GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

8. Distribuire rapidamente 100 µl della soluzione di lavoro coniugato 1 in tutti i pozzetti. Agitare il coniugato prima
dell'uso.
N.B. A questo stadio della manipolazione è possibile verificare visivamente la distribuzione della soluzione di
lavoro del coniugato 1 che presenta una colorazione gialla.
9. Se è possibile, coprire la micropiastra con una pellicola nuova. Incubare per 30 ± 5 minuti a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C in un incubatore statico a calore secco.
10. Togliere il film adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti contaminati (contenente
ipoclorito di sodio) e aggiungere immediatamente in ogni pozzetto un minimo di 0,370 ml di soluzione di
lavaggio. Rispettare un tempo di immersione (tempo di attesa) pari a 20 – 60 secondi. Aspirare nuovamente.
Ripetere il lavaggio 4 volte (effettuare almeno 5 lavaggi). Il volume residuo deve risultare inferiore a 10 µl (se
necessario, asciugare la piastra capovolgendola su un foglio di carta assorbente).
11. Distribuire rapidamente 100 µl della soluzione di lavoro coniugato 2 in tutti i pozzetti. Agitare il coniugato prima
dell'uso.
N.B. A questo stadio della manipolazione è possibile verificare visivamente la distribuzione della soluzione di
lavoro del coniugato 2 che presenta una colorazione verde.
12. Se è possibile, coprire la micropiastra con una pellicola nuova. Incubare per 30 ± 5 minuti a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C in un incubatore statico a calore secco.
13. Togliere la pellicola adesiva, svuotare tutti i pozzetti mediante aspirazione e lavare almeno 5 volte come in
precedenza. Il volume residuo deve risultare inferiore a 10 µl (se necessario, asciugare le strip capovolgendole
su un foglio di carta assorbente).
14. Dispensare rapidamente in tutti i pozzetti 100 µl di soluzione di rivelazione dell'attività enzimatica (R8 + R9)
preparata in precedenza. Lasciare che la reazione si sviluppi al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente
(18 - 30°C). Durante questa incubazione, non utilizzare alcun film adesivo.
N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di
rivelazione, che presenta una colorazione rosa. Vi è una differenza evidente tra la colorazione di un pozzetto
vuoto e quella di un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione rosa. (fare riferimento al paragrafo 12 per
la verifica automatica VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI).
15. Aggiungere 100 µl della soluzione di arresto (R10) seguendo la stessa sequenza e lo stesso ritmo di
distribuzione come per la soluzione di rivelazione. Omogeneizzare la miscela di reazione.
N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di
arresto, che è incolore. La colorazione del substrato, rosa (per i campioni negativi) o blu (per i campioni positivi),
scompare dai pozzetti che diventano incolori (per i campioni negativi) o gialli (per i campioni positivi) in seguito
ad addizione della soluzione di arresto.
16. Asciugare accuratamente la parte inferiore delle piastre. Attendere almeno 4 minuti dopo la distribuzione della
soluzione di arresto e leggere la densità ottica a 450/620-700 nm per mezzo di un lettore di piastre, entro i
30 minuti successivi all’arresto della reazione.
17. Verificare, prima della trascrizione dei risultati, la concordanza tra la lettura ed il piano di distribuzione e di
identificazione delle piastre e dei campioni.
11 - CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
1 - Convalida della prova
Un test è considerato valido se vengono rispettati e seguenti criteri :
• I singoli valori di assorbanza dei controlli negativi (o dei controlli dei terreni di coltura di cellule, secondo il caso)
devono essere superiori a 0,000 AU e inferiori o uguali a 0,100 AU. Qualora uno dei valori di assorbanza di
un pozzetto del controllo negativo risulti al di fuori di detti parametri, detto valore può essere eliminato. La media
dei controlli negativi in questo caso può essere calcolata a partire dai due rimanenti valori di assorbanza.
Qualora due o più controlli negativi non rispettino detti criteri, il dosaggio dovrà essere ripetuto.
• Le assorbanze medie dei controlli positivi devono risultare superiori o uguali a 0,500 AU e il valore di assorbanza
di ciascun controllo positivo deve porsi entro il range di riproducibilità pari a 0,65 – 1,35 volte la media dei
controlli positivi. Tutti i valori di assorbanza dei controlli positivi devono essere presi in considerazione.
2 - Calcolo della media delle assorbanze
A partire dai controlli validati, determinare le assorbanze medie dei controlli negativi e positivi dividendo la somma
dei loro valori di assorbanza per il numero di controlli utilizzati.
3 - Calcolo del valore-soglia
Il valore-soglia viene calcolato sommando un fattore costante (0,070) al valore di assorbanza media dei controlli
negativi (CNX).
Valore-soglia = 0,070 + CNX
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