GENETIC SYSTEMS™ HIV-1 Ag EIA

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tests 71120
English p. 3
Français p. 15
Espãgnol p. 27
Deutsch p. 39
Italiano p. 51
Portugese p. 63
Svensk p. 75
Dansk p. 85
"
Bio-Rad."

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tests 71120
ENZYME IMMUNOASSAY (EIA) FOR DETECTION OF HUMAN
IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I (HIV-1) P24 ANTIGEN
IN HUMAN SERUM, PLASMA AND CELL CULTURE SUPERNATANT
IVD For In Vitro Diagnostic Use
3
Manufacturer Quality Control
All manufactured and commercialised reagents are under complete quality system starting from
reception of raw material to the final commercialisation of the product.
Each lot is submitted to a quality control and only is released on the market when conforming to the
acceptance criteria.
The records relating to production and control of each single lot are kept within our company

CONTENTS
1 - CLINICAL VALUE
2 - PRINCIPLE OF THE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - CONTENTS OF THE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
4 - MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
5 - HEALTH AND SAFETY INSTRUCTIONS
6 - PRECAUTIONS
7 - COLLECTION AND HANDLING OF SPECIMENS
8 - RECONSTITUTION OF THE REAGENTS
9 - STORAGE CONDITIONS - SHELF LIFE
10 - ASSAY PROCEDURE
11 - CALCULATION AND INTERPRETATION OF THE RESULTS
12 - SPECTROPHOTOMETRIC VERIFICATION OF SAMPLE AND REAGENT PIPETTING
13 - PERFORMANCES
14 - LIMITS OF THE TEST
15 - REFERENCES
4

1 - CLINICAL VALUE
The etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is a retrovirus which has been named Human
Immunodeficiency Virus (HIV). HIV has been isolated from patients with AIDS and from healthy persons at high risk
for AIDS 1,2 . Transmission is known to occur by intimate sexual contact, through the use of contaminated needles, by
transfusions of contaminated blood products, and perinatally from infected mother to fetus or child. 1-8
Evidence of previous exposure to HIV is usually demonstrated by the presence of virus-specific antibody in an
individual's serum or plasma after exposure to the virus. Prior to the appearance of detectable antibodies, there is
an early period of time when free viral antigens circulate in the blood. One of these viral antigens is the major viral
core protein, p24. HIV antigen assays can be used to detect the presence of viral antigens, and thus HIV infection,
prior to seroconversion. The antigenemic period preceding the appearance of HIV antibodies is variable and can
last for days or weeks in infected individuals. As an individual seroconverts, virus specific antibodies complex with
the circulating antigens such that the levels of free antigens in the blood drop or disappear entirely. 9-11 Antigenemia
may develop again later as the disease progresses. 12
The GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA is intended to be used as a screen for donated blood and plasma and
as an aid in the diagnosis and prognosis of HIV-1 infection.
2 - PRINCIPLE OF THE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
The Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA is an enzyme immunoassay for the detection of HIV-1 core antigen (p24)
in human serum and plasma specimens. The «GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen Confirmatory» Test (code 71121)
is a supplemental assay used with the HIV-1 Antigen EIA to confirm the presence of HIV p24 antigen in repeatedly
reactive samples.
The GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA is based upon the use of a solid phase prepared with mouse
monoclonal antibody to HIV-1 Antigen, of a first conjugate prepared with biotinylated sheep anti-p24 antibody and
a second conjugate prepared with avidin coupled to peroxidase of Raifort.
The performance of the test includes the following reaction steps :
1. Specimen Diluent is added to each well. The samples to be tested and the control sera are added to their
respective wells. If HIV-1 Ag is present in the specimen, it will bind to the antibodies coated on the well. Any HIV-1
Ag bound to the well will remain during the subsequent washing.
The color of the Specimen Diluent changes from green to blue to confirm that a sample (or control) has been added
to the well.
2. Conjugate 1 is then added to each well and the wells are incubated. This allows the biotinylated sheep anti-p24
antibody in Conjugate 1 to bind to any HIV-1 Ag that is bound to the well. The antigen-antibody complexes remain
bound during the subsequent wash step.
3. Conjugate 2 is then added to the wells and allowed to incubate. The avidin in Conjugate 2 binds specifically to
the antibody-HIV-1 Ag complexes that are bound to the well. Any unbound conjugate is removed by washing.
4. Working TMB Solution is added to the plate and allowed to incubate. A blue or blue-green color develops in
proportion to the amount of HIV-1 Ag present in the sample. Color development is stopped by the addition of acid,
which changes the blue-green color to yellow. The optical absorbance of specimens and controls is determined
spectrophotometrically at a wavelength of 450/620-700 nm.
5

