamente la existencia de agentes patógenos 3 .
Preparación de los reactivos
Reactivo de dextransulfato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la
etiqueta.
Reactivo de Factor Xa: disolver con la cantidad de reactivo de dextransulfato reconstituido
indicada en la etiqueta y calentar a +37 °C antes de usarlo.
Reactivo AT III: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y llevar a
la temperatura ambiente antes de usarlo.
Reactivo sustrato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y
calentar a +37°C antes de usarlo.
Estabilidad y almacenaje
El equipo de prueba, en su envase aún cerrado y conservado entre +2 y +8°C, es utilizable
hasta la fecha indicada en la etiqueta.
Estabilidad después de la reconstitución:
Temperatura Factor Xa AT III Reactivo sustrato
+37°C 4 horas – 1 semana
entre +15 y +25°C 3 días 1 semana 2 semanas
entre +2 y +8 °C 2 semanas 2 semanas 6 semanas
a –20 °C 2 meses 2 meses 6 meses
Las soluciones pueden ser congeladas hasta 3 veces en el frasco original.
Materiales adicionales necesarios
Plasma humano estándar, N° de pedido ORKL
Acido acético al 20% (solamente para el método de dos puntos)
Material a investigar
Para obtener el plasma, mezclar cuidadosamente, evitando la formacion de espuma,
1 parte de solucion de citrato de sodio 0,11 mol/l con 9 partes de sangre venosa. Centrifugar
inmediamente por lo menos durante 10 min. a por lo menos 1500 x g.
Estabilidad de la muestra:
a –20 °C
1 mes
entre +15 y +25°C 8 horas
Los plasmas mantenidos a –20 °C deben ser descongelados en el plazo de 10 min a +37°C
y la determinación debe ser realizada dentro de las 8 horas subsiguientes.
Método
realización de la prueba
Cubeta:
trayectoria óptica de 1 cm
Longitud de onda: 405 nm
Temperatura de la prueba: +37 °C
Precalentar el Reactivo de factor Xa, el Reactivo sustrato, así como las cubetas y los tubos
plásticos a +37°C y llevar el Reactivo AT III a la temperatura ambiente (entre +15 y +25°C).
Método cinético
Muestra 150 µl
Reactivo AT III 150 µl
Reactivo de factor Xa 500 µl
mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C.
Reactivo sustrato 100 µl
mezclar y determinar la ∆ E 405 nm
/min
Determinación en el Chromotimer: Para los mismos tiempos de incubación hay que reducir
a la mitad el volumen de las soluciones empleadas.
Método manual de dos puntos (semimicro determinación)
Muestra Valor de la
muestra testigo
Acido acético al 20% – 500 µl
Muestra 150 µl 150 µl
Reactivo AT III 150 µl 150 µl
Reactivo de factor Xa 500 µl 500 µl
mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C.
Reactivo sustrato 100 µl 100 µl
mezclar de inmediato y luego de exactamente 1 min agregar:
Acido acético al 20% 500 µl
mezclar de inmediato y, dentro del plazo de 2 horas, determinar la extinción contra el
valor de las muestras testigo.
Valoración
La valoración se efectúa utilizando una curva de referencia trazada previamente con el
preparado de heparina empleado y con el mismo método analítico. El preparado heparínico
a utilizar se diluye con solución isotónica de cloruro de sodio (0,9%) hasta alcanzar
10 UI/ml. Diluir 100 µl de esta dilución con 900 µl de una mezcla de plasma libre de heparina
o de plasma estándar (por ej. Plasma humano estándar) a fin de lograr una concentración
de 1 UI/ml. Las diluciones para la curva de referencia (zona de 0 a 1 UI de heparina/ml) se
obtienen de acuerdo a la siguiente tabla:
Concentración Plasma normal o Plasma heparínico
de heparina plasma estándar 1 UI/ml
UI/ml µl µl
1,05 1000 1000
0,75 1250 1750
0,55 1500 1500
0,25 1750 1250
0,15 1900 1100
0 15 1000 1000
Notas
1. La duplicación o la división por dos del volumen utilizado en la determinación no ejercen
ninguna influencia sobre la valoración.
