GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

10 - TESTDURCHFÜHRUNG
Nachfolgend sind zwei Verfahren zum Nachweis des HIV-1 p24-Antigens in Humanserum, -plasma oder
Zellkulturproben beschrieben:
Testablauf Inkubation Inkubation Inkubation Farbentwicklung
der Probe von Konjugat 1 von Konjugat 2
Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation
37°C 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, 18 à 30°C,
Trockenhitze Trockenhitze Trockenhitze (lichtgeschützt)
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Inkubation bei Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 18 à 30°C,
Trockenhitze, Trockenhitze, Trockenhitze, (lichtgeschützt)
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Proben, die bei 37°C oder 40°C inkubiert wurden, müssen bei der Testwiederholung unter den gleichen
Bedingungen getestet werden.
Bei diesem Verfahren beträgt die zu erwartende Testdauer ca. 3,0 – 3,5 Stunden ab dem Beginn des ersten
Inkubationsschrittes. Jede Messreihe des Assays muss nach dem Beginn ohne Unterbrechung bis zum Ende
durchgeführt werden.
Auf jeder Platte müssen zwei positive und drei negative Kontrollen mitgetestet werden. Anstatt der Negativen
Kontrolle (C0) des Kits sind für die Analyse von Zellkulturproben drei Zellkulturkontrollen erforderlich. Der Grenzwert
für Patientenproben wird durch die Kontrollen jeder einzelnen Platte bestimmt.
Die Platten während des letzten Inkubationsschrittes (nach Zugabe der TMB-Arbeitslösung) keiner direkten
Lichteinwirkung aussetzen.
Befolgen Sie strikt das Verfahren und beachten Sie die folgenden GLP-Richtlinien:
1. Probenverteilung und Identifikationsplan sorgfältig festlegen.
2. Verdünnte Waschlösung vorbereiten.
3. Den Rahmen und die Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen.
4. Folgende Komponenten werden direkt und aufeinander folgend hinzugefügt, ohne die Mikrotiterplatte vorher zu
reinigen:
4.1 50 µl Verdünnungsmittel in jede Vertiefung
4.2 150 µl negatives Kontrollserum (C0) in die Vertiefungen A1- B1 – C1
4.3 150 µl positives Kontrollserum (C1) in die Vertiefungen D1 - E1
4.4 150 µl Probe in die Vertiefungen G1, etc ...
Anstatt der Negativen Kontrolle des Kits sind für die Analyse von Zellkulturproben drei Zellkulturkontrollen
erforderlich. Stellen Sie sicher, dass das Probenverdünnungsmittel mit der Probe (oder Kontrolle) gründlich
gemischt ist.
Anmerkung : Die Probenverteilung kann bei diesem Schritt optisch kontrolliert werden: Nach Zugabe der Probe
ändert sich die Farbe des Probenverdünnungsmittels von grün nach blau. Damit wird bestätigt, dass Probe (oder
Kontrolle) in die Vertiefung pipettiert wurde. Bei korrekter Vermischung weisen die Vertiefungen eine einheitliche
Farbe auf. Zellkulturproben zeigen je nach verwendetem Zellkulturmedium keine Farbveränderung an.
(Siehe Abschnitt 12: SPEKTROPHOTOMETRISCHE ÜBERPRÜFUNG DER PROBENPIPETTIERUNG).
5. Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken. Die Folie fest auf die Platte drücken, um die Platte
dicht zu versiegeln.
6. Die Mikrotiterplatte in einem statischen Trockeninkubator bei 37 ± 1°C oder 40 ± 1°C
60 ± 5 Minuten inkubieren.
7. Die Klebefolie entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit
Natriumhypochlorid) absaugen. Mindestens 0,370 ml Waschlösung in jede Vertiefung geben. Die Mikrotiterplatte
20 – 60 Sekunden stehen lassen. Anschließend Überstände absaugen. Dieses Verfahren viermal wiederholen (d.
h. der Waschvorgang wird insgesamt fünfmal wiederholt). Die Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10 µl
betragen (ggf. die Mikrotiterplatte umdrehen und auf einem Papiertuch ausklopfen ).
Wird eine automatische Waschvorrichtung benutzt, ist die Vorgehensweise die gleiche (siehe Abschnitt 10 :
Empfehlungen).
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