3 - CONTENTS OF THE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
6
LABEL TYPE OF THE REAGENT PRESENTATION
71120
R1 Microplate 2 plates
12 strips of 8 wells coated with murine monoclonal antibodies to HIV-1 p24
Preservative : ProClin 300, Sodium azide (< 0.1%)
R2 Concentrated Washing Solution (10x) 1 vial
Buffer Tris NaCl pH 7.4
250 ml
Preservative : 0.01 % Sodium merthiolate
R3 Specimen Diluent 1 vial
Preservative : 0.5% ProClin 300
20 ml
Sample addition dye (green)
CO Negative Control Serum (Human) 1 vial
Normal human serum non reactive for HIV antigen, HBs Ag, and antibodies 10 ml
and antibodies to HIV-1, HIV-2, HCV, and HTLV-1 0.005% Gentamicin sulfate
Preservative : 0.5% ProClin 300
C1 Positive Control Serum 1 vial
Purified, disrupled HIV-1 antigen
7 ml
Preservative : 0.5 % ProClin 300
R4 Concentrated conjugate 1 (100 x) 1 vial
Sheep anti-p24 conjugate 0.005 % Gentamicin sulfate
1 ml
Yellow dye - Preservative : 0.5 % ProClin 300
R5 Concentrated conjugate 2 (100 x) 1 vial
Avidin-HRP conjugate 0.005% Gentamicin sulfate
1 ml
Green dye - Preservative : 0.5% ProClin 300
R6 Conjugate Diluent 1 vial
Buffer with protein stabilisers
100 ml
Preservative : 0.5% ProClin 300
R8 Substrate Buffer 1 vial
Citric acid/Sodium acetate buffer pH 4.0
60 ml
Hydrogen peroxide 0.015% Dimethylsulfaxide (DMSO) 4%
R9 Chromogen 1 vial
Tetramethylfaxide (TMB)
5 ml
R10 Stopping Solution 2 vials
1N H 2 SO 4
2 x 28 ml
Plate Sealers
25 sealers each
4 - MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
• Distilled water
• Household bleach (5% to 8% sodium hypochlorite) which may be diluted to a minimum concentration of 10%
bleach (or 0.5% sodium hypochlorite). Alternative disinfectants include : 70% ethanol or 0.5% Wescodyne
(West Chemical Products, Inc.).
• Precision pipettes to deliver volumes from 10 µl to 200 µl, 1 ml, 5 ml, and 10 ml (accurate within ± 10%).
A multichannel pipettor capable of delivering 100 µl or 200 µl is optional.
• Graduated cylinders of 25 ml, 100 ml, 1000 ml.
• Container for contaminated residues.
• Water bath or dry incubator*, thermostatically set at 37±1°C or 40±1°C.
• Manual, semiautomatic or automatic microplate washer (*).
• Microplate reader equipped with 450 nm and 620- 700 nm filters (*).
• Null strips for testing partial on automate.
• EIA reagent reservoirs (optional).

