Roche Diagnostics - Roche España

Roche Diagnostics informa / Junio 2001
análisis mediante PCR en el laboratorio de diagnóstico no supone
únicamente la realización del proceso de amplificación, sino que
debemos realizar la preparación de la muestra, la amplificación
y la detección de las secuencias amplificadas. Estos tres procesos
van encadenados y, por lo tanto, es necesario que los tres se
realicen correctamente para que, al final del análisis, obtengamos
un resultado correcto. De nada nos servirá un proceso de
amplificación optimizado si no va acompañado de un proceso
de detección que aporte una sensibilidad adecuada. Lo mismo
podremos decir de la utilización de un procedimiento de
preparación de la muestra que aporte un alto índice de
recuperación de las moléculas del ácido nucleico buscado como
condición imprescindible para que el resto de procesos implicados
en la PCR transcurran satisfactoriamente (3).
Con este objetivo, en 1992, Roche Molecular Systems (RMS)
comenzó a comercializar reactivos para la realización de los
análisis mediante PCR en el diagnóstico de rutina. Los equipos
de reactivos Amplicor® incluyen todos los componentes necesarios
para la realización de los tres procesos de la técnica, ya que
se demostró que aspectos como el pH de los tampones o el
formato de los diferentes viales repercutían en la calidad final de
los resultados.
El primer paso de la automatización de la PCR fue el diseño de
termocicladores que permitieron la realización de todos los ciclos
en un único bloque térmico, sin tener que mover los tubos de
amplificación entre diferentes incubadores. Pero al introducirse
en la rutina diaria las necesidades de automatización aumentaron,
por lo que en 1995 RMS puso a disposición de los laboratorios
el analizador Cobas Amplicor®. Este sistema permitió la
automatización de los procesos de amplificación y detección, con
lo que se logró un incremento en la precisión y exactitud de los
resultados. Asimismo, la automatización con el Cobas Amplicor
aportó una sustancial mejora en cuanto a la necesidad de
intervención manual que la PCR tenía hasta ese momento, ya
que permitió que la amplificación y la detección sólo necesitasen
la presencia del operador durante 40 minutos, frente a las 2 horas
y 40 minutos en los procedimientos no automatizados (4, 5).
El siguiente paso ha sido encontrar la solución para la preparación
de la muestra. Este primer proceso de la PCR tiene básicamente
dos objetivos: extraer el ácido nucleico y purificarlo, aislándolo
de las proteínas y los iones metálicos. Ahora bien, si de lo que
tratamos es de automatizarlo, deberemos añadir otros objetivos
como la flexibilidad, la capacidad de trabajar con diferentes
pruebas simultáneamente, la posibilidad de añadir nuevas muestras
de manera continuada o la reducción del tiempo de intervención
manual.
La solución aportada al respecto por RMS en el año 2000 es el
sistema Cobas AmpliPrep® (CAP). Este instrumento permite
realizar la extracción del ácido nucleico a partir de la muestra de
una forma específica, de modo que el operador sólo tiene que
cargar las muestras, los reactivos, programar la lista de trabajo y
dar la orden de comienzo. A partir de este momento el usuario
queda liberado de cualquier tarea relacionada con la extracción
y sólo deberá intervenir cuando ésta haya finalizado.
Figura 1. Mezcla de reacción. (QS: Estándar de cuantificación).
Cubeta de reacción a 60 ºC
HCV
Muestra + QS
Sonda HCV
Lisis
Cubeta de reacción
a 37ºC
Estreptavidina
captura la sonda
Micropartícula
magnética
Técnica utilizada en la extracción
El CAP utiliza un tubo de muestra de 2 mL que debe contener
entre 250 µL y 1.100 µL de suero o plasma. Esta muestra la
dispensa en la cubeta de reacción junto con el estándar de
cuantificación (QS), el tampón de lisis y la sonda de captura
específica para cada ácido nucleico a extraer. Esta mezcla de
reacción se incuba a 60 ºC durante 15 minutos. A lo largo de
este tiempo se produce la lisis de la cápside viral y por lo tanto
la liberación del ácido nucleico del virus (figura 1).
A continuación, el brazo de transferencia del CAP coloca la
cubeta de reacción en el incubador a 37 ºC. El descenso de
temperatura induce la hibridación entre el ácido nucleico liberado
y la sonda específica de captura, biotilinada. Esta sonda está
diseñada con la misma secuencia que uno de los cebadores, que
se encargará de realizar la amplificación del fragmento del ácido
nucleico, con lo que se garantiza que solamente el ácido nucleico
buscado sea pipeteado posteriormente en el tubo de amplificación.
Así se garantiza la máxima especificidad en el proceso (6).
Una vez alcanzados los 37 ºC, el CAP pipetea una dilución de
micropartículas magnéticas que llevan fijadas las moléculas de
estreptavidina. La cubeta de reacción se incuba a 37 ºC para que
se produzca la unión de la estreptavidina con la biotina de la
sonda de captura. Al final de esta segunda incubación se habrán
formado los complejos “micropartícula magnética –
estreptavidina – biotina – sonda de captura – ácido nucleico”
(figura 2).
Formado este complejo y por lo tanto extraído el ácido nucleico,
Sonda
biotinilada
HCV o
QS RNA
Figura 2. Captura de la
sonda mediante la
micropartícula magnética.
(QS: Estándar de
cuantificación).
llega el momento de aislarlo y purificarlo. Para ello la cubeta de
reacción se coloca en la posición de lavado, donde se conectan
unos imanes que fijarán las partículas magnéticas y, con ellas el
complejo formado, a la pared de la cubeta de reacción. El Cobas
AmpliPrep aspira líquido de la cubeta y dispensa la solución de
lavado, tras lo cual aspira todo el líquido dejando la cubeta seca
y con los complejos unidos a las micropartículas magnéticas en
el fondo del tubo.
El último paso que realiza el CAP es la colocación de la cubeta
de reacción en la posición de resuspensión y el pipeteo del
diluyente de muestra en la misma, con lo que queda finalizado
el proceso (7). De este modo, al cabo de una hora, el CAP ha
realizado la extracción del ácido nucleico y lo deposita en un
volumen de 250 µl de diluyente.
Características de funcionamiento
El CAP esta diseñado para realizar, simultáneamente, cuatro
diferentes técnicas de extracción de ácidos nucleicos sin
intervención del usuario. Los diferentes reactivos necesarios para
estas extracciones están agrupados en tres casetes diferentes:
- Multireagent: contiene, en tres diferentes viales, la solución de
estándar de cuantificación, las sondas específicas y el diluyente
de muestra.
- Lysis: contiene el tampón de lisis.
- Bead: contiene la mezcla de micropartículas magnéticas.
Es posible cargar, simultáneamente, reactivos para más de 300
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El diagnóstico molecular en continua evolución
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