Antifungigrama: Detección e interpretación de resistencia

Antifungigrama: Detección n e
interpretación n de resistencia
T.M María Cristina Diaz J.
Profesor Asistente
Programa de Microbiologia y Micologia
ICBM, Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Porqué?
Cuándo?
Cómo?
Qué?

Tratamiento de infecciones fúngicas invasoras
Unicas opciones terapeúticas : Anfotericina B -
5 Fluorocitosina
Pruebas de susceptibilidad in vitro : no se
justificaba
Nuevos antifúngicos - nuevas formulaciones
NECESARIO
a) comparar actividad b) detectar resistencia
14
12
10
8
6
4
2
0
Antifúngicos :últimos 50 años
Griseofulvina
Nistatina
Anfotericina B (1958)
5-FC
L-AmB
ABCD
ABLC
Terbinafine
Itraconazol
Fluconazol
Ketoconazol
Miconazol
1950 1960 1970 1980 1990 2000
XMP
Sordarins
Anidulafungin
Caspofungin
Voricon
Posacon
Ravucon
Micafun

Pruebas de susceptibilidad “ in vitro”
Objetivo : Conocer si las levaduras y hongos
filamentosos son sensibles o resistentes a
los antifúngicos
Sensibilidad - Resistencia
Predecir la respuesta clínica
Determinación de la Concentración inhibitoria
mínima ( CIM ) permite identificar
Aislamientos Resistentes
Concepto Microbiológico-
Concepto Clínico

Concepto Microbiológico
300
número de aislamientos
200
100
0
0,03
0,06
0,12
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
CMIs de Fluconazol
Concepto Clínico de resistencia
Un hongo es resistente a un antifúngico
cuando continúa creciendo y
produciendo sintomatología a pesar de
que la concentración del antifúngico es
máxima en el lugar de la infección

Clasificación de la Resistencia
Resistencia intrínseca (insensibilidad)
cuando ningún miembro de una especie es
sensible a un antifúngico.
Ej C. krusei y fluconazol
Resistencia primaria
Un aislamiento de una especie normalmente sensible a
un antifúngico, adquiere resistencia natural al mismo.
NUNCA tuvo contacto previo con la misma ( mutaciones
espontáneas.
C. albicans y 5 FC
Candida glabrata ?

Resistencia secundaria
Cuando un aislamiento previamente sensible
adquiere resistencia al antifúngico después de
entrar en contacto con él.
Ej. C. albicans y 5FC; C. albicans y fluconazol
C albicans + SIDA
A. fumigatus + ITZ (profilaxis 2ria)
POLIENOS :Anfotericina B
Resistencia intrínseca
nseca
Scedosporium spp.
Trichosporon spp
Fusarium spp.
Aspergillus terreus
Hongos dematiáceos
Resistencia primaria
No existe en aquellas
especies que son
sensibles a este grupo
de antifúngicos

POLIENOS :Anfotericina B
Resistencia secundaria
• C. lusitaniae
• C. guilliermondii
• C. parapsilosis
• C. albicans
• C. tropicalis
• C. glabrata
• C. krusei
• C. rugosa
• C. neoformans
Pacientes con tratamientos prolongados con polienos o con pre exposición n a
los azoles .
Anfotericina B : Resistencia
¿?
La mayoría a de los hongos patógenos y
oportunistas son inhibidos in vitro
por concentraciones
≤ 1µg/ml o menos

Resistencia Anfotericina B:
Consideraciones
☹ Metodología para identificar cepas
resistentes aún está en discusión
☹ No existen puntos de corte
Se recomienda guardar los aislamientos previos al tratamiento con
Anfotericina B:
• Realizar sensibilidad para detectar una elevación de la CIM.
• Caracterización molecular
5-Fluorocitosina : Espectro de acción
Especies de:
• Candida
• Cryptococcus
• Hongos
dematiáceos
• Candida spp.
– CIMs 0,12- 2 µg/ml
• Candida krusei
– CIMs > 8 µg/ml
• Cryptococcus
neoformans
– CIMs 0,5 - 8 µg/ml

5- Fluorocitosina
Resistencia primaria
Candida , Cryptococcus
Aspergillus spp.
Hongos dimórficos
Resistencia secundaria
Muy frecuente en
monoterapia
Fácil desarrollo de resistencia secundaria
Resistencia CIM ≥ 32 µg/ml
Usar en combinación n con Anfotericina B
o
Azoles
Azoles : Espectro de acción
• Amplio espectro
Levaduras
Dermatofitos
Aspergillus
Otros hongos filamentosos
Resistencia intrínseca
Fluconazol no actúa frente
Candida krusei, Aspergillus, Sporothrix schenkii
Zygomycetes (Rhizopus)
Otros hongos filamentosos ( Fusarium )