• Disposable gloves
• Absorbent paper
• Clean plastic containers (either polystyrene or polypropylene) for preparation of Working Conjugate Solutions and
TMB Solution.
• Cell Culture Medium, e.g. RPMI-1640 containing 10% fetal calf serum, equivalent to that used for infected cell
culture (when testing cell culture samples).
(*) Consult us for detailed information about the equipment recommended by our technical department.
5 - HEALTH AND SAFETY INSTRUCTIONS
All the reagents included in the kit are intended for «in vitro» diagnostic use.
• Wear disposable gloves when handling reagents and samples and thoroughly wash your hands after having
handled them.
• Do not pipette by mouth.
• Human source material used in the preparation of the negative control was tested and found non reactive for HIV-
1 antigen, anti-HIV1 and anti-HIV2 antibodies, hepatitis B antigen (HB Ag), anti-HCV antibodies, anti HTLV1/HTLV 2
antibodies and anti HIV1/HIV2.
• The positive control is heat inactivated by dissociating agent.
• Because no known test method can offer complete assurance that the HIV, Hepatitis B or C virus or other infectious
agents are absent, consider these reagents, as well as patient samples, as potentially infectious and handle them
carefully.
• Any equipment directly in contact with samples and human source reagents as well as buffer solutions should be
considered as contaminated products and treated accordingly.
• Avoid spilling samples or solutions containing samples.
• Contaminated surfaces should be cleaned 10% diluted bleach. If the contaminating fluid is an acid, the
contaminated surfaces should be first neutralized with sodium bicarbonate, then cleaned with bleach, and dried
with absorbent paper. The material used for cleaning should be discarded into a biohazardous waste container.
• Samples, human source reagents, as well as contaminated material and products should be discarded after
decontamination :
- either by soaking into bleach at a final concentration of 5% sodium hypochlorite (1 volume of bleach per
10 volumes of contaminated fluid or water) for 30 minutes
- or by autoclaving at 121°C for 2 hours minimum.
Autoclaving is the best method to inactivate HIV and HBV.
CAUTION : DO NOT PLACE SOLUTIONS CONTAINING SODIUM HYPOCHLORITE IN THE AUTOCLAVE
• The Safety Data Sheet is available upon request.
• Avoid any contact of the substrate buffer, the chromogen and the stopping solution with the skin and mucosa
(toxicity, irritation or burn hazard).
• Do not forget to neutralize and/or autoclave the wash waste solutions or any fluid containing biological samples
before discarding them into the sink.
• Chemicals should be handled and discarded in accordance with Good Laboratory Practices.
• Some reagents contain sodium azide as a preservative. Sodium azide may form copper or lead azides in
laboratory plumbing. Such azides are explosive. To prevent azide built-up, flush the pipes with a large amount of
water if solutions containing azide are discarded into the sink after inactivation.
• Some reagents contain 0.5% ProClin 300
ProClin 300 0.5% : Irritant
R43 : May cause sensitisation by skin contact
S28-37 : After contact with skin, wash immediatly with plenty of soap and water.
Wear suitable gloves.
Xi - Irritant
6 - PRECAUTIONS
The reliability of results depends on correct observance of the following Good Laboratory Practices:
• Do not use expired reagents.
• Do not change the assay procedure.
• Carefully reconstitute reagents avoiding any contamination.
• Do not mix reagents from different lots within a given test run.
7

