Determinación de ácido abscÃsico, ácido indolacético, zeatina ... - Inia
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Determinación <strong>de</strong> ácido abscísico, ácido indolacético, <strong>zeatina</strong> y<br />
ribósido <strong>de</strong> <strong>zeatina</strong> en hojas <strong>de</strong>sarrolladas <strong>de</strong> Gerbera jamesonii<br />
cv Bolus y su variación con la edad<br />
C. Olivella 1 *, M. Vendrell 2 , R. Savé 1<br />
1 Dpto. <strong>de</strong> Tecnologia Hortícola. Institut <strong>de</strong> Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA).<br />
Centre <strong>de</strong> Cabrils. Carretera <strong>de</strong> Cabrils s/n. 08348 Cabrils (Barcelona).<br />
2 Centre d’Investigació i Desenvolupament (CID). Consell Superior d’Investigacions Científiques<br />
(CSIC). C/. Jordi Girona Salgado, 18. 08028 Barcelona.<br />
carme.olivella@correu.gencat.es<br />
RESUMEN<br />
Muchos <strong>de</strong> los procedimientos utilizados en la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> hormonas vegetales han sido establecidos<br />
para la cuantificación <strong>de</strong> las mismas en una amplia variedad <strong>de</strong> tejidos. Sin embargo, se han <strong>de</strong>sarrollado muy<br />
pocos para la <strong>de</strong>terminación en hojas plenamente <strong>de</strong>sarrolladas, las cuales están altamente pigmentadas y contienen<br />
muchos compuestos que copurifican con las hormonas. Se proponen dos métodos para la medida simulánea<br />
<strong>de</strong> ácido abscísico (ABA) y ácido indolacético (AIA) por un lado, y <strong>de</strong> <strong>zeatina</strong> con ribósido <strong>de</strong> <strong>zeatina</strong> (Z+ZR)<br />
por otro, en hojas plenamente <strong>de</strong>sarrolladas <strong>de</strong> Gerbera jamesonii cv Bolus. Estos métodos incluyeron una etapa<br />
inicial <strong>de</strong> extracción líquido-líquido, una etapa <strong>de</strong> extracción en fase sólida, una etapa <strong>de</strong> purificación por HPLC<br />
y una cuantificación por ELISA. Este esquema es parecido a otros propuestos para la medida <strong>de</strong> hormonas vegetales<br />
en hojas plenamente <strong>de</strong>sarrolladas utilizando cromatografía <strong>de</strong> gases con <strong>de</strong>tector selectivo <strong>de</strong> masas<br />
(GC-MS). Los resultados mostraron que no hay diferencias significativas en las concentraciones <strong>de</strong> ABA y <strong>de</strong><br />
AIA según la edad <strong>de</strong> las hojas. En cambio, para Z+ZR se encontraron diferencias entre las hojas jóvenes (7 días<br />
<strong>de</strong> edad) y las adultas (21 días), pero no entre las adultas y las viejas (60 días).<br />
PALABRAS CLAVE:<br />
ABA<br />
IAA<br />
Z+ZR<br />
Hojas<br />
HPLC<br />
ELISA<br />
INTRODUCCIÓN<br />
El ácido abscísico (ABA), el ácido indolacético (AIA) y las citoquininas (CQ) participan<br />
en los mecanismos <strong>de</strong> regulación <strong>de</strong>l estado fisiológico <strong>de</strong> la planta. Así, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> otras fun-<br />
* Autor para correspon<strong>de</strong>ncia<br />
Recibido: 17-4-00<br />
Aceptado para su publicación: 9-4-01<br />
Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 16 (3), 2001
334 C. OLIVELLA et al.<br />
ciones, el ABA estimula el cierre <strong>de</strong> los estomas, mientras que el AIA y CQ ejercen la acción<br />
