GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

10 - PROCEDIMENTO
70
Dois procedimentos para detecção do antigénio p24 do HIV-1 no soro ou no plasma humanos ou em
amostras de cultura celular são apresentados a seguir:
Procedime Incubação Conjugado 1 Conjugado 2 Revelação
nto Incubação Incubação colorimétrica
Incubação Incubação estática Incubação estática Incubação estática 18 to 30°C,
37°C, 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, no escuro
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Incubação Incubação estática Incubação estática Incubação estática 18 to 30°C,
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, no escuro
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Para as amostras originalmente testadas a 37 ou 40°C, deverá ser efectuado um novo teste ou uma nova
confirmação segundo o mesmo procedimento.
A duração indicativa deste teste é de, aproximadamente, 3 h 30 a 4 horas, a partir do início da primeira fase
de incubação. Cada ciclo do procedimento de utilização do teste deve ser efectuado integralmente e sem
interrupção, uma vez iniciado.
Dois controlos positivos e três controlos negativos devem ser realizados em cada placa. Em caso de teste
efectuado em amostras de células, três controlos negativos de meio de cultura celular serão necessários, em vez
do controlo negativo do dispositivo (C0). O valor de cut-off de reactividade para as amostras de doentes é
determinado em função dos sinais obtidos com os controlos, em cada placa individual.
Evitar que as placas fiquem expostas à luz durante a última etapa de incubação (após adição da solução de
trabalho TMB).
Seguir estritamente o protocolo proposto e aplicar as boas práticas de laboratório:
1. Estabelecer cuidadosamente o plano de distribuição e de identificação das amostras
2. Preparar a solução de lavagem diluída,
3. Retirar o tabuleiro de suporte e as tiras (R1) da embalagem de protecção
4. Depositar directamente, sem pré-lavagem da placa, em sucessão (sugestão do plano de distribuição da placa):
4.1 50 µl de diluente da amostra em cada poço
4.2 150 µl de controlo negativo (C0) em A1- B1- C1
4.3 150 µl de controlo positivo (C1) em D1-E1
4.4 150 µl de amostras em G1, etc. . .
Em caso de teste efectuado em amostras de células, três controlos negativos de meio de cultura celular serão
necessários, em vez do controlo negativo do dispositivo (C0). Assegurar que o diluente da amostra se encontra
devidamente misturado com a amostra (ou com o controlo).
Nota: a distribuição das amostras e do diluente de amostras pode ser controlada visualmente nesta fase da
manipulação: o diluente de amostras passa de verde a azul para assinalar que a amostra ou o controlo foi
devidamente adicionado nos poços. Quando as soluções contidas em cada poço se encontram correctamente
misturadas elas apresentam uma cor uniforme.
As amostras de cultura celular podem não mudar de cor, em função do meio de cultura utilizado.
(consultar o capítulo 12 para a verificação automática – VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO
DEPÓSITO DAS AMOSTRAS) .
5. Sempre que possível, cobrir com película adesiva, pressionando bem sobre toda a superfície para assegurar a
estanquicidade.
6. Incubar a placa durante 60 ± 5 minutos a 37 ± 1°C ou a 40 ± 1°C, por meio de uma incubadora estática de
calor seco.
7. Retirar a película adesiva. Aspirar o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados
(contendo hipocloreto de sódio) e adicionar imediatamente, em cada um deles, um mínimo de 0,370 ml de
solução de lavagem. Respeitar um tempo de imersão (tempo de espera) de 20 a 60 segundos. Aspirar de novo.
Repetir a lavagem 4 vezes (um mínimo de 5 lavagens). O volume resíduo deve ser inferior a 10 µl (se necessário,
secar a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente).
Se dispuser de um aparelho de lavagem automático, respeitar o mesmo ciclo operatório