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URISYS 2400 innovación también en urianálisis El diagnóstico molecular en continua evolución José Mª Sanz Uriarte Roche Diagnostics. Departamento de Servicios Centrales. Barcelona La simplificación de los métodos de diagnóstico basados en la reacción en cadena mediada por la polimerasa (PCR) ha generalizado su uso en los laboratorios Última generación de analizadores Hitachi de tiras reactivas Procesado de muestras mediante rack estándar de 5 posiciones Carga continua o en series de hasta 75 muestras Homogeneización y dispensado de la muestra por pipeteo Una sola calibración mensual Capacidad de memoria para 1500 resultados Carga y reposición de reactivos por cassette compacto de 400 tiras de análisis clínicos. Esta nueva situación ha conducido al desarrollo de instrumentos automáticos que estandarizan y simplifican la amplificación y detección de los ácidos nucleicos. Finalmente esto también se ha logrado con la preparación de las muestras, con lo que se ha completado la automatización de todo el proceso. A principio de los años noventa se comenzó a trabajar rutinariamente en los laboratorios de diagnóstico clínico con técnicas de diagnóstico molecular y, poco a poco, fue haciéndose más frecuente la realización de estos análisis mediante la reacción en cadena mediada por la polimerasa (PCR) (1, 2). Esta técnica permitió un más fácil acceso a la realización de pruebas de diagnóstico molecular debido a la facilidad de su puesta en marcha en cualquier laboratorio de análisis clínicos. Con el incremento del número de análisis realizados mediante PCR se pudo comprobar la necesidad de la estandarización de las pruebas, así como la necesidad de su automatización. La estandarización fue necesaria porque la realización de un 27
Roche Diagnostics informa / Junio 2001 análisis mediante PCR en el laboratorio de diagnóstico no supone únicamente la realización del proceso de amplificación, sino que debemos realizar la preparación de la muestra, la amplificación y la detección de las secuencias amplificadas. Estos tres procesos van encadenados y, por lo tanto, es necesario que los tres se realicen correctamente para que, al final del análisis, obtengamos un resultado correcto. De nada nos servirá un proceso de amplificación optimizado si no va acompañado de un proceso de detección que aporte una sensibilidad adecuada. Lo mismo podremos decir de la utilización de un procedimiento de preparación de la muestra que aporte un alto índice de recuperación de las moléculas del ácido nucleico buscado como condición imprescindible para que el resto de procesos implicados en la PCR transcurran satisfactoriamente (3). Con este objetivo, en 1992, Roche Molecular Systems (RMS) comenzó a comercializar reactivos para la realización de los análisis mediante PCR en el diagnóstico de rutina. Los equipos de reactivos Amplicor® incluyen todos los componentes necesarios para la realización de los tres procesos de la técnica, ya que se demostró que aspectos como el pH de los tampones o el formato de los diferentes viales repercutían en la calidad final de los resultados. El primer paso de la automatización de la PCR fue el diseño de termocicladores que permitieron la realización de todos los ciclos en un único bloque térmico, sin tener que mover los tubos de amplificación entre diferentes incubadores. Pero al introducirse en la rutina diaria las necesidades de automatización aumentaron, por lo que en 1995 RMS puso a disposición de los laboratorios el analizador Cobas Amplicor®. Este sistema permitió la automatización de los procesos de amplificación y detección, con lo que se logró un incremento en la precisión y exactitud de los resultados. Asimismo, la automatización con el Cobas Amplicor aportó una sustancial mejora en cuanto a la necesidad de intervención manual que la PCR tenía hasta ese momento, ya que permitió que la amplificación y la detección sólo necesitasen la presencia del operador durante 40 minutos, frente a las 2 horas y 40 minutos en los procedimientos no automatizados (4, 5). El siguiente paso ha sido encontrar la solución para la preparación de la muestra. Este primer proceso de la PCR tiene básicamente dos objetivos: extraer el ácido nucleico y purificarlo, aislándolo