contraria. Por otra parte, las CQ estimulan la multiplicación celular y el AIA favorece el crecimiento<br />
celular. Determinar sus niveles foliares es fundamental para po<strong>de</strong>r establecer la respuesta<br />
<strong>de</strong> la planta frente a los estreses abióticos (Mansfield y Mc Ainsh, 1995).<br />
Los procedimientos para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> ácido abscísico (ABA), ácido indolacético<br />
(AIA), <strong>zeatina</strong> (Z) y ribósido <strong>de</strong> <strong>zeatina</strong> (ZR) en hojas <strong>de</strong>sarrolladas requieren la utilización<br />
<strong>de</strong> diversas etapas <strong>de</strong> purificación con sistemas muy sensibles <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección, <strong>de</strong>bido<br />
a la alta pigmentación <strong>de</strong> las hojas y a que los niveles foliares <strong>de</strong> hormonas son muy bajos,<br />
respecto <strong>de</strong> los <strong>de</strong> otros compuestos que copurifican con ellas (Horgan, 1995; Okuda,<br />
2000). Los sistemas <strong>de</strong> purificación son muy diversos: HPLC, extracción en fase sólida<br />
(SFE), extracción líquido-líquido, y se usan <strong>de</strong> forma única o combinada. En cuanto a los<br />
sistemas <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección, la variabilidad no es menor: HPLC con <strong>de</strong>tección por ultravioleta o<br />
por fluorescencia, cromatografia gas-líquido (GLC) con varios <strong>de</strong>tectores (<strong>de</strong> ionización a<br />
la llama, FID, <strong>de</strong> espectrometría <strong>de</strong> masas o MS, <strong>de</strong> captura <strong>de</strong> electrones o ECD, etc.),<br />
métodos inmunoenzimáticos (radioinmunoensayo, RIA, en soporte sólido, ELISA, etc.)<br />
(Hed<strong>de</strong>n, 1993; Horgan, 1995).<br />
Muchos <strong>de</strong> los procedimientos analíticos se han establecido para yemas, frutos, callos,<br />
meristemos, etc. (Nan et al., 1999; Kotov y Kotova, 2000), etc., y muy pocos lo han<br />
sido para hojas totalmente <strong>de</strong>sarrolladas (Li et al., 1992; Okuda, 2000).<br />
Los métodos inmunoenzimáticos están siendo ampliamente utilizados en la <strong>de</strong>terminación<br />
<strong>de</strong> las hormonas vegetales, <strong>de</strong>bido a su bajo costo yasusencillez. Aunque se pue<strong>de</strong>n<br />
utilizar directamente sobre el extracto vegetal, la mayoría <strong>de</strong> los autores recomiendan<br />
la inclusión <strong>de</strong> una o varias etapas previas <strong>de</strong> purificación <strong>de</strong>l mismo, <strong>de</strong> manera similar a<br />
como se hace en la <strong>de</strong>terminación por GLC-MS (Horgan, 1995; Sztein et al., 1999).<br />
El objetivo <strong>de</strong> este trabajo fue el establecimiento <strong>de</strong> dos procedimientos <strong>de</strong> purificación<br />
y <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> hormonas mediante ELISA, uno para ABA y AIA simultáneamente,<br />
y otro para ZyZR(Z+ZR) conjuntamente, en hojas <strong>de</strong> diferente estado <strong>de</strong> <strong>de</strong>sarrollo<br />
en plantas <strong>de</strong> Gerbera jamesonii.<br />
Material vegetal<br />
MATERIAL Y MÉTODOS<br />
Seis plantas <strong>de</strong> 8 meses <strong>de</strong> edad y <strong>de</strong> porte similar <strong>de</strong> Gerbera jamesonii cv Bolus en<br />
producción bajo inverna<strong>de</strong>ro fueron seleccionadas al azar. Las plantas se regaron diariamente<br />