Remark : For washing solution (R2, label identification : 10 x coloured blue), peroxidase substrate buffer (R8,
label identification : TMB buf, coloured blue), chromogen (R9, label identification : TMB 11x, coloured purple)
and stopping solution (R10, label identification : 1N coloured red), it is possible to use other lots than those
contained in the kit, provided the same lot is used within a given test run. These reagents can be used with
some other products of our company. Contact our technical service for detailed information.
• Before use, it is required to wait 30 minutes to allow the reagents stabilizing at room temperature (18-30°C).
• Do not carry out the test in the presence of reactive vapours (acid, alkaline, aldehyde vapours) or dust that could
alter the enzymatic activity of the conjugate.
• Use glassware thoroughly washed and rinsed with distilled water or preferably, disposable material.
• Do not allow the micoplate to dry between the end of the washing operation and the reagent distribution.
• Use a new dispensing tip for each sample.
• Check pipettes for accuracy and precision and if the instruments being used are correctly working.
• Washing : Carefully follow the washing procedures described to obtain mawimum test performance.
• Never use the same container to dispense conjugate and color development solution.
• The enzyme reaction is very sensitive to metal ions. Consequently, do not allow any metal element to come into
contact with the various conjugate or substrate solutions.
• The development solution (substrate buffer + chromogen) must be coloured pink. The modification of this pink
colour within a few minutes after reconstitution indicates that the reagent cannot be used and must be replaced.
Preparation of the development solution can be made in a clean disposable single use plastic tray or glass
container that has first been pre-washed with 1N HCl and rinsed thoroughly with distilled water and dried. This
reagent must be stored in the dark.
7 - COLLECTION AND HANDLING OF SPECIMENS
Collect a blood sample according to the current practices.
Serum, plasma, or cell culture samples may be used. The following anticoagulants have been evaluated and found
to be acceptable: EDTA, heparin, sodium citrate, CPDA-1, and ACD. Samples which are collected into anticoagulant
tubes should completely fill the tube as labeling indicates to avoid improper dilution.
Remove the serum or plasma from the clot or red cells as soon as possible to avoid hemolysis. Extensive hemolysis
may affects test performance. Specimens with observable particulate matter should be clarified by centrifugation
prior to testing. Suspended fibrine aggregates or particles may produce falsely positive results.
Cell culture samples that require dilution prior to testing may be diluted with cell culture medium that is equivalent to
that used to culture the cells.
DO NOT USE HEAT-INACTIVATED SPECIMENS.
The samples should be stored at +2-8°C if the screening is carried out within 7 days or deep-frozen at –20°C. The
plasma must be quickly thawed by warming for a few minutes in a water bath at 40°C (to avoid fibrin precipitation).
Given HIV Ag instability, temperatures over 40°C cannot be used.
Samples that have been frozen and defrozen more than 3 times cannot be used.
If the specimens are to be shipped, they must be packaged in accordance with the regulations in force regarding
the transport of aetiological agents.
DO NOT USE CONTAMINATED, HYPERLIPAEMIC OR HYPEHAEMOLYSED SERA OR PLASMA.
Remark : Samples containing up to 80 mg/l bilirubin, 36 mg/l Immunoglobulin M or G, lipemic samples containing
up to the equivalent of 5 g/l lipides, and hemolyzed samples containing up to 5 g/l hemoglobin do not affect the
results.
8 - RECONSTITUTION OF THE REAGENTS
Note : Before use, allow reagents to reach room temperature (18-30°C) except concentrated conjugate 1 and 2 (R4
and R5).
Reagent R1 : Microplate
Each tray containing 12 strips is wrapped in a sealed foil-lined bag. Cut the bag with scissors or a scalpel 0.5 – 1
cm above the line. Open the bag and remove the tray. Return unused strips in the bag. Re-seal the bag and return
to +2-8°C.
Reagent R3 : Specimen Diluent
Reagent C0 : Negative Control Serum
Reagent C1 : Positive Control Serum
Reagent R10 : Stopping Solution
8

