GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

8. Distribuir rapidamente 100 µl da solução de trabalho conjugado 1 por todos os poços. O conjugado deve ser
agitado, antes da utilização.
Nota: a distribuição da solução de trabalho do conjugado 1, de cor amarela, pode ser verificada visualmente
nesta fase da manipulação.
9. Se possível, cobrir a microplaca com uma película nova. Incubar 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C ou a 40 ± 1°C
numa incubadora estática de calor seco.
10. Retirar a película adesiva. Aspirar o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados
(contendo hipocloreto de sódio) e adicionar imediatamente, em cada um deles, um mínimo de 0,370 ml de
solução de lavagem. Respeitar um tempo de imersão (tempo de espera) de 20 a 60 segundos. Aspirar de novo.
Repetir a lavagem 4 vezes (num mínimo de 5 lavagens). O volume residual deve ser inferior a 10 µl (se
necessário, secar a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente).
11. Distribuir rapidamente 100 µl da solução de trabalho conjugado 2 em todos os poços. O conjugado deve ser
agitado antes da utilização.
Nota: a distribuição da solução de trabalho do conjugado 2, de cor verde, pode ser verificada visualmente nesta
fase da manipulação.
12. Se possível, cobrir a microplaca com uma película nova. Incubar durante 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C ou a 40
± 1°C, numa incubadora estática de calor seco.
13. Retirar a película adesiva, esvaziar todos os poços por aspiração e lavar, pelo menos, 5 vezes como
anteriormente. O volume residual deve ser inferior a 10 µl (se necessário, secar as tiras por inversão sobre uma
folha de papel absorvente).
14. Distribuir rapidamente por todos os poços 100 µl da solução de revelação da actividade enzimática (R8 + R9),
anteriormente preparada. Deixar que a reacção se desenvolva no escuro durante 30 ± 5 minutos à temperatura
ambiente (18 a 30°C). Nesta incubação não utilizar película adesiva.
Nota: A distribuição da solução de revelação, de cor rosa, pode ser controlada visualmente nesta fase da
manipulação : observa-se uma diferença de coloração significativa entre um poço vazio e um poço contendo a
solução de revelação rosa (consultar o parágrafo 12 para a verificação automática, VERIFICAÇÃO
ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DOS REAGENTES).
15. Adicionar 100 µl da solução de paragem (R10), adoptando a mesma sequência e o mesmo ritmo de distribuição
que para a solução de revelação. Homogeneizar a mistura reaccional.
Nota : A distribuição da solução de paragem, que é incolor, pode ser controlada visualmente nesta fase da
manipulação. A coloração do substracto, rosa (para as amostras negativas) ou azul (para as amostras positivas)
desaparece dos poços, que assim se tornam incolores (para as amostras negativas), ou amarelos (para as
amostras positivas), após adição da solução de paragem.
16. Secar cuidadosamente a superfície inferior das placas. Pelo menos 4 minutos após a distribuição da solução de
paragem e nos 30 minutos que se seguem à paragem da reacção, proceder à leitura da densidade óptica a
450/620-700 nm por meio de um leitor de placas.
17. Antes da passar à transcrição dos resultados, garantir a concordância entre a leitura e o plano de distribuição
e de identificação das placas e das amostras.
11 - CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
1 - Validação do teste
Um teste é válido se forem verificados os critérios seguintes :
• Os valores de absorvência individuais dos controlos negativos (ou dos controlos de meio de cultura de células,
se for o caso), devem ser superiores a 0,000 UA e inferior ou iguais a 0,100 UA. Um dos valores de absorvência
de um poço do controlo negativo pode ser eliminado, se se situar fora destes padrões. A média dos controlos
negativos pode, neste caso, ser calculada a partir dos dois valores de absorvência restantes. Se dois ou mais
controlos negativos não respeitarem estes critérios, a quantificação deve ser efectuada de novo.
• As absorvências médias dos controlos positivos devem ser superiores ou iguais a 0,500 UA e o valor de
absorvência de cada controlo positivo deve situar-se dentro do domínio de reprodutibilidade de 0,65 a 1,35
vezes a média dos controlos positivos. Todos os valores de absorvência dos controlos positivos devem ser tidos
em conta.
2 - Cálculo da média das absorvências
A partir dos controlos validados, determinar as absorvências médias dos controlos negativos e positivos, dividindo
a soma dos seus valores de absorvência pelo número de controlos utilizados.
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