con una solución nutritiva <strong>de</strong> composición N:P 2 O 5 :K 2 O (1:0,6:2). Hojas <strong>de</strong> diferente<br />
edad, jóvenes (<strong>de</strong> siete días <strong>de</strong> edad), adultas (<strong>de</strong> 21 días) y maduras (<strong>de</strong> 60 días), fueron<br />
muestreadas al azar en tres momentos diferentes, a 1, 4, y 9 días a partir <strong>de</strong> la fecha <strong>de</strong><br />
inicio <strong>de</strong>l experimento.<br />
Determinaciones hormonales<br />
Inmediatamente <strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l muestreo, las hojas fueron sumergidas en nitrógeno líquido,<br />
liofilizadas y conservadas a –80 hasta su procesamiento. El ABA, AIA y Z+ZR<br />
fueron <strong>de</strong>terminados mediante los procedimientos siguientes:
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA 335<br />
Hormonas ácidas<br />
Para la extración <strong>de</strong>l ABA y <strong>de</strong>l AIA, 0,2 g <strong>de</strong> hojas liofilizadas fueron sumergidas en<br />
10 ml <strong>de</strong> una solución extractante (Vine et al., 1987) compuesta por acetona: ácido acético<br />
(CH 3 COOH) 0,2 M 70:30 (v/v), 100 mgml –1 <strong>de</strong> BHT (2,6 di-t-butil 4-metilfenol) y 20<br />
mgml –1 <strong>de</strong> ascorbato <strong>de</strong> sodio durante 16 horas a 4 C a oscuras agitación continua<br />
(Fig. 1).<br />
0,2 g Peso Seco<br />
10 ml Solución Extractante<br />
Centrifugación y Filtración<br />
Evaporación Acetona<br />
Solución acuosa pH 8,5<br />
Extracción Pigmentos con<br />
Acetato Etilo<br />
Solución acuosa pH 2,5<br />
Carga Minicolumna C18<br />
Elución con éter dietílico<br />
Evaporación éter<br />
Metilación con Diazometano<br />
Redisolución en 100 µl MeOH:H O 2<br />
Inyección 50 µl HPLC<br />
Recolección fracciones ABAMe, AIAMe<br />
ELISA<br />
Fig. 1.–Diagrama <strong>de</strong> flujo <strong>de</strong>l procedimiento <strong>de</strong> purificación para la <strong>de</strong>terminación ELISA <strong>de</strong><br />
ABA y AIA en hojas <strong>de</strong>sarrolladas <strong>de</strong> plantas <strong>de</strong> Gerbera jamesonii cv Bolus<br />
Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 16 (3), 2001
336 C. OLIVELLA et al.<br />
El extracto se centrifugó a 3.000 g durante 6+10minysefiltró con papel Whatman<br />
no.41. El residuo se recuperó con 2,5 ml <strong>de</strong> la solución extractante y centrifugado otra vez<br />
a la misma velocidad durante 5 min. El extracto se filtró y se recogió la fase líquida. Se<br />
evaporó la acetona con corriente <strong>de</strong> N 2 a35 C. Se ajustó el pH <strong>de</strong> la fase acuosa a 8,5<br />
con una solución <strong>de</strong> NaHCO 3 semisaturada y se procedió a la extracción <strong>de</strong> los pigmentos<br />
con 3 5 ml <strong>de</strong> acetato <strong>de</strong> etilo. La fase orgánica fue <strong>de</strong>scartada y el pH <strong>de</strong> la solución se<br />
ajustó a 2,5 con H 2 SO 4 1N.<br />
La solución se introdujo en una minicolumna con 100 mg <strong>de</strong> relleno <strong>de</strong> C18 (Bond<br />
Elut Analytichem), previamente acondicionada con 3 ml <strong>de</strong> metanol (MeOH) y 3 ml<br />
HCl 1N. El ABA y el AIA fueron eluidos con 2 3 ml <strong>de</strong> éter etílico recogidos sobre<br />
agua. La fase etérea fue extraída y seguidamente evaporada con corriente <strong>de</strong> N 2 a35 C.<br />
