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10 - TESTDURCHFÜHRUNG<br />
Nachfolgend sind zwei Verfahren zum Nachweis des <strong>HIV</strong>-1 p24-Antigens in Humanserum, -plasma oder<br />
Zellkulturproben beschrieben:<br />
Testablauf Inkubation Inkubation Inkubation Farbentwicklung<br />
der Probe von Konjugat 1 von Konjugat 2<br />
Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation<br />
37°C 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, 18 à 30°C,<br />
Trockenhitze Trockenhitze Trockenhitze (lichtgeschützt)<br />
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.<br />
Inkubation bei Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation<br />
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 18 à 30°C,<br />
Trockenhitze, Trockenhitze, Trockenhitze, (lichtgeschützt)<br />
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.<br />
Proben, die bei 37°C oder 40°C inkubiert wurden, müssen bei der Testwiederholung unter den gleichen<br />
Bedingungen getestet werden.<br />
Bei diesem Verfahren beträgt die zu erwartende Testdauer ca. 3,0 – 3,5 Stunden ab dem Beginn des ersten<br />
Inkubationsschrittes. Jede Messreihe des Assays muss nach dem Beginn ohne Unterbrechung bis zum Ende<br />
durchgeführt werden.<br />
Auf jeder Platte müssen zwei positive und drei negative Kontrollen mitgetestet werden. Anstatt der Negativen<br />
Kontrolle (C0) des Kits sind für die Analyse von Zellkulturproben drei Zellkulturkontrollen erforderlich. Der Grenzwert<br />
für Patientenproben wird durch die Kontrollen jeder einzelnen Platte bestimmt.<br />
Die Platten während des letzten Inkubationsschrittes (nach Zugabe der TMB-Arbeitslösung) keiner direkten<br />
Lichteinwirkung aussetzen.<br />
Befolgen Sie strikt das Verfahren und beachten Sie die folgenden GLP-Richtlinien:<br />
1. Probenverteilung und Identifikationsplan sorgfältig festlegen.<br />
2. Verdünnte Waschlösung vorbereiten.<br />
3. Den Rahmen und die Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen.<br />
4. Folgende Komponenten werden direkt und aufeinander folgend hinzugefügt, ohne die Mikrotiterplatte vorher zu<br />
reinigen:<br />
4.1 50 µl Verdünnungsmittel in jede Vertiefung<br />
4.2 150 µl negatives Kontrollserum (C0) in die Vertiefungen A1- B1 – C1<br />
4.3 150 µl positives Kontrollserum (C1) in die Vertiefungen D1 - E1<br />
4.4 150 µl Probe in die Vertiefungen G1, etc ...<br />
Anstatt der Negativen Kontrolle des Kits sind für die Analyse von Zellkulturproben drei Zellkulturkontrollen<br />
erforderlich. Stellen Sie sicher, dass das Probenverdünnungsmittel mit der Probe (oder Kontrolle) gründlich<br />
gemischt ist.<br />
Anmerkung : Die Probenverteilung kann bei diesem Schritt optisch kontrolliert werden: Nach Zugabe der Probe<br />
ändert sich die Farbe des Probenverdünnungsmittels von grün nach blau. Damit wird bestätigt, dass Probe (oder<br />
Kontrolle) in die Vertiefung pipettiert wurde. Bei korrekter Vermischung weisen die Vertiefungen eine einheitliche<br />
Farbe auf. Zellkulturproben zeigen je nach verwendetem Zellkulturmedium keine Farbveränderung an.<br />
(Siehe Abschnitt 12: SPEKTROPHOTOMETRISCHE ÜBERPRÜFUNG DER PROBENPIPETTIERUNG).<br />
5. Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken. Die Folie fest auf die Platte drücken, um die Platte<br />
dicht zu versiegeln.<br />
6. Die Mikrotiterplatte in einem statischen Trockeninkubator bei 37 ± 1°C oder 40 ± 1°C<br />
60 ± 5 Minuten inkubieren.<br />
7. Die Klebefolie entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit<br />
Natriumhypochlorid) absaugen. Mindestens 0,370 ml Waschlösung in jede Vertiefung geben. Die Mikrotiterplatte<br />
20 – 60 Sekunden stehen lassen. Anschließend Überstände absaugen. Dieses Verfahren viermal wiederholen (d.<br />
h. der Waschvorgang wird insgesamt fünfmal wiederholt). Die Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10 µl<br />
betragen (ggf. die Mikrotiterplatte umdrehen und auf einem Papiertuch ausklopfen ).<br />
Wird eine automatische Waschvorrichtung benutzt, ist die Vorgehensweise die gleiche (siehe Abschnitt 10 :<br />
Empfehlungen).<br />
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