Azoles : Resistencia primaria
El uso generalizado de algunos azoles, en
especial en forma oral o tópica, y la
existencia de resistencia cruzada en
este grupo hace prácticamente
imposible comprobar si la resistencia es
primaria o secundaria
Es importante la distinción entre
insensibilidad (resistencia intrínseca) y
resistencia primaria o secundaria
Azoles
Resistencia secundaria
Candida spp y Cryptococcus
Resistencia cruzada con otros azoles
ALILAMINAS
ALILAMINAS
POLIENOS
AZOLES AZOLES
E R G O S T E R O L
SIDA; Candidiasis vaginal recurrente, Neutropenia, Transplante

Equinocandinas
Caspofungina (Merk & Co, MK-0991)
Anidulafungina (Pfizer)
Micafungina
Candida spp. : cepas sensibles y resistentes a los
polienos y azoles
Aspergillus spp. in vivo. Difícil de evaluar in vitro
Pneumocystis jirovecii
H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis
Ausencia de actividad frente a Basidiomicetos, C.
neoformans, Fusarium spp., Mucorales.
Detección de la Resistencia
CLSI
•M27-A2:
•M38-A:
EUCAST:
Levaduras
Macro y microdilución
Hongos filamentosos
Microdilución
Levaduras fermentadoras
Microdilución
C
I
M
E-TEST
Difusión
TABLETAS: Neo Sensitabs- Rosco
DISCOS DE PAPEL: M44-A- CLSI
SISTEMAS COMERCIALES
A
G
A
R

Valores de corte y Criterios de sensibilidadresistencia
de las levaduras
• Sólo determinados para Candidiasis orofaringeas en
pacientes con SIDA. ------ FCZ,ITZ,5 FC
Candidemia : FCZ
• Medio de cultivo
• pH
Variables a considerar
• Buffer o tampón
• Inóculo
• Tiempo y temperatura de incubación
CLSI, M27-A2. 2002
Método de Referencia para levaduras
Especies de Candida y Cryptococcus neoformans
• Método:
– Macrodilución
– Microdilución ( fondo redondo )
• Antifúngicos :
A ntifún gico In tervalo (ug/m l)
A nfotericina B 16-0,0313
Flu orocitosina 64-0,125
K etoconazol 16-0,0313
Flu conazol 64-0,125
Itraconazol 16-0,0313
V oriconazol 16-0,0313
R avucon azol 16-0,0313
Posacon azol 16-0,0313
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BCDEFGH
16 8 4 2 1 0,50,250,12 0,060,03 CCCE

Medio: RPMI 1640 con glutamina ,sin bicarbonato pH 7.0
Inóculo: 0.5 Mc Farland ( 1x 10 6 -5x 10 6
UFC/ml)
Dilución 1:1000 RPMI ( 1x 10 3 -5x 10 3
Concentración final 0,5-2,5 x 10 3 UFC/ml
Incubación: 35º C durante 48 y 72 h
8.- Cepas de control de calidad
Candida krusei ATCC 6258
Candida parapsilosis ATCC 22019
7.- Lectura de resultados
a) Lectura visual : CIM : concentración más baja de
antifúngico que inhibe sustancialmente el crecimiento de
la levadura
Azoles y 5 FC : > 50 % inhibición
Anfotericina B : 100 % inhibición
O = ópticamente claro
1 = ligeramente turbio
2 = disminución prominente de la turbidez
3 = ligera disminución de la turbidez
4 = sin disminución de la turbidez

) Lectura espectrofotométrica
Longitud de onda ( 405, 490 y 530nm)
ATFs fungistáticos : < 50% del pocillo control de crecimiento
ATFs fungicidas : < 5% del control .
Obsevaciones
• Candida albicans y Candida tropicalis
Lectura de las CIM en los azoles : fuente de variabilidad
Se mantiene un cierto crecimiento en concentraciones superiores a la
CIM -------------- Trailling effectt, cola de crecimiento , crecimiento
residual
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 CC CE