El residuo sólido se recuperó con 0,1 ml <strong>de</strong> MeOH y las hormonas se metilaron con 0,6<br />
ml <strong>de</strong> diazometano preparado en nuestro laboratorio. Los <strong>de</strong>rivados metilados (ABAMe y<br />
AIAMe) fueron llevados a sequedad con corriente <strong>de</strong> N 2 a35 C.<br />
El ABAMe y el AIAMe fueron recuperados con 0,2 ml <strong>de</strong> una solución <strong>de</strong> MeOH:<br />
CH3COOH 0,2 M pH 3 50:50 (v:v). Se tomaron 70 l, y <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> pasarlos a través<br />
<strong>de</strong> un filtro <strong>de</strong> nailon <strong>de</strong> 0,2 µm <strong>de</strong> tamaño <strong>de</strong> poro, se inyectaron en un equipo Shimadzu<br />
<strong>de</strong> HPLC equipado con un <strong>de</strong>tector <strong>de</strong> fotodiodos (Maldiney et al., 1986). La<br />
columna utilizada fue Tracer 15 cm <strong>de</strong> longitud y 0,4 cm <strong>de</strong> diámetro y una fase estacionaria<br />
<strong>de</strong> octa<strong>de</strong>cilsilil (ODS-2), <strong>de</strong> 3 µm <strong>de</strong> tamaño <strong>de</strong> partícula. La elución <strong>de</strong> las<br />
hormonas se realizó <strong>de</strong> acuerdo con el siguiente procedimiento: caudal 0,4 mlmin –1 ,<br />
condiciones iniciales: 50 % Me OH en CH3COOH 0,2M durante 5 min, a continuación<br />
un gradiente lineal hasta el 100 % <strong>de</strong> MeOH en 13 min. Esta concentración <strong>de</strong><br />
MeOH se mantuvo durante 2 min para permitir la limpieza <strong>de</strong> impurezas <strong>de</strong> la columna<br />
y <strong>de</strong>l equipo, y seguidamente la concentración <strong>de</strong>l eluente se situó en 2 min al 50 %<br />
en MeOH. Después <strong>de</strong> un período <strong>de</strong> 5 min el equipo se encontró estabilizado y listo<br />
para comenzar la purificación <strong>de</strong> otra muestra. El tiempo <strong>de</strong> elución <strong>de</strong> las fracciones<br />
se estableció con una solución patrón <strong>de</strong> 5 g. ml –1 <strong>de</strong> AIAMe y <strong>de</strong> ABAMe. En estas<br />
condiciones se obtuvo una recuperación <strong>de</strong>l 29,2 5,1paran=4,queestá <strong>de</strong> acuerdo<br />
con las recuperaciones que se han obtenido en otros trabajos, para un peso <strong>de</strong> muestra<br />
seca inferior a los 0,2 g (Neill y Horgan, 1985). Las correspondientes fracciones hormonales<br />
<strong>de</strong>l extracto vegetal se recogieron y se llevaron a sequedad con corriente <strong>de</strong><br />
N 2 a55 C.<br />
Los residuos sólidos fueron resuspendidos en 0,5 ml <strong>de</strong> tampón fosfato (PBS) y 0,1<br />
ml fueron utilizados para la <strong>de</strong>terminación por ELISA <strong>de</strong> ABAMe y <strong>de</strong> AIAMe con un kit<br />
<strong>de</strong> EPHYSCIENCE <strong>de</strong> la casa Mayoly-Spindler.<br />
Citoquininas<br />
Las citoquininas se extrajeron con una solución extractante <strong>de</strong> composición MeOH:<br />
CH 3 COOH 0,2 M pH = 3 80:20 (v:v) con 100 mgml –1 BHT (2,6-di-t-butil 4 metil-fenol).<br />
La extracción se realizó a 4 C a oscuras durante 16 horas (Smalley et al., 1991) (Fig. 2).<br />
Después <strong>de</strong> una etapa <strong>de</strong> centrifugación y filtración, tal y como se ha <strong>de</strong>scrito anteriormente,<br />
se evaporó el MeOH con corriente <strong>de</strong> N 2 a55 C. El pH <strong>de</strong> la solución acuosa<br />