2. El plasma se utiliza sin diluir. Cuando los valores se encuentran por encima de la zona
calibrada de medida, hay que diluirlo con la solución de AT III o con un plasma normal
libre de heparina (por ej. Plasma humano estándar). Los resultados obtenidos deben
ser calculados en la forma correspondiente.
3. Cuando la concentración de heparina es muy baja, se puede aumentar la sensibilidad
de la prueba prolongando el tiempo de incubación a 3 minutos. En este caso hay que
efectuar la valoración con una curva de referencia trazada también con una incubación
de 3 minutos y diluciones adicionales del estándar.
4. Las instrucciones especiales para los aparatos automáticos se obtienen a solicitud del
interesado.
Control de calidad
Para cada serie de medidas se deben efectuar simultáneamente por lo menos dos controles
con diferentes concentraciones de heparina. Si no se obtienen los valores esperados, los
resultados de las muestras de los pacientes no pueden ser valorados.
Como controles se pueden utilizar:
Un plasma normal libre de heparina (por ej. Plasma N de control). Con él se pueden verificar
la estabilidad del reactivo y el punto cero de la curva de referencia.
Un plasma normal (por ej. Plasma N de control) llevado a una determinada concentración
(por ej. 0,5 UI/ml) mediante el preparado de heparina a analizar. Con él se pueden verificar
la sensibilidad y la recuperación.
Limitaciones y fuentes de error
Respetar exactamente los tiempos de incubacion a fin de conseguir resultados reproducibles.
Características de rendimiento de la prueba
Sensibilidad
El límite de detección para una heparina sin fraccionar es de 0,05 UI/ml.
Especificidad
La determinación de heparina con Berichrom Heparina no es perturbada por el factor
plaquetario 4 (FP4).
Precisión y reproducibilidad
Para las concentraciones de heparina de 0,5 UI/ml el coeficiente de variacion en la serie
se halla entre 4,0 y 7,0% y de un dÅa al otro, entre 6,9 y 7,1%.
Comparación de métodos
En una comparación de Berichrom Heparina con otro método cromógeno se encontraron
coeficientes de correlación de 0,94 y 0,97.
Bibliografía
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
Fabricante: Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg/Germany
OWLD G11 E0532 (1211) H 5
Edición Agosto 2000

Berichrom ® Heparina
Campo de aplicação e objectivo
Berichrom Heparina é um teste cromogénico para determinação da actividade de heparina
no plasma e na vigilância da terapia pela heparina.
Significado diagnóstico
Heparina acelera notavelmente a inactivação do factor Xa (F Xa) e da trombina por meio
de antitrombina (AT) III. Preparados de heparina não fraccionados e de baixo peso molecular
têm por isso larga difusão terapêutica como anticoagulantes. Por múltiplas razões, o efeito
da heparina varia muito de indivíduo para indivíduo, não obstante igual posologia. O teste
Berichrom Heparina permite controlar tratamentos pela heparina, não só por heparinas de
baixo peso molecular (HBPM) mas também por heparinas não fraccionadas (HNF).
Princípio metodológico
Durante a fase de incubação, o F Xa é inactivado por AT III. Esta reacção é catalisada pela
heparina. Sulfato de dextrano (SD) liberta novamente a heparina ligada a factores
interferentes, tornando-a assim mensurável. Mediante um substrato cromógeno, o F Xa
residual após a fase de incubação é medido num teste cinético na base do aumento da
extinção a 405 nm.
