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Roche Diagnostics informa / Junio 2001 Receptor soluble de la transferrina. Valoración del método totalmente automatizado. A. F. Remacha, M. P. Sardà. Servicio de Hematología. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona. Tina-quant ® a sTfR La investigación que se viene desarrollando en los últimos años sobre el metabolismo del hierro (Fe) hace que debamos revisar continuamente muchos de nuestros conocimientos acerca del mismo. En especial, el descubrimiento de nuevas proteínas implicadas, de sus mecanismos reguladores y de la relación entre Fe y respuesta inmunológica son aspectos a considerar (1,2). La patología del Fe es, sin duda alguna, la de mayor prevalencia en los seres humanos pues incluye la enfermedad adquirida más frecuente, la ferropenia y una de las anomalías hereditarias más frecuentes, la hemocromatosis hereditaria (3,4). Uno de los aspectos más estudiados en los últimos años ha sido el papel de la forma soluble del receptor de la transferrina (sTfR) en el estudio de las anomalías del metabolismo férrico (5). Sin embargo, la falta de una metodología que permitiese su determinación de una forma rápida, automatizada y fiable impedía que su estudio estuviese más extendido. La aparición de metodologías fiables automatizadas, sin duda, permitirá una mucho más rápida difusión de su uso clínico. En este trabajo primero se comentarán someramente los aspectos fisiológicos esenciales del metabolismo férrico en que participa esta proteína férrica con el fin de poder entender su utilidad clínica e interpretar adecuadamente los resultados del metabolismo férrico. Posteriormente se presentarán los datos obtenidos en la valoración clínica de una metodología totalmente automatizada para la investigación del sTfR en el suero. Aspectos de la fisiología del Fe relacionados con el sTfR. El Fe en el ser humano se encuentra en una concentración de 45 a 55 mg/kg de peso, el 60-70% en forma de Hb, el 10% en otras hemoproteínas (mioglobina, citocromos, etc.) y el resto (20-30%), en los depósitos unido a la ferritina (Ft). Sólo un 1,1 % (3 mg) del Fe se une a la transferrina (Tf), sin embargo, este pool dinámico es esencial (1,4). El Fe transportado por la Tf se une al sTfR de la superficie celular, todos (Fe, Tf y sTfR) juntos son internalizados formando una vesícula citoplasmática (el siderosoma). Los cambios de pH provocan la liberación del Fe y su posterior salida del siderosoma; una vez en el citoplasma celular el Fe se incorpora a las proteínas que usan este metal o bien a la ferritina (Ft), donde se almacena. Cada día hay una pequeña pérdida de Fe que debe ser compensada por la ingesta (1,4). La vía transferrina-receptor de la transferrina. La transferrina (Tf) circulante se encuentra saturada en un 30% por Fe, encontrándose en el plasma todas las posibilidades, desde la apoTf a la unida a dos átomos de Fe (4). El receptor de la Transferrina (sTfR) es una proteína de 95 Kd y 760 aminoácidos que se encuentra anclada en la superficie de la mayoría de las células, especialmente en los eritroblastos. Se encuentra formando homodímeros (180 kd) que se unen a la Tf (unión 2:2). La afinidad depende del número de átomos de Fe que transporta la Tf, siendo más afín por la que transporta dos Fe3+ y menos por la apo-Tf (1,2,6). El sTfR posee un dominio transmembrana de 5 kd (28 aminoácidos) que continua con un dominio intracitoplasmático C-terminal de 61 aminoácidos. El dominio extracelular posee 671 aminoácidos. Éste sufre una escisión enzimática y se libera al plasma. Esta forma proteica circulante de 80 Kd es la que podemos medir. El gen del sTfR está situado en el cromosoma 3, cercano al gen de la Tf, posee en la región terminal 3´elementos IRE (iron-responsive elements), sensibles a la concentración de Fe, que regulan la síntesis postranscripcional de esta proteína (1,4,6). La proteína de almacenamiento del Fe: la ferritina (Ft). La