de las proteínas y los iones metálicos. Ahora bien, si de lo que tratamos es de automatizarlo, deberemos añadir otros objetivos como la flexibilidad, la capacidad de trabajar con diferentes pruebas simultáneamente, la posibilidad de añadir nuevas muestras de manera continuada o la reducción del tiempo de intervención manual. La solución aportada al respecto por RMS en el año 2000 es el sistema Cobas AmpliPrep® (CAP). Este instrumento permite realizar la extracción del ácido nucleico a partir de la muestra de una forma específica, de modo que el operador sólo tiene que cargar las muestras, los reactivos, programar la lista de trabajo y dar la orden de comienzo. A partir de este momento el usuario queda liberado de cualquier tarea relacionada con la extracción y sólo deberá intervenir cuando ésta haya finalizado. Figura 1. Mezcla de reacción. (QS: Estándar de cuantificación). Cubeta de reacción a 60 ºC HCV Muestra + QS Sonda HCV Lisis Cubeta de reacción a 37ºC Estreptavidina captura la sonda Micropartícula magnética Técnica utilizada en la extracción El CAP utiliza un tubo de muestra de 2 mL que debe contener entre 250 µL y 1.100 µL de suero o plasma. Esta muestra la dispensa en la cubeta de reacción junto con el estándar de cuantificación (QS), el tampón de lisis y la sonda de captura específica para cada ácido nucleico a extraer. Esta mezcla de reacción se incuba a 60 ºC durante 15 minutos. A lo largo de este tiempo se produce la lisis de la cápside viral y por lo tanto la liberación del ácido nucleico del virus (figura 1). A continuación, el brazo de transferencia del CAP coloca la cubeta de reacción en el incubador a 37 ºC. El descenso de temperatura induce la hibridación entre el ácido nucleico liberado y la sonda específica de captura, biotilinada. Esta sonda está diseñada con la misma secuencia que uno de los cebadores, que se encargará de realizar la amplificación del fragmento del ácido nucleico, con lo que se garantiza que solamente el ácido nucleico buscado sea pipeteado posteriormente en el tubo de amplificación. Así se garantiza la máxima especificidad en el proceso (6). Una vez alcanzados los 37 ºC, el CAP pipetea una dilución de micropartículas magnéticas que llevan fijadas las moléculas de estreptavidina. La cubeta de reacción se incuba a 37 ºC para que se produzca la unión de la estreptavidina con la biotina de la sonda de captura. Al final de esta segunda incubación se habrán formado los complejos “micropartícula magnética – estreptavidina – biotina – sonda de captura – ácido nucleico” (figura 2). Formado este complejo y por lo tanto extraído el ácido nucleico, Sonda biotinilada HCV o QS RNA Figura 2. Captura de la sonda mediante la micropartícula magnética. (QS: Estándar de cuantificación). llega el momento de aislarlo y purificarlo. Para ello la cubeta de reacción se coloca en la posición de lavado, donde se conectan unos imanes que fijarán las partículas magnéticas y, con ellas el complejo formado, a la pared de la cubeta de reacción. El Cobas AmpliPrep aspira líquido de la cubeta y dispensa la solución de lavado, tras lo cual aspira todo el líquido dejando la cubeta seca y con los complejos unidos a las micropartículas magnéticas en el fondo del tubo. El último paso que realiza el CAP es la colocación de la cubeta de reacción en la posición de resuspensión y el pipeteo del diluyente de muestra en la misma, con lo que queda finalizado el proceso (7). De este modo, al cabo de una hora, el CAP ha realizado la extracción del ácido nucleico y lo deposita en un volumen de 250 µl de diluyente. Características de funcionamiento El CAP esta diseñado para realizar, simultáneamente, cuatro diferentes técnicas de extracción de ácidos nucleicos sin intervención del usuario. Los diferentes reactivos necesarios para estas extracciones están agrupados en tres casetes diferentes: - Multireagent: contiene, en tres diferentes viales, la solución de estándar de cuantificación, las sondas específicas y el diluyente de muestra. - Lysis: contiene el tampón de lisis. - Bead: contiene la mezcla de micropartículas magnéticas. Es posible cargar, simultáneamente, reactivos para más de 300 28 El diagnóstico molecular en continua evolución 29
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