se ajustó a 3 con H 2 SO 4 1N. A continuación se procedió a la extracción <strong>de</strong> los pigmentos
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA 337<br />
0,2gPS<br />
10 ml Solución Extractante<br />
Centrifugación y Filtración<br />
Evaporación MeOH<br />
Solución acuosa pH 3,0<br />
Extracción Pigmentos con<br />
Acetato Etilo<br />
Evaporación fase orgánica<br />
Redisolución en 200 µl MeOH:H O 2<br />
Inyección 50 µl HPLC<br />
Recolección fracciónZ+ZR<br />
ELISA<br />
Fig. 2.–Diagrama <strong>de</strong> flujo <strong>de</strong>l procedimiento <strong>de</strong> purificación para la <strong>de</strong>terminación ELISA <strong>de</strong><br />
Z + ZR en hojas <strong>de</strong>sarrolladas <strong>de</strong> plantas <strong>de</strong> Gerbera jamesonii cv Bolus<br />
con 3 5 ml <strong>de</strong> acetato <strong>de</strong> etilo. Se <strong>de</strong>scartó la fase orgánica y se evaporó la fase acuosa a<br />
sequedad con corriente <strong>de</strong> N 2 a55 C.<br />
El residuo sólido fue resuspendido con 0,2 ml <strong>de</strong> una solución <strong>de</strong> MeOH: CH 3 COOH<br />
pH 3 30:70 (v:v). Se tomaron 70 l, y <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> filtrarla con un filtro <strong>de</strong> nailon similar al<br />
utilizado para la purificación <strong>de</strong>l ABA y <strong>de</strong>l AIA, se inyectaron en el mismo equipo <strong>de</strong><br />
HPLC. La elución <strong>de</strong> la ZyelZRserealizó utilizando el procedimiento <strong>de</strong> Stevens and<br />
Berry (1988): caudal 0,4 ml min –1 , condiciones iniciales: 30 % MeOH: CH 3 COOH 0,2 M<br />
pH 3 durante 15 min. A continuación se estableció un gradiente hasta el 100 % <strong>de</strong> MeOH,<br />
y se mantuvo esta composición <strong>de</strong>l eluente durante 5 min, para permitir la limpieza <strong>de</strong> impurezas<br />
<strong>de</strong> la columna y <strong>de</strong>l equipo. La composición <strong>de</strong>l eluente fue llevada <strong>de</strong> nuevo a la<br />
inicial en 2 min, y <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> un período <strong>de</strong> estabilización <strong>de</strong> 5 min, el equipo estuvo listo<br />
para la purificación <strong>de</strong> una nueva muestra. El tiempo <strong>de</strong> elución <strong>de</strong> las fracciones <strong>de</strong> Z y<br />
ZR fue establecido con una solución patrón <strong>de</strong> 5 gml –1 <strong>de</strong> <strong>de</strong> las dos sustancias. Se obtuvo<br />
un rendimiento <strong>de</strong>l 50,7 8,8 %, que está <strong>de</strong> acuerdo con el obtenido por otros autores<br />
(Sotta et al., 1987). En estas condiciones ambas eluyeron muy próximas, y se recogieron<br />
conjuntamente. La fracción <strong>de</strong> Z+ZRfueevaporada a sequedad con corriente <strong>de</strong> N 2 a<br />
55 C.<br />
Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 16 (3), 2001
338 C. OLIVELLA et al.<br />
Utilizando soluciones hormonales patrón intercaladas en series <strong>de</strong> muestras, se comprobó<br />
que los tiempos <strong>de</strong> elución se mantenían bastante regulares durante la etapa <strong>de</strong> purificación<br />
por HPLC.<br />
Los residuos sólidos fueron resuspendidos en 0,5 ml <strong>de</strong> PBS y se utilizaron 0,1 ml<br />
para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> citoquininas mediante ELISA utilizando un kit EPHYSCIENCE<br />
<strong>de</strong> la casa Mayoly Spindler.<br />