Ft que se observa en los tejidos es un multímero de 450 Kd capaz de almacenar hasta 4000 moléculas de Fe3+ y está formada por 24 monómeros (subunidades). El multímero de Ft lo forman la Ft H o cadena pesada, de ella depende la actividad ferrioxidasa, y la Ft L o cadena ligera, en la que se halla la función de almacenamiento del Fe. Ambas son esenciales para formar la molécula de Ft (6). Los genes de ambas isoformas Ft son similares y poseen una única región proximal IRE en posición 5´, que es regulada por los cambios del Fe al igual que el sTfR y otras proteínas (6,7). Las nuevas moléculas del metabolismo férrico. La proteína HFE es la proteína cuya mutación causa la hemocromatosis hereditaria (7,8). El HFE, una proteína HLAlike, se une al STFR (9) provocando la disminución de la afinidad del STFR por la Tf-Fe3+, con ello se atenúa la absorción de Fe a nivel intestinal. El Nramp2 (natural resistence-associated macrophage protein-2) pertenece a una familia de proteínas especializadas en el transporte de metales bivalentes. El Nramp2 se encarga del transporte del Fe desde la luz intestinal al interior del enterocito en el ápex de las vellosidades intestinales. En el eritroblasto, el Nramp2 extrae el Fe de los siderosomas hacia el citoplasma (10). El receptor de la transferrina tipo 2 (TFR2) es una de las últimas proteínas incorporadas. Se localiza en 7q22 y posee un 66% de homología con el TfR pero carece de regiones IRE, por lo que no es regulado por el Fe intracelular. También es capaz de unir Tf, pero con menor afinidad que el TfR. Su función en el metabolismo férrico es poco conocida, aunque Figura 1. Regulación de las proteínas férricas. puede ser importante, pues su falta provoca una forma de hemocromatosis. Se expresa sobre todo en los eritroblastos y en el hígado (11). Existen otras proteínas implicadas en el metabolismo férrico, cuya revisión no será contemplada en este trabajo (1,3,4). Regulación de las proteínas relacionadas con el Fe. Se realiza a nivel de la traducción (paso de mRNA a proteína) mediante los elementos sensibles al Fe (IRE, iron-responsive elements) y, por lo tanto, depende directamente del contenido de Fe intracelular (figura 1). 14 El inhibidor del factor tisular y su repercusión en la hemostasia 15
Roche Diagnostics informa / Junio 2001 La secuencias IRE se sitúan en la regiones no traducidas (UTR) 5´ó 3´. Tanto en la Ft H como en la Ft L existe una región IRE en situación 5´UTR. En el STFR, el Nramp2 y otras proteínas se han encontrado 5 regiones UTR en posición 3´. La falta de Fe intracelular provoca que unas proteínas intracelulares, las proteínas que se unen al de Fe (IBP, iron-binding proteins)., se unan a las regiones IRE. En el caso de su unión a una región IRE situada en posición 5´ se impide la progresión de la traducción del mRNA a proteína (por eso la Ft disminuye en la ferropenia). En cambio con la unión de las IBP a regiones IRE situadas en 3´ se evita la degradación del mRNA y aumenta la producción de proteína (por ello en la ferropenia se eleva el sTfR) (1,3,12). Existen otras vías de regulación, mediada por las citoquinas que están a su vez implicadas en la respuesta de fase aguda. Estas citoquinas modulan por una vía independiente del Fe la producción de Ft, lo que provoca un incremento de la síntesis de Ft en caso de inflamación (6,12). La forma soluble del sTfR. Como se ha explicado anteriormente, se produce por escisión del receptor celular (CD71) (13). Esta forma circulante, cuya función fisiológica específica es desconocida, se puede medir mediante diferentes métodos inmunoquímicos (5). Su estudio ha demostrado ser útil para valorar el metabolismo férrico y la masa eritroblástica de la médula ósea, ya que la mayoría del sTfR se encuentra en la superficie de esas células. Estas dos circunstancias marcan sus ventajas e inconvenientes (tabla I). Tabla I. Diferencias entre el receptor de la transferrina y la ferritina. Mecanismos de