Heparina ligada
+ SD
> SD ligado
+ Heparina livre
Heparina
F Xa + AT III amostra
excesso
> [F Xa-AT III] + F Xaresidual
F XA
Substrato cromógeno
residual > tripéptido + corante
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
Testkit para 3 x 20 determinações semimicro, código OWLD
3 x para 10 ml Reagente F Xa
3 x para 10 ml Reagente sulfato de dextrano
3 x para 1 ml Reagente AT III
3 x para 2ml Reagente substrato
Composição
Reagente F Xa: liofilizado; fracção plasmática (humana) com adição de tampão Tris (6 g/l),
cloreto de sódio (12 g/l) e EDTA (0,74 g/l)
Conservante: azida de sódio (< 1 g/l)
Reagente sulfato de dextrano, liofilizado; concentração da solução de uso: 0,02 g/l
Reagente AT III (humano), liofilizado; concentração da solução de uso: 1 UI/ml
Conservante: azida de sódio (< 1 g/l)
Reagente substrato, liofilizado; concentração da solução de uso: Z-D-Leu-Gli-Arg-ANBAmetilo-amida
4 mmol/l.
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro.
2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de
azida de sódio:
Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas!
Com metais pesados, como cobre ou chumbo, a azida de sódio pode formar azidas
explosivas!
3. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de Reagente Factor Xa ou
Reagente AT III foi sujeita a testes de detecção de HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 e anti-
HIV2. Utilizadas foram unicamente preparações achadas negativas.
Além disso, no decurso da fabricação, todos os materiais de origem humana são
aquecidos durante 10 horas em solução a +60 °C para inactivação de vírus.
Não obstante, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manejados
com as precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em
caso de risco biológico, uma vez que nunca se pode excluir inteiramente o risco de
contaminação por agentes patogénicos 3 .
Preparação dos reagentes
Reagente sulfato de dextrano: reconstituir o liofilizado com a quantidade de água destilada
indicada no rótulo.
Reagente F Xa: reconstituir o liofilizado com a quantidade de sulfato de dextrano
reconstituído indicada no rótulo e levar a +37 °C antes do uso.
Reagente AT III: reconstituir com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e levar
à temperatura ambiente antes do uso.
Reagente substrato: reconstituir com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e
levar a +37 °C antes do uso.
Estabilidade e condições de conservação
Não abertos, e conservados entre +2 e +8 °C, os reagentes mantêm-se utilizáveis até à
data indicada no rótulo.
Estabilidade após reconstituição:
Temperatura F Xa AT III Reagente substrato
+37 °C 4 horas – 1 semana
+15 a +25°C 3 dias 1 semana 2 semanas
+2 a +8°C 2 semanas 2 semanas 6 semanas
–20°C 2 meses 2 meses 6 meses
As soluções podem ser congeladas até 3 vezes nos frascos originais.
Outro material necessário
Plasma humano standard, código ORKL
Ácido acético a 20% (só para o método de dois pontos)
Amostras
Para obtenção do plasma, misturar cuidadosamente, evitando formação de espuma, 1
parte de solução de citrato de sódio (0,11 mol/l) com 9 partes de sangue venoso. Centrifugar
imediatamente durante 10 min, pelo menos, a uma velocidade de, pelo menos, 1.500 x g.
Estabilidade da amostra:
–20 °C 1 mês
+15 a +25 °C 8 horas
Plasmas conservados a -20 °C devem ser descongelados dentro de 10 min a 37 °C e o
teste realizado dentro das 8 horas seguintes.
Método
Procedimento
Cuvete
1 cm de trajecto óptico
Comprimento de onda: 405 nm
Temperatura de teste: +37 °C
Levar previamente o reagente Factor Xa e o reagente substrato, assim como os tubos ou
cuvetes de plástico, a 37 °C e o reagente AT III à temperatura ambiente (+15 a +25 °C).
Método cinético
Amostra 150 µl
Reagente AT III 150 µl
Reagente Factor Xa 500 µl
misturar e deixar incubar exactamente 1 min a +37 °C
Reagente substrato 100 µl
misturar e medir a ∆ E 405 nm
/min
Protocolo para o Chromotimer: para os mesmos tempos de incubação, usar a metade dos
volumes indicados.
