GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

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SOMMARIO 1 - INTERESSE CLINICO 2 - PRINCIPIO DEL KIT GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA 3 - COMPOSIZIONE DEL KIT GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA 4 - MATERIALE NECESSARIO, MA NON FORNITO 5 - ISTRUZIONI PER L'IGIENE E LA SICUREZZA 6 - PRECAUZIONI 7 - CAMPIONI 8 - RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI 9 - VALIDITÀ - CONSERVAZIONE 10 - PROCEDURA OPERATIVA 11 - CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 12 - VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI 13 - PRESTAZIONI 14 - LIMITI DEL TEST 15 - BIBLIOGRAFIA 52
1 - INTERESSE CLINICO L'agente eziologico della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) è costituito da un retrovirus denominato Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV). Il virus HIV è stato isolato in pazienti affetti da AIDS e in individui sani appartenenti ad una popolazione a rischio di contrarre l'AIDS 1,2 . È noto che la trasmissione avviene per via sessuale, tramite l'impiego di aghi infetti, attraverso la trasfusione di prodotti ematici contaminati, e dalla madre infetta al feto o al neonato per via placentare 1,8 . In genere è possibile rilevare, nel sangue o nel plasma di un individuo esposto al virus, anticorpi specifici del virus stesso, che ne confermano pertanto l'esposizione. Nella fase precedente all'apparizione di anticorpi rilevabili, antigeni virali liberi si trovano già in circolo nel flusso ematico. Uno di tali antigeni virali è l'antigene p24 che corrisponde alla principale proteina della nucleocapside. I test per il monitoraggio dell'antigene dell'HIV possono essere utilizzati per rilevare la presenza di antigeni virali e quindi per diagnosticare un'infezione da HIV e questo già prima che abbia luogo la sieroconversione. Il periodo di antigenemia, che precede l'apparizione degli anticorpi anti-HIV, è variabile e può durare da alcuni giorni a qualche settimana negli individui infettati. Nella fase di sieroconversione, gli anticorpi specifici del virus formano dei complessi immuni con gli antigeni in circolo, con conseguente forte diminuzione dei tassi di antigeni liberi nel sangue ed eventuale completa sparizione di detti antigeni 9,11 . L'antigenemia può ripresentarsi in seguito, nella fase di sviluppo della malattia 12 . Il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA è destinato ad essere utilizzato come ausilio per la diagnosi e la prognosi dell'infezione da HIV-1. 2 - PRINCIPIO DEL KIT GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA Il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA è un test immunoenzimatico per la rilevazione in vitro dell'antigene p24 del capside del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) libero in campioni di siero, di plasma umano e di surnatante di coltura cellulare. Il test "Genetic Systems HIV-1 Antigen Confirmatory Assay" (codice 71121) è un test utilizzato in abbinamento con il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA per la conferma della presenza dell'antigene p24 dell'HIV in campioni in cui si è verificata una ripetizione della reattività. Il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA si basa sull'impiego di una fase solida preparata con anticorpi monoclonali anti-HIV-1 di topo, di un primo coniugato preparato con anticorpi biotinilati di pecora anti-p24 e di un secondo coniugato preparato con avidina legata alla perossidasi di rafano (HRP). L'esecuzione del test comprende le seguenti fasi di reazione: 1. I campioni da analizzare così come i sieri di controllo sono distribuiti nei loro rispettivi pozzetti nei quali sarà stato precedentemente aggiunto il diluente dei campioni. Se nel campione testato sono presenti antigeni HIV-1, questi si legano agli anticorpi che rivestono i pozzetti e vi rimangono fissati durante la fase di lavaggio che segue. Il deposito dei campioni viene confermato da un cambiamento di colore, dal verde al blu del diluente del campione. 2. Il coniugato 1 viene quindi aggiunto in ciascun pozzetto e poi incubato. Questo permette agli anticorpi biotinilati di pecora anti-p24 presenti nel coniugato 1 di legarsi ai complessi anticorpi-antigeni HIV-1 fissati sui pozzetti. Detti complessi antigeni-anticorpi rimangono fissati ai pozzetti durante la successiva fase di lavaggio. 3. Successivamente viene distribuito e poi incubato il coniugato 2. L'avidina del coniugato 2 si lega specificamente ai complessi anticorpi-antigeni HIV-1 legati ai pozzetti. L'eccesso non legato di coniugato viene eliminato mediante lavaggio. 4. La rivelazione della reazione avviene aggiungendo e poi incubando la soluzione di lavoro TMB. Proporzionalmente alla quantità di antigene HIV-1 presente nel campione, si sviluppa una colorazione blu o bluverde. La reazione colorimetrica si arresta per l'aggiunta di acido, che trasforma la colorazione dal blu-verde al giallo. La densità ottica dei campioni e dei controlli è determinata mediante spettrofotometria ad una lunghezza d'onda pari a 450/620-700 nm. 53
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