regulación. Papel en el metabolismo férrico Utilidad clínica. sTfR Valoración clínica del sTfR sérica. Ferritina. Secuencias IRE en 5´ • Secuencias IRE en 3´. • Secuencias de respuesta a citoquinas inflamatorias. Captación del complejo transferrina-hierro, regulado por la proteína HFE. • Estudio de la ferropenia en presencia de rasgos inflamatorios. • Valoración cuantitativa de la eritropoyesis medular. • Almacenamiento y liberación del Fe. • Dos isoformas Ft H y L. Estudio de los depósitos férricos. • Estado ferrodeficitario. • Atesoramiento férrico. El sTfR se eleva en caso de ferropenia, cuando existe una hiperplasia eritroblástica (anemias hemolíticas) o en caso de determinadas proliferaciones celulares (leucemia linfática crónica). En cambio, disminuye cuando existe una hipoplasia eritroide (eritroblastopenia, anemia aplásica) o el en caso de infiltraciones que desplazan la serie eritroblástica (leucemias agudas) (14-16). Teniendo en cuanta estos aspectos, el sTfR debe valorarse en los dos contextos anteriores y siempre de forma concomitante con otras pruebas, dando lugar a unos patrones de gran valor etiopatogénico (14). a) Con relación al metabolismo férrico, el sTfR debe estudiarse junto a otros parámetros (tabla II). Sin embargo, donde tiene Tabla II. Diagnóstico diferencial de las anemias microcíticas. Hb, hemoglobina; VCM, volumen corpuscular medio; IND. Índice; SID/CAP/SAT, sideremia/capacidad total de transporte de hierro/índice de saturación; Ft/sTfR, ferritina sérica/receptor de la transferrina; D, disminuido; N. Normal; A, alto. Hb VCM Indices SID/CAP/SAT Ft sTfR Estudio de hemoglobinas Anemia ferropénica D D Positivo D/A/D D A N Talasemia minor N-D D Negativo N/N/N N-A N-A Alteradas Anemia inflamatoria D N Positivo D/D/N-D A N N gran interés es en el diagnóstico diferencial entre anemia ferropénica y anemia de tipo crónico o inflamatorio. En la anemia ferropénica sin rasgos inflamatorios la ferritina sérica disminuye y el sTfR aumenta. En la anemia inflamatoria la Ft aumenta por un mecanismo dependiente de citoquinas; por el contrario, el sTfR varía sólo como reflejo de la masa eritroblástica. El problema surge cuando existe una anemia ferropénica con rasgos inflamatorios, donde típicamente se encuentra una Ft con valores intermedios. Este problema se ha intentado solventar estableciendo diferentes dinteles de Ft en caso de inflamación. El sTfR no se verá apenas afectado por los rasgos inflamatorios y por lo tanto sólo se elevará en caso de ferropenia (5,15,16). Varios autores han demostrado que para una correcta valoración del sTfR es necesario establecer el valor diagnóstico del mismo (14-16). Esto se ha hecho mediante curvas ROC o estudios de regresión, así se puede calcular la sensibilidad y especificidad para cada concentración de sTfR. Estos estudios se basan en la comparación de los valores de sTfR en casos con anemia ferropénica y anemia inflamatoria. Si se utiliza el cociente sTfR /Ft todavía mejora su poder diagnóstico; sin embargo, el cálculo de este índice es más engorroso. b) El sTfR en el estudio de la masa eritroblástica medular. Su utilidad en este campo ha sido mucho menos estudiada. Para la correcta valoración del sTfR y la identificación de diferentes patrones eritropoyéticos debe estudiarse junto con el hemograma, los reticulocitos y sus fracciones de maduración y con la eritropoyetina sérica. Así se han identificado varios patrones eritropoyéticos (tabla III)(14). Tabla III. Diferentes patrones de eritropoyesis. Epo: eritropoyetina. Ratio O/P, razón entre los valores observados y los previstos para el grado de anemia (se obtienen por regresión). IM, índice de maduración (cociente entre reticulocitos de baja fluorescencia y de la suma de los de intermedia y alta). N, normal. D, disminuido. A, elevado. Normal Proliferativo • Hemólisis • Eritropoyesis ineficaz Hipoproliferativo Déficit de EPO Hb N D D D D Valoración del sTfR mediante una metodología