Método de dois pontos (determinação semimicro)
Amostra
Branco
Ácido acético al 20% – 500 µl
Amostra 150 µl 150 µl
Reagente AT III 150 µl 150 µl
Reagente Factor Xa 500 µl 500 µl
misturar e deixar incubar exactamente durante 1 min a +37°C.
Reagente substrato 100 µl 100 µl
misturar imediatamente e após exactamente 1 min, adicionar:
Ácido acético a 20% 500 µl
misturar imediatamente e determinar a extinção dentro de 2 horas em confronto com
o branco.
Avaliação dos resultados
A avaliação faz-se com base numa curva de referência previamente estabelecida com o
preparado de heparina utilizado e segundo o mesmo método de análise. Diluir este a 10
UI/ml em solução salina isotónica (0,9%). Diluir então 100 µl desta diluição com 900 µl de
um plasma de pool isento de heparina ou de um plasma standard (por ex. o Plasma standard
humano), de modo a obter uma concentração de 1 UI/ml. As proporções de diluição para
a curva de referência (âmbito de 0 a 1 UI de heparina/ml) obtêm-se da seguinte tabela:
Concentração Plasma normal Plasma heparinizado
de heparina ou standard 1 UI/ml
UI/ml µl µl
1,05 1000 1000
0,75 1250 1750
0,55 1500 1500
0,25 1750 1250
0,15 1900 1100
0 15 1000 1000
Observações
1. A multiplicação ou divisão dos volumes por 2 não influi nos resultados.
2. Utilizar o plasma sem o diluir. Se os valores forem superiores ao âmbito de medição
calibrado, diluir as amostras com solução de AT III ou um plasma normal isento de
heparina (por ex. Plasma standard humano). Converter depois de modo correspondente
os resultados obtidos.
3. Se a concentração de heparina for muito fraca, pode aumentar-se a sensibilidade do
teste prolongado até 3 minutos o tempo de incubação. É então necessário determinar
os resultados com uma curva de referência estabelecida igualmente com 3 minutos de
incubação e diluições adicionais do standard.
4. Fornecem-se a pedido protocolos específicos para analisadores automáticos.
Controlo interno de qualidade
Para cada série de medições, incluir pelo menos 2 controlos com diferentes concentrações
de heparina. Se os valores esperados não forem encontrados, os resultados das amostras
de pacientes não podem ser utilizados.
Como controlo, pode utilizar-se:
um plasma normal isento de heparina (por ex. Plasma-controlo N), para o controlo da
estabilidade do reagente e do ponto zero da curva de referência;
um plasma normal (por ex. Plasma-controlo N) levado a uma concentração correspondente
(por ex. 0,5 UI/ml) ao preparado de heparina a medir, para o controlo da sensibilidade e da
reprodutibilidade.
Limitações e fontes de erro
Para se poder obter resultados reproduzíveis, é necessário respeitar exactamente os tempos
de incubação.
Características do teste
Sensibilidade
O limite de identificação para heparina não fraccionada é de 0,05 UI/ml.
Especificidade
A determinação de heparina com Berichrom Heparina não é perturbada pelo factor 4 das
plaquetas (PF4)
Precisão e reprodutibilidade
Para concentrações de heparina de 0,5 UI/ml, o coeficiente de variação varia entre 4,0 a
7,0% na série, e entre 6,9 e 7,1% no teste de dia a dia.
Comparação de métodos
Numa comparação de Berichrom Heparina com outro método cromogénico foram
encontrados coeficientes de correlação de 0,94 e 0,97%.
Bibliografia
1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin.
Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596
2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased
Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410
3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)
Fabricante: Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
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Distribuidor: Dade Behring Portugal
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Edição Agosto 2000
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