GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

10 - PROCEDURA OPERATIVA
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Di seguito sono presentate due procedure per la rilevazione dell'antigene p24 dell'HIV nel siero o nel
plasma umani o in campioni di coltura cellulare :
Procedura Incubazione Coniugato 1 Coniugato 2 Rivelazione
Incubazione Incubazione colorimetrica
Incubazione Incubazione statica Incubazione statica Incubazione statica 18 to 30°C,
37°C , 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, al riparo dalla
caldo secco caldo secco caldo secco luce
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Incubazione Incubazione statica Incubazione statica Incubazione statica 18 to 30°C,
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, al riparo dalla
dry heat, dry heat, dry heat, luce
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Per i campioni testati originariamente a 37 o a 40°C, qualunque test ulteriore o qualsiasi conferma dovranno essere
eseguiti attenendosi alla stessa procedura.
La durata indicativa del presente test è di circa 3 h 30 – 4 ore a partire dall'inizio della prima fase di incubazione.
Ciascun ciclo della procedura di utilizzo del test deve essere eseguito integralmente e senza interruzioni una volta
iniziato.
Per ciascuna piastra devono essere eseguiti due controlli positivi e tre controlli negativi. Nel caso di test eseguiti su
campioni di cellule, sono necessari tre controlli negativi di terreno di coltura cellulare al posto del controllo negativo
del kit (C0). La soglia di reattività per i campioni dei pazienti è determinata in funzione delle indicazioni ottenute
con i controlli su ogni singola piastra.
Evitare l'esposizione delle piastre alla luce nel corso dell'ultima fase di incubazione (dopo l'aggiunta della soluzione
di lavoro TMB).
Attenersi strettamente al protocollo proposto e applicare le buone pratiche di laboratorio:
1. Stabilire accuratamente il piano di distribuzione e identificazione dei campioni.
2. Preparare la soluzione di lavaggio diluita.
3. Estrarre il telaio supporto e le strip (R1) dall'imballaggio di protezione.
4. Porre direttamente, senza prelavaggio della piastra, in successione (piano di distribuzione nella piastra
suggerito) :
4.1 50 µl di diluente per campione in ciascun pozzetto
4.2 150 µl di controllo negativo (C0) in A1 - B1 - C1
4.3 150 µl di controllo positivo (C0) in D1 - E1
4.4 150 µl di campione in G1, ecc. . .
Nel caso di test eseguito su campioni di cellule, sono necessari tre controlli negativi di terreno di coltura cellulare
al posto del controllo negativo del kit (C0). Accertarsi che il diluente per campioni sia ben mescolato con il
campione stesso (o con il controllo).
NB: a questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione dei campioni e del
diluente per campioni: il colore del diluente cambia dal verde al blu per indicare che il campione, o il controllo,
è stato effettivamente aggiunto nel pozzetto. Quando le soluzioni contenute in ciascun pozzetto sono ben
mescolate, assumono una colorazione uniforme.
I campioni di coltura cellulare possono non cambiare colore in funzione del terreno di coltura impiegato.
(Fare riferimento al paragrafo 12 per la verifica automatica – VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO
DEI CAMPIONI).
5. Laddove possibile, ricoprire con un film autoadesivo esercitando una pressione omogenea su tutta la superficie
per assicurarne l'ermeticità.
6. Incubare la piastra per 60 ± 5 minuti a 37 ± 1°C o a 40 ± 1°C con un incubatore statico a calore secco.
7. Togliere il film adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti contaminati (contenente
ipoclorito di sodio) e aggiungere immediatamente in ogni pozzetto un minimo di 0,370 ml di soluzione di
lavaggio. Rispettare un tempo di immersione (tempo di attesa) pari a 20 – 60 secondi. Aspirare nuovamente.
Ripetere il lavaggio 4 volte (effettuare almeno 5 lavaggi). Il volume residuo deve risultare inferiore a 10 µl (se
necessario, asciugare la piastra capovolgendola su un foglio di carta assorbente).
Se si dispone di un lavatore automatico, seguire lo stesso ciclo di operazioni.