M27-A2: Puntos de corte
Sensible
S-DD
Interm.
Resistente
Fluconazol
≤ 8,0
16 – 32
------
≥ 64
Itraconazol
≤ 0,125
0,25 – 0,5
------
≥ 1,0
Flucitosina
≤ 4,0
----------
8 - 16
≥ 32
Voriconazol
≤ 1
2
---------- ≥ 4
AMB y KTZ: Puntos de
corte
¿ ?
M27-A2 Interpretación de resultados
Categorias
Sensible - S
No lleva implícito el éxito terapeútico
Intermedio - I ( sólo aplicable a 5-FC )
Resistente - R
Se correlaciona con fracaso terapeútico
Sensible dosis dependiente - S-DD
FCZ : se basa en niveles del antifúngico que se alcanzan con dosis
> 400 mg/ dia en pacientes con buen funcionamiento renal .
ITZ : niveles en sangre > 0.5 ug/ml

Limitaciones
M 27-A2 : No es un método adecuado para
detectar resistencia a Anfotericina B
Medio de cultivo RPMI 1640 presenta problemas
para el crecimiento de Cryptococcus neoformans .
Medio propuesto : AM3 - Yeast nitrogen base
EUCAST Definitive E. Def.7.1 : method for the determination of broth
dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts . Subcommittee
of Susceptibility Testing ( AFST )of the ESCMID (European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing)
• Metodología: microdilución
• Placas fondo plano
• Medio: RPMI 1640 - 2% glucosa
EUCAST
• Inóculo: 0,5-2,5 X 10 5 UFC/ml
• Incubación: 35ºC ; 24hrs (Candida spp)
Reincubar 24 hrs más si la absorbancia es < 0.2 , indica escaso
crecimiento ( C. parapsilosis, C. guilliermomdii )

EUCAST
Levaduras fermentadoras de la glucosa
Determinación CIM: espectrofotométrico (lectura en
espectrofotómetro λ= 530 nm, D.O (turbidez)
Lectura
Anfotericina : inhibición de > 90%
Flucitosina, azoles y equinocandinas : > 50%
Control de calidad:
C. krusei ATCC 6258
C. parapsilosis ATCC 22019
Puntos de corte
EUCAST Clinical MIC Breakpoints for Fluconazole ,
17 April 2007
S R
C. albicans 2 4
C.tropicalis 2 4
C.parapsilosis 2 4
C. glabrata IE
C. krusei- -
No especies 2 4
EUCAST Technical Note on Fluconazole
Clin Microbiol Infect 2008; 14: 193 - 195

EUCAST: elección de la CIM
Visual vs. espectrofotométrica
VENTAJAS
•El agregado de glucosa y
el aumento del inóculo
acortan el tiempo de
lectura de la CIM a 24
horas
•Lectura final OBJETIVA
(CIM 50%)
•Lectura final
AUTOMATIZADA.
NCCLS vs EUCAST
NCCLS ( CLSI )
EUCAST
Temperatura
Tiempo
Incubación
35ºC
48h
35ºC
24 h
Inóculo
Medio
Lectura
Criterio de
lectura
Hongo
0,5-2,5 X 10 3 UFC/ml
RPMI 1640
Visual
Inhibición total (AMB)
Inhibición prominente( 50%)
(azoles)
Candida spp, C. neoformans y
6 géneros de mohos
0,5-2,5 X 10 5 UFC/ml
RPMI 1640 (2% glucosa)
Espectrofométrico
90% inhibición (AMB)
50% inhibición (azoles)
Candida
Chryssanthou & Cuenca-Estrella JCM 40:3841, 2002

M 38-A -Método de microdilución para
hongos miceliales- CLSI
• Especies del género Aspergillus, Fusarium, Rhizopus ,
Pseudoallescheria boydii , Sporotrix schenckii
• Método: microdilución
• Medio: RPMI 1640 +2% glucosa
• Inóculo: 0,4 x 10 4 - 5 x 10 4 ufc/ml
Preparación del inóculo : Aspergillus, Rhizopus , Pseudoallescheria boydii , Sporotrix
schenckii : Cultivo 7 dias a 35°C en agar papa dextrosa .
Fusarium : Cultivo en agar papa dextrosa 48 - 72 hrs a 35°C y luego a 25-28°C hasta
los 7 dias .
Incubación: 35ºC; 24, 48 y 72 h
Determinación de la CIM: visual
CIM: la menor concentración sin crecimiento
Anfotericina B
Itraconazol y voriconazol
Equinocandinas
Control de calidad:
Aspergillus flavus ATCC 204304
Aspergillus fumigatus ATCC 204305
Candida parapsilosis ATCC 22019
Candida krusei ATCC 6258

