GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

10 - MODO OPERATORIO
A continuación se presentan dos procedimientos para la detección del antígeno p24 del VIH-1 en el suero o en el
plasma humanos o en muestras de cultivo celular :
Procedimiento Incubación Conjugado 1 Conjugado 2 Revelado
incubación incubación colorimétrico
Incubación Incubación estática Incubación estática Incubación estática 18 à 30°C,
37°C 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, en la oscuridad
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Incubación Incubación estática Incubación estática Incubación estática 18 à 30°C,
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, en la oscuridad
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Para las muestras sometidas a un test en un principio a 37 o 40°C, todo nuevo test o toda confirmación deberán
efectuarse de acuerdo con el mismo procedimiento.
La duración indicativa de este test es de cerca de 3h 30 a 4 horas a partir del inicio de la primera etapa de
incubación. Cada ciclo del procedimiento de utilización del test debe efectuarse íntegramente y sin interrupción una
vez comenzado.
Sobre cada placa se deben realizar dos controles positivos y tres controles negativos. En caso de que el test sea
efectuado con muestras de células, son necesarios tres controles negativos de medio de cultivo celular, en lugar del
control negativo del estuche (C0). El umbral de reactividad para las muestras de pacientes se determina con arreglo
a las señales obtenidas con los controles de cada placa individual.
Se evitará la exposición a la luz de las placas durante la última etapa de incubación (después de añadir la solución
de trabajo TMB).
Se ha de seguir estrictamente el protocolo propuesto y aplicar las buenas prácticas de laboratorio:
1. Establecimiento cuidadoso del plan de distribución y de identificación de las muestras
2. Preparación de la solución diluida de lavado
3. Extracción del marco soporte y las tiras (R1) del embalaje protector
4. Disposición directa, sin lavado previo de la placa y sucesivamente (sugerencia de plan de distribución de la
placa) :
4.1 50 µl de disolvente de muestra en cada pocillo
4.2 150 µl de control negativo (C0) en A1-B1-C1
4.3 150 µl de control positivo (C1) en D1-E1
4.4 150 µl de muestra en G1, etc.
En caso de que el test se lleve a cabo con muestras de células, son necesarios tres controles negativos de medio
de cultivo celular en lugar del control negativo del estuche (C0). Es preciso asegurarse de que el disolvente de
muestra está bien mezclado con la muestra (o con el control).
NB: la distribución de las muestras y del disolvente de muestras se puede controlar visualmente en este estadio
de la manipulación: el disolvente de muestra cambia del verde al azul para señalar que la muestra o el control
han sido añadidos en el pozo. Cuando las soluciones contenidas en cada pozo están bien mezcladas, tienen
un color uniforme.
Puede que las muestras de cultivo celular no cambien de color con arreglo al medio de cultivo utilizado.
(para la comprobación automática es preciso referirse al capítulo 12 - VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA
DEL PIPETEADO DE LAS MUESTRAS).
5. Cuando sea posible, se cubrirá con una película autoadhesiva, procurando apretar bien toda la superficie para
asegurar la impermeabilidad.
6. Se incuba la placa durante 60 ± 5 minutos a 37 ± 1°C o a 40 ± 1°C con una incubadora estática de calor seco.
7. Se retira la película adhesiva. Se aspira el contenido de todos las pocillos en un contenedor para desechos
contaminados (que contenga hipoclorito sódico) y se añade inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de
0,370 ml de solución de lavado. Se respeta un tiempo de remojo (tiempo de espera) de 20 a 60 segundos. Se
aspira de nuevo. Se repite el lavado 4 veces (un mínimo de 5 lavados). El volumen residual debe ser inferior a
10 µl (si es necesario, se ha de secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente).
Si se dispone de un lavador automático, se ha de respetar el mismo ciclo operatorio
8. Se distribuyen rápidamente 100 µl de la solución de trabajo conjugado 1 en todos las pocillos. El conjugado se
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