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<strong>Roche</strong> <strong>Diagnostics</strong> informa / Junio 2001 muestras. En referencia a las muestras, es posible cargar simultáneamente hasta un máximo de 72. Al tener un diseño que permite la carga continua, según finalizan las extracciones de cada 24 muestras, queda liberada la bandeja correspondiente, pudiendo ser extraída, introduciendo a continuación una nueva bandeja. Las cubetas de reacción se cargan en el instrumento en bandejas de 24 unidades con una capacidad máxima de 3 bandejas. Al igual que ocurre con las aquellas que contienen las muestras, según van siendo utilizadas pueden extraerse y sustituirse por otras nuevas. Cada cubeta de reacción incluye una punta de pipeta con filtro, de forma que cada muestra se procesa con su propia punta, lo que evita que se produzca cualquier tipo de arrastre en el pipeteo de las diferentes muestras. La punta de pipeta con filtro se desecha junto con cada cubeta de reacción. Los tubos con tapón de rosca, donde se incorpora el ácido nucleico extraído se cargan en bandejas con 36 tubos y con un máximo de 144 tubos simultáneamente. Como todas las bandejas, según finaliza su uso es posible retirarlas y sustituirlas por otras nuevas. Una vez cargadas todas las bandejas necesarias y puesto en marcha el Cobas AmpliPrep, la primera extracción se realiza en algo menos de una hora, obteniéndose sucesivas extracciones cada 2 minutos. En definitiva, la extracción de 24 muestras se realiza en unas dos horas y la de 48, en tres. En una rutina de trabajo diaria se pueden realizar 144 extracciones en un turno de trabajo. No obstante, toda esta capacidad de trabajo automático no tendría utilidad si no estuviera garantizada la prevención de la contaminación del trabajo de extracción de los ácidos nucleicos, riesgo que se incrementa en las técnicas de amplificación de los mismos. Esta prevención está garantizada gracias a cuatro características del CAP: - utilización de una punta de pipeta con filtro para cada muestra. - mantenimiento de un flujo de aire ascendente mediante ventiladores dotados de filtros HEPA. Este flujo continuo de aire logra que los aerosoles que se llegan a producir sean extraídos por la parte superior del instrumento y nunca puedan contaminar las muestras a extraer. - utilización de lamparas de luz ultravioleta, colocadas en el interior del CAP. La luz ultravioleta permite la destrucción de cualquier fragmento de ácido nucleico que permanezca en el interior del instrumento. - uso de tubos con tapón de rosca para la muestra a extraer y para el ácido nucleico extraído. Tubo que destapa el instrumento en el momento del pipeteo y que permanece cerrado el resto del tiempo. Otro aspecto crítico en el trabajo de rutina diaria en los laboratorios de análisis clínicos es el creciente numero de muestras que se procesan día a día. Toda medida que contribuya a evitar este tipo de errores es un factor de seguridad en la emisión del resultado final de la prueba analítica. El CAP contribuye a esta seguridad, colocando el tubo final con el ácido nucleico extraído en la misma posición de la misma bandeja de muestras donde se introdujo la muestra a extraer. De esta manera, queda identificado con el mismo código de barras, por lo que la posibilidad de error en la identificación del tubo de extracción es prácticamente nula. En continua evolución La propuesta actual de trabajo diario con los sistemas Cobas AmpliPrep y Cobas Amplicor aporta la automatización de los tres pasos que constituyen los análisis mediante PCR en el laboratorio de diagnóstico clínico. La reducción que supone en el tiempo de manipulación de las muestras, pasando desde las 6 horas iniciales a solamente 1 hora y media, implica la liberación del usuario para la realización de otras pruebas de biología molecular no automatizadas, especialmente útil a la hora de realizar la introducción de nuevos parámetros que, debido al reducido número de muestras a procesar, no justifican su automatización. La utilización de instrumentos automáticos para todo el proceso de PCR conduce a la simplificación de las instalaciones necesarias en los laboratorios de biología molecular. De las iniciales tres habitaciones necesarias se pasó a dos, seguidamente a dos áreas de trabajo y, finalmente, la total automatización lleva a una única instalación convencional, semejante a la necesaria para un laboratorio de serología o de química clínica. Evidentemente, la evolución lógica de la automatización conducirá a la