EUCAST Discusion document : Method for the
determination of broth dilution minimum inhibitory
concentrations of antifungal agents for conidia
forming moulds.
Método: Microdilución fondo plano
Medio: RPMI 1640 2% Glucosa
Inóculo: 1 -2,5 x 10 5 UFC/ml
Preparación del inóculo :
Subcultivos a 35°C en agar papa dextrosa
( 2- 5 dias ). Cubrir con 5 ml agua estéril + Tween 20 .
Recuento en hemocitómetro de hifas y conidios .
Incubación: 35º-37ºC; 24 y 48 h
Control de calidad:
C. krusei ATCC 6258
C. parapsilosis ATCC 22019
Lectura de los resultados : visual
Para todos los antifúngicos : CIM
Concentración más baja en la que se observa una
inhibición total del crecimiento de la cepa .

Equinocandinas : se puede utilizar la CME ( concentración mínima
efectiva ) : concentración en que se empiezan a ver alteraciones
microscópicas y/o macroscópicas de la cepa .
Esta modificación no ha sido estandarizada.
No existen puntos de corte por ninguno de los 2 métodos .
M 38-A: Puntos de corte Hongos filamentosos
No existen puntos de corte para interpretar las pruebas de
sensibilidad.
Anfotericina B :Cepas de Aspergillus spp y Rhizopus se
comportan como resistentes en modelos animales , con una
CIM de > 2 mg/l . A. terreus : CIMs más altas.
Itraconazol :se han comunicado fallos terapeúticos con ITZ en
infecciones producidas por cepas de Aspergillus con CIM de >
8 mg/l .
Voriconazol : algunos aislamientos con CIM altas a ITZ y
mutaciones en el gen cyp51 A han elevado CIM a VCZ.
Posaconazol: idem VCZ
Caspofungina y Micafungina : no hay datos de correlación
entre CIM/ MEC.

Neosensitabs- Rosco
•Metodología: Difusión
•Medio: SHADOMY
•Inóculo: 5 x 10 5 UFC/ml
Candida : Mc Farland 0.5
diluído 1+1 con sol salina)
Cryptococcus : Mc Farland 1.0
Método de Siembra:
Inundación.
•Incubación: 35ºC ; 24 y 48 h
•Determinación del halo: Visual
AMB
FCZ
5FC
KZ
Criterios de Interpretación
Sensible Intermedio Resistente
5 FC >30 mm 23-29 mm < 22 mm
Azoles >20 mm 12-19mm < 11mm
AMB > 15 mm 10-14mm sin halo
Itraconazol > 15 mm 10-14mm sin halo
Nistatina > 15 mm 10-14mm sin halo
Griseo >10 mm - sin halo

M 44-A ( CLSI ) :Método de difusión en agar
Método sencillo y práctico , validado para Fluconazol
y Voriconazol - Candida spp
Medio de cultivo : Agar Mueller Hinton con
2% glucosa y 0.5 ug/mL de azul de metileno
mejora la lectura de las placas al aumentar
la nitidez de los halos de inhibición)
Discos Fluconazol 25µg
Voriconazol 1 µg
Posaconazol 25 ug
Inóculo
0.5 MacFarland en solución salina
(1 - 5 x 10 6 ufc/ml )
M 44-A ( CLSI ) :Método de
difusión en agar
Siembra : 3 direcciones en la placa , dejar secar 15 min .
Incubación : a 35°C , 24 hrs para Candida spp y
48 hrs para C. neoformans .
Si no hay crecimiento , incubar 24 hrs más
Lectura : medir los halos de inhibición de
crecimiento en mm .
Control de Calidad C.albicans ATCC 90028
C.parapsilosis ATCC 22019
C.tropicalis ATCC 750 y
C.krusei ATCC 6258

Criterios de interpretación
Control de Calidad
Otros métodos
• Dilución en agar : método fácil, económico y
rápido . Candida spp y Cryptococcus spp
Sólo aplicable a Fluconazol
- Placas con Yeast Morphology Agar (YMA) con
distintas concentraciones de FCZ (0.125 - 256
ug/ml)
- Placas con CHROMagar con distintas
concentraciones de FCZ (8 -16ug/ ml )

Otros Métodos alternativos
Sistemas comerciales
Métodos colorimétricos
Basados en el M 27-A, incorporan un indicador redox ( azul de
alamar ) en el medio de cultivo, cambia de color cuando existe
crecimiento ( azul a rosado).
Sensititre YeastOne
Trek Diagnostic Systems
Técnica reproducible, fácil de
realizar y puntos finales
claramente visibles con resultados
dentro de los rangos esperados.