El procedimento ha sido <strong>de</strong>scrito anteriormente (Maldiney et al., 1986) y se realizó<br />
separadamente para cada hormona con algunas pequeñas modificaciones. Se fundamenta<br />
en la competición por la unión al anticuerpo monoclonal <strong>de</strong> ratón, entre la hormona libre<br />
<strong>de</strong>l extracto vegetal (ABAMe, AIAMe, Z y ZR), y la hormona ligada mediante un brazo<br />
<strong>de</strong> albúmina a la pared <strong>de</strong> los pocillos <strong>de</strong> las placas <strong>de</strong> ELISA. Para la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong>l anticuerpo<br />
unido a la hormona ligada se utilizaron anticuerpos <strong>de</strong> oveja anti-ratón, marcados<br />
con peroxidasa. El revelado se produjo con 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina)-6- ácido<br />
sulfónico (ABTS) y agua oxigenada como sustratos enzimáticos en un tampón <strong>de</strong> perborato<br />
<strong>de</strong> pH 4,6. La lectura <strong>de</strong> la absorbancia se hizo a 405 nm. La absorbancia máxima correspondió<br />
a los pocillos con blanco, mientras que la mínima era la <strong>de</strong> los pocillos saturados<br />
<strong>de</strong> solución hormonal. La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la concentración se hizo sobre una recta<br />
<strong>de</strong> calibrado establecida para cada placa, utilizando una regresión <strong>de</strong> or<strong>de</strong>n 3 sobre el promedio<br />
<strong>de</strong> tres curvas patrón.<br />
Análisis estadístico<br />
La media y la <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> cada muestra se obtuvieron sobre 3 réplicas <strong>de</strong><br />
cada muestra. Cada réplica era la media <strong>de</strong> la lectura <strong>de</strong> la concentración hormonal en 4<br />
pocillos. La relación entre la edad <strong>de</strong> la hoja y la concentración hormonal se estableció<br />
con el programa estadístico Sigmaplot v.2.01 <strong>de</strong> Jan<strong>de</strong>l Scientific. Se utilizó una regresión<br />
<strong>de</strong> or<strong>de</strong>n 1 porque una regresión <strong>de</strong> mayor or<strong>de</strong>n no mejoraba el ajuste <strong>de</strong> la correlación.<br />
RESULTADOS Y DISCUSIÓN<br />
Los dos procedimientos <strong>de</strong>scritos permitieron la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> hormonas en hojas<br />
totalmente <strong>de</strong>sarrolladas mediante un sistema ELISA. La etapa <strong>de</strong> extracción líquido-líquido<br />
permitió una primera purificación <strong>de</strong>l extracto vegetal antes <strong>de</strong> la etapa <strong>de</strong> HPLC.<br />
Ésta es una <strong>de</strong> las etapas más problemáticas, ya que el acetato <strong>de</strong> etilo es parcialmente<br />
miscible en agua, y se produce una emulsión en la interfase que podría retener las hormonas.<br />
Es importante establecer un volumen a<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> disolvente orgánico, para evitar tener<br />
pérdidas en esta etapa (Veselov et al., 1992).<br />
Para aumentar el rendimiento, se intentó partir <strong>de</strong> un peso <strong>de</strong> muestra seca superior a<br />
0,2 g. Ello nos obligó a incrementar tanto el volumen <strong>de</strong> los disolventes como el <strong>de</strong>l material<br />
volumétrico. La sistemática <strong>de</strong>l procedimiento se volvió más compleja, y se <strong>de</strong>cidió<br />
mantener el peso inicial <strong>de</strong> 0,2 g.