integración de los tres pasos de un análisis mediante PCR (extracción de la muestra, amplificación y detección) en un único instrumento que permitirá la realización de todo el proceso con la única intervención del usuario para la colocación de los reactivos, las muestras y la programación de la lista de trabajo. La siguiente acción del usuario será la validación de los resultados obtenidos. La evolución de la PCR en el laboratorio de diagnóstico continuará con la reducción del tiempo total de realización del análisis, efectuando una lectura después de cada ciclo de amplificación. Es la llamada PCR a tiempo real o PCR cinética (técnica TaqMan®) Desde este punto de vista, la simplificación de los análisis de PCR parece situar la tecnología TaqMan® como la evolución lógica de estas técnicas en el laboratorio de diagnóstico clínico. Bibliografía 1) Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn G, Erlich H et al. Enzymatic amplification of µ-globin genomic sequences and restriction site analysis of sickle cell anemia. Science 1985; 239: 1350-1354. 2) Mullis KB, Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasa-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987; 155: 335-350. 3) Lassner D, Pustowoit B, Rolfs A. Modern applications of DNA amplification techniques: problems and new tools. Plenum Pub Corp, 1997 4) DiDomenico N, Link H, Knobel R, Caratsch T, Weschler W, Loewy ZG et al. COBAS AMPLICOR: fully automated RNA and DNA amplification and detection system for routine diagnostic PCR. Clin Chem 1996; 42: 1915-1923. 5) Jungkind D, Direnzo S, Beavis KG, Silverman NS. Evaluation of automated COBAS AMPLICOR PCR system for detection of several infectious agents and its impact on laboratory management. J Clin Microbiol 1996; 34: 2778-2783. 6) Young FE. DNA probes: fruits of the new biotechnology. JAMA 1987; 229: 2404-2406. 7) Miyachi H, Masukawa A, Ohsima T, Hirose T, Impraim C, Ando Y. Automated specific capture of hepatitis C virus RNA with probes and paramagnetic particle separation. J Clin Microbiol 2000; 38: 18-21. 30 El diagnóstico molecular en continua evolución 31
Comprometidos con la solución Objetivos de la calidad La gestión planificada de toda actividad profesional requiere definir unos objetivos de actuación. Estos objetivos se suelen expresar en términos descriptivos, plasmando de forma escrita los deseos que se pretenden alcanzar. En el campo del laboratorio clínico y, concretamente, con relación a la actividad analítica del mismo, el objetivo fundamental a conseguir debería ser el satisfacer los requisitos del médico clínico, en su papel de interpretador del informe producido por el laboratorio. En la Conferencia internacional de consenso sobre estrategias para establecer especificaciones globales de la calidad analítica en el laboratorio clínico, se debatieron diversas alternativas en las que se consideraron, además de factores metrológicos, factores pre y posanalíticos que influyen en la calidad analítica (1). Se aceptó utilizar un modelo jerárquico que ordena los objetivos en relación inversa a la aplicación clínica de los datos del laboratorio (Tabla I). Tabla I: Listado jerárquico de prácticas para determinar las especificaciones de la calidad analítica, basadas en la satisfacción de las necesidades médicas. 1. Efecto de las prestaciones analíticas en la toma de decisiones clínicas específicas: estudio de los resultados clínicos C. Ricós. Laboratoris Clínics Vall d’Hebron, Barcelona. 2. Efecto de las prestaciones analíticas en la toma de decisiones clínicas 2.1 Decisiones clínicas generales: variación biológica • Aproximación de Gowans para el error sistemático (5) • Aproximación de Cotlove para la imprecisión (4) 2.2 Encuesta de opinión a clínicos 3. Recomendaciones de grupos profesionales 4. Especificaciones de la calidad basadas en evaluación externa de la calidad (también denominadas pruebas de aptitud) Soluciones personalizadas para la organización del laboratorio clínico. Servicio integral de asesoría, implantación y procesos de mejora continuada. 4.1 Establecidas por ley (CLIA en USA) (20) 4.2 Establecidas sobre la base de límites fijos o según el “estado del arte” 5. Evaluación externa de la calidad 6. Publicaciones Para cumplir los objetivos propuestos, se deben transformar éstos en especificaciones concretas para diversos indicadores de la prestación del laboratorio clínico. Los indicadores analíticos más frecuentemente utilizados son: la imprecisión, el error 33
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