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8. 100 µl der Konjugat-Arbeitslösung 1 rasch in alle Vertiefungen geben.<br />
Vor der Verwendung muss das Konjugat vorsichtig geschüttelt werden.<br />
Bitte beachten : Die Probenverteilung der gelben Konjugat-Arbeitslösung 1 kann bei diesem Schritt optisch<br />
kontrolliert werden.<br />
9. Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken. Die Mikrotiterplatte in einem statischen<br />
Trockeninkubator bei 37 ± 1°C oder 40 ± 1°C 30 ± 5 Minuten inkubieren.<br />
10. Die Klebefolie entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit<br />
Natriumhypochlorid) absaugen. Mindestens 0,370 ml Waschlösung in jede Vertiefung geben. Die Mikrotiterplatte<br />
20 – 60 Sekunden stehen lassen. Anschließend Überstände absaugen. Dieses Verfahren viermal wiederholen<br />
(d. h. der Waschvorgang wird insgesamt fünfmal wiederholt). Die Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10<br />
µl betragen (ggf. die Mikroplatte umdrehen und auf einem Papiertuch ausklopfen ).<br />
11. 100 µl der Konjugat-Arbeitslösung 2 rasch in alle Vertiefungen geben.<br />
Vor der Verwendung muss das Konjugat vorsichtig geschüttelt werden.<br />
Bitte beachten.: Die Probenverteilung der grünen Konjugat-Arbeitslösung 2 kann bei diesem Schritt optisch<br />
kontrolliert werden.<br />
12. Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken. Die Mikrotiterplatte in einem statischen<br />
Trockeninkubator bei 37 ± 1°C oder 40 ± 1°C 30 ± 5 Minuten inkubieren.<br />
13. Die Folie entfernen, den Inhalt aller Vertiefungen absaugen und wie oben beschrieben fünfmal waschen. Die<br />
Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10 µl betragen (ggf. die Streifen umdrehen und auf einem Papiertuch<br />
ausklopfen ).<br />
14. 100 µl der frisch vor der Verwendung hergestellten Entwicklungslösung (R8+R9) schnell in alle Vertiefungen<br />
geben. Für die Entwicklung der Reaktion die Platte lichtgeschützt bei Raumtemperatur (18-30°C) 30 ± 5 Minuten<br />
stehen lassen. Während dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden.<br />
Bitte beachten.: Die Probenverteilung der pinkfarbenen Entwicklungslösung kann bei diesem Schritt optisch<br />
kontrolliert werden. Es gibt einen deutlichen Farbunterschied zwischen leeren Vertiefungen und Vertiefungen, die<br />
bereits pinkfarbene Substratlösung enthalten (siehe Abschnitt 12 für Informationen zur automatischen<br />
Überprüfung: SPEKTROPHOTOMETRISCHE ÜBERPRÜFUNG DER PROBEN- UND REAGENZPIPETTIERUNG).<br />
15. 100 µl Stopplösung (R10) in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Verteilungsmenge wie die<br />
Substratlösung zusetzen. Die Reaktionsmischung homogenisieren.<br />
Bitte beachten.: Die Verteilung der farblosen Stopplösung kann bei diesem Schritt optisch kontrolliert werden.<br />
Nach Zugabe der Stopplösung verschwindet die pinke Verfärbung der Substratlösung (bei negativen Proben) bzw.<br />
wird blau bis gelb (bei positiven Proben).<br />
16. Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Bis zum Ablesen des Ergebnisses. mindestens 4 Minuten nach Zugabe<br />
der Stopplösung abwarten, die optische Dichte jedoch innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion mit<br />
einem Plattenleser bei 450/620-700 nm ablesen.<br />
17. Alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmung zwischen den Werten und der Probenverteilung prüfen.<br />
11 - BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE<br />
1) Validierung der Ergebnisse<br />
Eine Messreihe ist nur dann gültig, wenn die folgenden Kriterien erfüllt werden:<br />
• Die Extinktion jeder Negativkontrolle (NK) (bzw. Zellkulturkontrolle) muss größer als 0,000 und kleiner als oder<br />
gleich 0,100sein. Ein Wert einer Negativkontrolle kann verworfen und der Mittelwert der Negativkontrollen aus<br />
den übrigen beiden Werten berechnet werden. Der Mittelwert der Negativkontrolle kann aus den übrigen beiden<br />
Extinktionswerten berechnet werden. Liegen zwei oder mehr Negativkontrollwerte außerhalb des angegebenen<br />
Bereiches, ist die Platte nicht auswertbar und der Test muss wiederholt werden.<br />
• Der Mittelwert der Extinktionen der Positivkontrollen (PKX) muss größer oder gleich 0,500 und die einzelnen<br />
Extinktionswerte innerhalb des Reproduzierbarkeitsbereiches von 0,65 – 1,35 mal PKX sein. Keine Werte der<br />
Positivkontrollen dürfen verworfen werden.<br />
2) Berechnung der Mittelwerte der Extinktionen<br />
Von den validierten Kontrollen die Mittelwerte der Negativ- und Positivkontrollen bestimmen, indem die Summe ihrer<br />
Extinktionen durch die Anzahl der eingehenden Werte geteilt wird.<br />
3) Grenzwert<br />
Den Grenzwert durch Addieren von 0,070 zum Mittelwert der Negativkontrollen (NKX) berechnen (siehe folgendes<br />
Beispiel) :<br />
NKX = 0,033<br />
Grenzwert = 0,070 +0,033 = 0,103<br />
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