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA 339<br />
Algunos autores han sugerido realizar el secado <strong>de</strong> la minicolumna antes <strong>de</strong> la aplicación<br />
<strong>de</strong>l disolvente para eluir las hormonas (Dunlap y Guinn 1989). Sin embargo, se consi<strong>de</strong>ró<br />
que es muy difícil asegurar que la minicolumna que<strong>de</strong> completamente seca, <strong>de</strong>bido<br />
al origen orgánico <strong>de</strong> la fase ligada. Así, cuando las hormonas fueran eluidas, el agua retenida<br />
en la minicolumna podría eluir con el éter dietílico, dificultando la evaporación a<br />
sequedad <strong>de</strong>l eluyente. Se prefirió eluir las hormonas con éter dietílico recogido sobre<br />
agua, separar la fase orgánica y llevarla a sequedad.<br />
A diferencia <strong>de</strong> otros autores, en el presente trabajo se <strong>de</strong>cidió metilar el ABA y el<br />
AIA, antes <strong>de</strong> iniciar la purificación por HPLC, con el objeto <strong>de</strong> aumentar su estabilidad<br />
(Law y Davies, 1990). Algunas veces no se pudieron procesar <strong>de</strong> inmediato por HPLC,<br />
y fue necesario conservar los extractos a –20 C en las condiciones más estables posibles.<br />
Se intentó introducir una etapa adicional <strong>de</strong> extracción en fase sólida, <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la<br />
<strong>de</strong> extracción líquido-líquido en el procedimiento para la purificación <strong>de</strong> citoquininas<br />
(Kotov y Kotova 2000), pero la relativa miscibilidad <strong>de</strong>l acetato <strong>de</strong> etilo en agua fue suficiente<br />
para impedir la unión <strong>de</strong> las citoquininas a la fase <strong>de</strong> C18.<br />
Estos procedimientos han sido utilizados para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> los niveles hormonales<br />
en hojas <strong>de</strong> plantas <strong>de</strong> gerbera en condiciones <strong>de</strong> sequía, <strong>de</strong> encharcamiento y <strong>de</strong> bajas<br />
temperaturas (Savé et al., 1995; Olivella et al., 1998; Olivella et al., 2000).<br />
Los resultados obtenidos mostraron una gran variabilidad en los valores <strong>de</strong> ABA y <strong>de</strong><br />
Z + ZR (Tabla 1). Ello pue<strong>de</strong> ser atribuido parcialmente al procedimiento analítico y parcialmente<br />
a la variabilidad <strong>de</strong> las hojas. Ya hemos comentado cuáles son los factores que<br />
pue<strong>de</strong>n ser los causantes <strong>de</strong> la variabilidad analítica. Respecto a la variabilidad atribuible<br />
a las propias hojas en plantas en producción, hay que tener en cuenta factores como la<br />
tasa fotosintética (Guinn y Brummett, 1993), el estado hídrico, la disponibilidad <strong>de</strong> algunos<br />
elementos minerales, K, Ca, etc. (Mansfield y Mc Ainsh, 1995).<br />
No obstante, no se encontraron cambios significativos en los niveles <strong>de</strong> ABA y <strong>de</strong><br />
AIA en hojas <strong>de</strong> diferente edad. Por otra parte, sí aparecieron diferencias significativas<br />
en los niveles <strong>de</strong> Z+ZRentre hojas jóvenes (7 días) por un lado, y hojas adultas<br />
(20 días) y maduras (60 días) por el otro. Estos resultados son consistentes con los obtenidos<br />
por Singh et al. (1992) para hojas <strong>de</strong> tabaco jóvenes, presenescentes y senescentes.<br />
Estas variaciones pue<strong>de</strong>n ser <strong>de</strong>bidas a una alta absorción endogénica a través<br />
