Roche Diagnostics - Roche España
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<strong>Roche</strong> <strong>Diagnostics</strong> informa / Junio 2001<br />
análisis mediante PCR en el laboratorio de diagnóstico no supone<br />
únicamente la realización del proceso de amplificación, sino que<br />
debemos realizar la preparación de la muestra, la amplificación<br />
y la detección de las secuencias amplificadas. Estos tres procesos<br />
van encadenados y, por lo tanto, es necesario que los tres se<br />
realicen correctamente para que, al final del análisis, obtengamos<br />
un resultado correcto. De nada nos servirá un proceso de<br />
amplificación optimizado si no va acompañado de un proceso<br />
de detección que aporte una sensibilidad adecuada. Lo mismo<br />
podremos decir de la utilización de un procedimiento de<br />
preparación de la muestra que aporte un alto índice de<br />
recuperación de las moléculas del ácido nucleico buscado como<br />
condición imprescindible para que el resto de procesos implicados<br />
en la PCR transcurran satisfactoriamente (3).<br />
Con este objetivo, en 1992, <strong>Roche</strong> Molecular Systems (RMS)<br />
comenzó a comercializar reactivos para la realización de los<br />
análisis mediante PCR en el diagnóstico de rutina. Los equipos<br />
de reactivos Amplicor® incluyen todos los componentes necesarios<br />
para la realización de los tres procesos de la técnica, ya que<br />
se demostró que aspectos como el pH de los tampones o el<br />
formato de los diferentes viales repercutían en la calidad final de<br />
los resultados.<br />
El primer paso de la automatización de la PCR fue el diseño de<br />
termocicladores que permitieron la realización de todos los ciclos<br />
en un único bloque térmico, sin tener que mover los tubos de<br />
amplificación entre diferentes incubadores. Pero al introducirse<br />
en la rutina diaria las necesidades de automatización aumentaron,<br />
por lo que en 1995 RMS puso a disposición de los laboratorios<br />
el analizador Cobas Amplicor®. Este sistema permitió la<br />
automatización de los procesos de amplificación y detección, con<br />
lo que se logró un incremento en la precisión y exactitud de los<br />
resultados. Asimismo, la automatización con el Cobas Amplicor<br />
aportó una sustancial mejora en cuanto a la necesidad de<br />
intervención manual que la PCR tenía hasta ese momento, ya<br />
que permitió que la amplificación y la detección sólo necesitasen<br />
la presencia del operador durante 40 minutos, frente a las 2 horas<br />
y 40 minutos en los procedimientos no automatizados (4, 5).<br />
El siguiente paso ha sido encontrar la solución para la preparación<br />
de la muestra. Este primer proceso de la PCR tiene básicamente<br />
dos objetivos: extraer el ácido nucleico y purificarlo, aislándolo<br />
de las proteínas y los iones metálicos. Ahora bien, si de lo que<br />
tratamos es de automatizarlo, deberemos añadir otros objetivos<br />
como la flexibilidad, la capacidad de trabajar con diferentes<br />
pruebas simultáneamente, la posibilidad de añadir nuevas muestras<br />
de manera continuada o la reducción del tiempo de intervención<br />
manual.<br />
La solución aportada al respecto por RMS en el año 2000 es el<br />
sistema Cobas AmpliPrep® (CAP). Este instrumento permite<br />
realizar la extracción del ácido nucleico a partir de la muestra de<br />
una forma específica, de modo que el operador sólo tiene que<br />
cargar las muestras, los reactivos, programar la lista de trabajo y<br />
dar la orden de comienzo. A partir de este momento el usuario<br />
queda liberado de cualquier tarea relacionada con la extracción<br />
y sólo deberá intervenir cuando ésta haya finalizado.<br />
Figura 1. Mezcla de reacción. (QS: Estándar de cuantificación).<br />