Fungitest
Fundamento: Microdilución Colorimétrica
Cada placa tiene 2 concentraciones diferentes en pocillos
individuales.
Contiene un indicador redox para mejorar la lectura del punto final
Método no colorimétrico : ATB Fungus
( Bio-Mérieux)
Utiliza diluciones seriadas para ANB y
5-FC .
• 2 concentraciones críticas para el
resto . Galeria de 16 pocillos con los
antifúngicos deshidratados .
• Nistatina- ( 4-8) Miconazol -
Econazol - Ketoconazol-( 1-8)
Anfotericina : 4 concentraciones ( 1-2-
4 -8 )CIM
5-Fluorocitosina : 10 concentraciones (
0.25 - 128) CIM

ATB FUNGUS
Control de calidad : C albicans ATTC 90029
Lectura : Visual
Cúpulas Resultados Interpretación
c C c C
claro claro - - Sensible
turbio claro + - Intermedia
turbio turbio + + Resistente
Lectura : automatizada - sistema ATB
ATB FUNGUS 3
Control de calidad : C albicans ATTC 90029
Antifúngico c C
5 FC 4 16
AMB 0.5 4
AMB 1 8
AMB 2 16
FCA 1 16
FCA 2 32
FCA 4 64
FCA 8 128
ITR 0.125 1
ITR 0.25 2
ITR 0.5 4
VRC 0.06 1
VRC 0.125 2
VRC 0.25 4
VRC 0.5 8
Definición de CIM .............Valor
sin reducción de crecimiento .....4
leve reducción ......................... 3
reducción visible....................... 2
crecimiento muy débil............... 1
sin crecimiento .......................... 0

Métodos alternativos para hongos filamentosos
Sensititre yeast one : Aspergillus
Dilución en agar : AM # 3, RPMI , YNB
Difusión en discos : M 44- A
Anfotericina B , Caspofungina :
Aspergillus y otros hongos filamentosos
E-test : Aspergillus - Pseudoallescheria boydii, Scedosporium
Resistencia en Hongos filamentosos
A fumigatus Resistentes a Itraconazol
R. cruzada para otros azoles : Voriconazol , Ravuconazol,
Posaconazol.
Resistencia de Aspergillus a azoles: relacionada con el uso
masivo de antifúngicos en tratamientos empíricos y en
profilaxis .
Uso de FCZ podria incluir una regulación positiva en la
expresión de algunos genes y esto implicaria cambios en su
patrón de resistencia o tolerancia frente a antifúngicos
normalmente eficaces .
Esta hipótesis se ha demostrado in vitro con A. fumigatus

Procedimientos no aceptables
Modificaciones no validadas : cambios en inóculo,
medios de cultivos o lectura ---------- CIM .
No incluir cepas controles ............... Validación de los
resultados.
No deben aceptarse si las CIMs de las cepas control
no coinciden con los estandares.
No usar preparados comerciales de los antifúngicos
Control de calidad riguroso de los antifúngicos ,
lotes de medios de cultivo , otros reactivos y cepas
control.
Uso de técnica comercial seguir recomendaciones
del fabricante .

En resumen..........
Levaduras provenientes de hemocultivo: Sensibles a AMB y a FCZ
RECORDAR!!!!!
Fluconazol
Insensible:
•Candida krusei
Resistencia secundaria:
•C. glabrata
•C. guilliermondii
•C. albicans
•C. tropicalis
Itraconazol
¿Cepas intrínsecamente
nsecamente
resistentes?
RESISTENCIA CRUZADA
CON
FLUCONAZOL
Anfotericina B
Resistencia primaria y secundaria:
MUY BAJA
•C. lusitaniae, C. haemulonii y
Trichosporon spp.: CIM muy
elevadas
•C. tropicalis: fácil inducción
•C. parapsilosis: poco fungicida
Hongos miceliales...
RECORDAR!!!!!
Fluconazol
Escasa o nula actividad
frente a hongos
miceliales
Anfotericina B
Resistencia primaria y secundaria:
•Scedosporium apiospermun
•Scedosporium prolificans
•Fusarium spp.
•Hongos dematiáceos

Utilidad del Antifungigrama
RECORDAR !!!
•Cepas procedentes de pacientes con un fracaso
terapéutico.
•Pacientes que han recibido profilaxis antifúngica
previa
• Aislamientos de especies poco frecuentes , se
desconoce su patrón de sensibilidad.
• Elegir la mejor alternativa terapéutica
•Información para cambiar tratamiento.