GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

ha de agitar antes de su empleo.
N.B. La distribución de la solución de trabajo del conjugado 1 que está coloreada de color amarillo se puede
verificar visualmente en este estadio de la manipulación.
9. Si es posible, se recubre la microplaca con una nueva película. Se incuba 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C en una incubadora estática de calor seco.
10. Se retira la película adhesiva. Se aspira el contenido de todos las pocillos en un contenedor para desechos
contaminados (que contenga hipoclorito sódico) y se añade inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de
0,370 ml de solución de lavado. Se respeta un tiempo de remojo (tiempo de espera) de 20 a 60 segundos. Se
aspira de nuevo. Se repite el lavado 4 veces (un mínimo de 5 lavados). El volumen residual debe ser inferior a
10 µl (si es necesario, se secará la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente).
11. Se distribuyen rápidamente 100 µl de la solución de trabajo conjugado 2 en todos los pocillos. El conjugado se
debe agitar antes de su empleo.
N.B. La distribución de la solución de trabajo del conjugado 2 que está coloreada de verde se puede verificar
visualmente en este estadio de la manipulación
12. Si es posible, se recubre la microplaca con una nueva película. Se incuba 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C en una incubadora estática de calor seco.
13. Se retira la película adhesiva, se vacían todos los pocillos por aspiración y se lavan por lo menos 5 veces, como
anteriormente. El volumen residual debe ser inferior a 10 µl (si es necesario, se secan las tiras dándoles la vuelta
sobre una hoja de papel absorbente).
14. Distribuir rápidamente en todos los pocillos 100 µl de la solución de revelado de la actividad enzimática (R8
+ R9) previamente preparada. Dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a
temperatura ambiente (18 a 30°C). Durante esta incubación, no utilizar película adhesiva.
N.B.: La distribución de la solución de revelado, que presenta un color rosa, puede controlarse visualmente en
esta etapa de la manipulación: hay una diferencia de coloración significativa entre un pocillo vacío y un pocillo
que contiene la solución de revelado rosada (ver apartado 12 para la comprobación automática
COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS)
15. Añadir 100 µl de solución de parada (R10) manteniendo la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución
que para la solución de revelado. Homogeneizar la mezcla de reacción.
N.B.: La distribución de la solución de parada, que es incolora, puede controlarse visualmente en esta etapa de
la manipulación. La coloración del sustrato, rosa (en caso de muestras negativas) o azul (en caso de muestras
positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (si las muestras son negativas) o amarillos (si las
muestras son positivas) tras la adición de la solución de parada.
16. Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Esperar un mínimo de 4 minutos tras la distribución de la
solución de parada y, en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción, leer la densidad óptica a
450/620-700 nm con un lector de placas.
17. Antes de la transcripción de los resultados es preciso asegurarse de la concordancia entre la lectura y el plan de
distribución y de identificación de las placas y de las muestras.
11 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1) Validación del ensayo
Un test es válido si se cumplen los criterios siguientes:
• Los valores de absorbancia individuales de los controles negativos (o controles de medio de cultivo de células, si
llega el caso) deben ser superiores a 0,000 UA e inferiores o iguales a 0,100 UA. Uno de los valores de
absorbancia de uno pocillo del control negativo se puede eliminar si está situado fuera de estas normas. La media
de los controles negativos se puede calcular en este caso a partir de ambos valores restantes de absorbancia. Si
dos controles negativos o más no respetan estos criterios, la dosificación se debe efectuar de nuevo.
• Las absorbancias medias de los controles positivos deben ser superiores o iguales a 0,500 UA y el valor de absorbancia
de cada control positivo debe estar situado en el ámbito de reproducibilidad de 0,65 a 1,35 veces la media de los
controles positivos. Todos los valores de absorbancia de los controles positivos se deben tomar en consideración.
2) Cálculo de la media de las absorbancias
A partir de los controles validados, se determinan las absorbancias medias de los controles negativos y positivos
dividiendo la suma de sus valores de absorbancia por el número de controles utilizados.
3) Cálculo del valor umbral
El valor umbral se calcula sumando un factor constante (0,070) al valor de absorbancia media de los controles
negativos (CNX).
Valor umbral = 0,070 + CNX
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