<strong>de</strong>l flujo xilemático, o a una mayor capacidad biosintética <strong>de</strong> las hojas jóvenes (Kotov<br />
y Kotova, 2000). Las diferencias son mayores entre las hojas jóvenes y las adultas,<br />
que entre las adultas y las maduras. Po<strong>de</strong>mos concluir que en ciclos experimentales,<br />
con una duración conocida <strong>de</strong> algunos días y muestreando hojas adultas, las variaciones<strong>de</strong>Z+ZRencontradas<br />
no pudieron ser atribuibles a diferencias en la edad <strong>de</strong> las<br />
hojas.<br />
Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 16 (3), 2001
340 C. OLIVELLA et al.<br />
Tabla 1<br />
Niveles <strong>de</strong> ABA, AIA yZ+ZRendiferentes grupos <strong>de</strong> hojas <strong>de</strong> plantas <strong>de</strong> Gerbera jamesonii cv Bolus: hojas<br />
jóvenes (7 días), hojas adultas (20 días) y hojas maduras (60 días)<br />
Días<br />
hojas jóvenes hojas adultas hojas maduras<br />
1.º 4.º 9.º 1.º 4.º 9.º 1.º 4.º 9.º<br />
ABA<br />
pmols.g –1 P.S. 568 n.d. 238 59 154 42 152 40 154 38 69 67 127 71 166 64 250 35<br />
x sd 320 219 ns 192 67 ns 181 63 ns<br />
AIAnmols.g –1 P.S. 52 4 49 16 39 11 48 2 39 4 36 11 43 16 48 1 43 9<br />
x sd 47 12 ns 41 8 ns 4 9 ns<br />
Z+ZR<br />
pmols.g –1 P.S. 634 92 395 77 504 7 248 51 177 5 276 4 112 60 215 43 181 3<br />
x sd 511 120 ** 234 51 ns 169 52 ns<br />
ns: diferencias no significativas<br />
nd: no <strong>de</strong>terminado<br />
** diferencias significativas en los niveles hormonales (P < 0,05) entre grupos
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA 341<br />
AGRADECIMIENTOS<br />
Los autores agra<strong>de</strong>cen la colaboración en las <strong>de</strong>terminaciones analíticas <strong>de</strong> la Sra. Anna Ma. Puerta, que<br />
disfrutó <strong>de</strong> una beca <strong>de</strong> la CIRIT. Este trabajo fue financiado parcialmente por la CEE, <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l proyecto<br />
EC-DG VI PL-900165.<br />
SUMMARY<br />
Quantification of abscisic acid, indoleacetic acid, zeatin, and zeatin ribosi<strong>de</strong> in<br />
<strong>de</strong>veloped leaves of different ages in Gerbera jamesonii cv. Bolus<br />
Procedures to quantify plant hormones have been <strong>de</strong>veloped for a wi<strong>de</strong> variety of tissues. However, few<br />
methods for measurement in fully <strong>de</strong>veloped leaves, which contain pigments and compounds that co-purify with<br />
hormones, have been established. Procedures for measuring abscisic (ABA) and indoleacetic acid (IAA) simultaneously,<br />
and zeatin plus zeatin ribosi<strong>de</strong> (Z+ZR) in fully <strong>de</strong>veloped leaves of Gerbera jamesonii cv. Bolus, are<br />
presented. The methods inclu<strong>de</strong> an initial liquid-liquid extraction step, a solid phase extraction, a HPLC purification,<br />
and a measurement using ELISA. This scheme is similar to others proposed for measurement of plant<br />
hormones in fully <strong>de</strong>veloped leaves using gas chromatography/mass spectrometry. The results showed no significant<br />
changes in ABA and IAA concentrations with leaf age. In contrast, for Z+ZR concentrations there were<br />
differences between young (7 days old) and adult leaves (21 days), but not between adult and old leaves (60<br />
days).<br />
KEY WORDS:<br />
ABA<br />
IAA<br />
Z+ZR<br />
Leaves<br />
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