automatizada. Se comparó el método Tina-quant® - Receptor soluble de la transferrina (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) que se efectúa en un Hitachi 911 con un método de ELISA (IDEA sTfR IEMA. Orion Diagnostics, Espoo, Finlandia). El método automatizado efectúa la determinación directamente en tubo primario, sin precisar ninguna manipulación previa de la muestra, excepto la centrifugación. Además, las curvas de calibración pueden utilizarse durante varias semanas, obteniéndose los primeros resultados aproximadamente a los 10 minutos de colocada la muestra. En la comparación de ambas metodologías se utilizó un estudio de regresión lineal simple y el método no paramétrico de Passing-Bablok (17). En segundo lugar se estableció el intervalo de referencia del sTfR en un grupo de personas con hemograma y metabolismo férrico dentro de los límites de referencia. Por último, como parte de un estudio clínico, se compararon los valores de sTfR sérico en un grupo de personas con anemia ferropénica sin rasgos inflamatorios (Hb< 120 g/l, Fe < 9 mol/l, capacidad total de transporte de hierro > 69 mol/l, ferritina sérica < 15 mg/l y VSG< 20 mm) con otro que presentaba anemias inflamatorias (Hb< 120 g/l, Fe < 9 mol/l, capacidad total de transporte de hierro < 40 mol/l, ferritina sérica > 100 g/l y VSG> 50 mm). Ambos grupos presentaban unos niveles de Hb similares. construyeron curvas ROC y se realizó un análisis de regresión logística (Y=1, presencia de anemia ferropénica, Y=0 presencia de anemia inflamatoria). El punto de corte se calculó mediante la regresión logística en el punto en el cual Y= 0,5. Por último se determinaron los niveles de sTfR en un grupo de pacientes con diferentes hemopatías, incluyendo leucemias agudas, síndromes mielodisplásicos, aplasias medulares, anemias hemolíticas, etc. Resultados y discusión. sTfR Ratio O/P Comparación de metodologías. Se contrastaron los N N N D D EPO Ratio O/P N N N N-A D Reticulocitos absolutos/IM N/N A/A N-D/A D/D D/N resultados obtenidos en 69 muestras con diferentes etiologías y valores, que abarcaban un amplio espectro desde valores bajos hasta valores elevados. Los valores obtenidos con Tina-quant® fueron 7,058,1 mg/l (máximo 44,7 y mínimo 1,1 mg/l) y con IDEA 5,26,5 mg/l (máximo 35 y mínimo 0,2 mg/l). Al comparar los valores obtenidos con ambas metodologías se observaron diferencias significativas (t de Student para muestras apareadas; diferencia = 1,81 mg/l, intervalo de confianza del 95 % = 1,23 - 2,39 mg/l, p= 3.3 x 10-8). Sin embargo, existía una correlación entre ambas metodologías r = 0,97 (p=6,7 x 10-18) (figura2). Mediante un estudio de regresión de Passing-Bablok se observaron diferencias significativas en la pendiente y el punto de corte en el eje de ordenadas IDEA = 0,874 (95% IC = 0,794-0,960) Tina-quant® , - 0,732 (IC 95% = -1,069, -0,425). Figura 2. Comparación entre dos métodos para medir sTfR. Estos estudios demuestran que los valores obtenidos con Tinaquant® son superiores a los obtenidos con IDEA, por lo tanto se procedió a calcular el intervalo de referencia en una población sana y después a demostrar su valor clínico en diferentes tipos de anemias y otras patologías. Población de referencia. Se obtuvieron los valores de sTfR en 121 personas sanas (55 hombres y 66 mujeres), el sTfR era de Tabla IV. Características de los pacientes con anemia ferropénica o inflamatoria. VSG: velocidad de sedimentación globular. Valores como media y desviación estándar. N Hb g/l VCM fl Ferritina sérica µg/l STfR mg/l VSG mm Anemia ferropénica 47 94 ± 15 72 ± 8 4 ± 3 11,3 ± 5,8 17 ± 5 Anemia inflamatoria 71 94 ± 12 88 ± 5 434 ± 424 3,2 ± 1, 6 92 ± 25 Grupo de referencia 121 142 ± 10 89 ± 4 74 ± 56 3,07 ± 0,7 10 ± 5 Anemia mixta 19 90 ± 27 77 ± 5 169 ± 254 8,2 ± 4 72 ± 38 16 Tina-quant ® a sTfR. Receptor soluble de la transferrina. Valoración del método totalmente automatizado. 17
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