Cubeta de reacción a 60 ºC<br />
HCV<br />
Muestra + QS<br />
Sonda HCV<br />
Lisis<br />
Cubeta de reacción<br />
a 37ºC<br />
Estreptavidina<br />
captura la sonda<br />
Micropartícula<br />
magnética<br />
Técnica utilizada en la extracción<br />
El CAP utiliza un tubo de muestra de 2 mL que debe contener<br />
entre 250 µL y 1.100 µL de suero o plasma. Esta muestra la<br />
dispensa en la cubeta de reacción junto con el estándar de<br />
cuantificación (QS), el tampón de lisis y la sonda de captura<br />
específica para cada ácido nucleico a extraer. Esta mezcla de<br />
reacción se incuba a 60 ºC durante 15 minutos. A lo largo de<br />
este tiempo se produce la lisis de la cápside viral y por lo tanto<br />
la liberación del ácido nucleico del virus (figura 1).<br />
A continuación, el brazo de transferencia del CAP coloca la<br />
cubeta de reacción en el incubador a 37 ºC. El descenso de<br />
temperatura induce la hibridación entre el ácido nucleico liberado<br />
y la sonda específica de captura, biotilinada. Esta sonda está<br />
diseñada con la misma secuencia que uno de los cebadores, que<br />
se encargará de realizar la amplificación del fragmento del ácido<br />
nucleico, con lo que se garantiza que solamente el ácido nucleico<br />
buscado sea pipeteado posteriormente en el tubo de amplificación.<br />
Así se garantiza la máxima especificidad en el proceso (6).<br />
Una vez alcanzados los 37 ºC, el CAP pipetea una dilución de<br />
micropartículas magnéticas que llevan fijadas las moléculas de<br />
estreptavidina. La cubeta de reacción se incuba a 37 ºC para que<br />
se produzca la unión de la estreptavidina con la biotina de la<br />
sonda de captura. Al final de esta segunda incubación se habrán<br />
formado los complejos “micropartícula magnética –<br />
estreptavidina – biotina – sonda de captura – ácido nucleico”<br />
(figura 2).<br />
Formado este complejo y por lo tanto extraído el ácido nucleico,<br />
Sonda<br />
biotinilada<br />
HCV o<br />
QS RNA<br />
Figura 2. Captura de la<br />
sonda mediante la<br />
micropartícula magnética.<br />
(QS: Estándar de<br />
cuantificación).<br />
llega el momento de aislarlo y purificarlo. Para ello la cubeta de<br />
reacción se coloca en la posición de lavado, donde se conectan<br />
unos imanes que fijarán las partículas magnéticas y, con ellas el<br />
complejo formado, a la pared de la cubeta de reacción. El Cobas<br />
AmpliPrep aspira líquido de la cubeta y dispensa la solución de<br />
lavado, tras lo cual aspira todo el líquido dejando la cubeta seca<br />
y con los complejos unidos a las micropartículas magnéticas en<br />
el fondo del tubo.<br />
El último paso que realiza el CAP es la colocación de la cubeta<br />
de reacción en la posición de resuspensión y el pipeteo del<br />
diluyente de muestra en la misma, con lo que queda finalizado<br />
el proceso (7). De este modo, al cabo de una hora, el CAP ha<br />
realizado la extracción del ácido nucleico y lo deposita en un<br />
volumen de 250 µl de diluyente.<br />
Características de funcionamiento<br />
El CAP esta diseñado para realizar, simultáneamente, cuatro<br />
diferentes técnicas de extracción de ácidos nucleicos sin<br />
intervención del usuario. Los diferentes reactivos necesarios para<br />
estas extracciones están agrupados en tres casetes diferentes:<br />
- Multireagent: contiene, en tres diferentes viales, la solución de<br />
estándar de cuantificación, las sondas específicas y el diluyente<br />
de muestra.<br />
- Lysis: contiene el tampón de lisis.<br />
- Bead: contiene la mezcla de micropartículas magnéticas.<br />
Es posible cargar, simultáneamente, reactivos para más de 300<br />
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El diagnóstico molecular en continua evolución<br />
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