Reagents to be reconstituted
Washing Solution (X10) (R2) : Dilute the washing solution R2 1 : 10 in distilled water. Homogenize.
NOTE : GENETIC SYSTEMS EIA Wash Solution Concentrate (30X), a component of other GENETIC SYSTEMS test
kits, may also be used in this assay. Dilute 1 part concentrate to 29 parts water.
Working Conjugate Solution 1 (R4 + R6) and Working Conjugate Solution 2 (R5 + R6) :
Conjugates 1 (R4) and 2 (R5) are supplied as 100X concentrates. Prepare separate Working Conjugate Solution 1
and Working Conjugate Solution 2 by diluting each conjugate 1 :101 in Conjugate Diluent (R6). Prepare in clean,
plastic containers. Note Conjugate Concentrate lot number, date and time of preparation, and date and time of
expiration (24 hours from preparation) on container. Mix Working Reagents gently prior to use. After mixing,
Working Conjugate Solution 1 is yellow and Working Conjugate Solution 2 is green.
Preparation of Working Conjugate Solution 1 or 2 by Strip
Number of Strips 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
to be used
Amount of Conjugate 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
Concentrate (µl)
Amount of Conjugate 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
Diluent (ml)
* One complete plate; **Two complete plates
Enzyme development solution (R8 + R9)
Dilute 1 :11 the chromogen (R9) in the substrate buffer (R8). (ex : 1 ml reagent R9 +10 ml reagent R8). 10 ml are
necessary and sufficient for 1 to 12 strips. Homogenize.
9 - STORAGE CONDITIONS - SHELF LIFE
The kit should be stored at +2-8°C. Each reagent contained in the GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA kit can be
used after a first opening until the expiry date mentioned on the package except specific instruction :
R1 : After the vacuum-sealed bag has been opened, the microwell strips stored at +2-8°C in the carefully reclosed
bag remain stable for 1 month
R2 : The diluted washing solution stored at +2-8°C remains stable for 14 days in a plastic container.
R8 - R9 : After the reconstitution, the reagent stored in the dark remain stable for 6 hours at room temperature
(18-30°C).
R4 - R5 : After the reconstitution, the working conjugate solutions remain stable for 24 hours at room temperature
(18-30°C).
10 - ASSAY PROCEDURE
Two procedures for the detection of HIV-1 p24 Antigen in human serum or plasma, or cell culture samples,
are described below :
Procedure Specimen Conjugate 1 Conjugate 2 Color
Incubation Incubation Incubation Development
37°C Static incubation Static incubation, Static incubation, Static incubation
incubation, 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, 18 to 30°C,
dry heat, dry heat, dry heat, in the dark
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
40°C Static incubation, Static incubation, Static incubation, Static incubation,
incubation 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 37±1°C,
dry heat, dry heat, dry heat, dry heat,
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
For samples that are originally tested at either 37°C or 40°C, any repeat testing or confirmation must be tested using
the same procedure.
The expected run time for this procedure is approximately 3.5-4.0 hours from initiation of the first incubation step.
Each run of this assay must proceed to completion without interruption after it has been started.
Two Positive Controls and three Negative Controls must be run on each plate. Three cell culture medium controls are
necessary instead of the kit Negative Control (C0) when testing cell culture samples. The cutoff for patient samples
is determined by the controls on each individual plate.
Avoid exposure of the plates to light during the final incubation step (following the addition of the Working TMB
Solution).
9

10
Strictly follow the proposed procedure and apply the following Good Laboratory Practice :
1. Carefully establish the sample distribution and identification plan
2. Prepare the dilute washing solution,
3. Take the carrier tray and the strips (R1) out of the protective pouch,
4. Apply directly, without prior washing of the plate and in succession :
4.1 50 µl of diluent in each well
4.2 150 µl of negative control serum (C0) in well A1- B1 – C1
4.3 150 µl of positive control serum (C1) in wells D1- E1
4.4 150 µl of specimens in wells G1, etc...
Three cell cuture medium controls are necessary instead of the kit Negative Control when testing cell culture
samples. Ensure that the Sample Diluent is well mixed with the specimen (or control).
N.B : The sample distribution can be visually controlled at this step of the manipulation : after adding the sample,
the diluent turns from green to blue to assure that the sample or control has been added to the well. When
properly mixed, the contents of each well are a uniform color. Cell culture samples may not exhibit a color change
depending on which cell culture medium is used. (Refer to section 12 for automatic verification -
SPECTROPHOTOMETRIC VERIFICATION OF SAMPLE PIPETTING).
5. If possible cover the microplate with adhesive film. Press firmly all over the plate to ensure adequate tightness.
6. Incubate the plate for 60 ± 5 minutes at 37 ± 1°C or 40 ± 1°C using a dry-heat static incubator.
7. Remove the adhesive film. Aspirate the contents of all wells into a container for biohazardous waste (containing
sodium hypochlorite). Add into each well a minimum of 0.370 ml of washing solution. Respect a soak time for 20
to 60 seconds. Aspirate again. Repeat this procedure 4 times (i.e. a total of a minimum of 5 washes). The residual
volume must be lower than 10 µl (if necessary, dry the plate by turning it upside down on absorbent paper).
If an automatic washer is used, follow the same procedure (refer to section 10: recommendations)
8. Quickly distribute 100 µl of the Working Conjugate Solution 1 into all wells.
The conjugate must be shaken gently before use.
NB : The distribution of the Working Conjugate Solution 1 which is coloured yellow can be visually controlled
at this step of the manipulation.
9. If possible cover the microplate with adhesive film. Incubate the plate for 30 ± 5 minutes at 37 ± 1°C or
40 ± 1°C using a dry-heat static incubator.
10. Remove the adhesive film. Aspirate the contents of all wells into a container for biohazardous waste (containing
sodium hypochlorite). Add into each well a minimum of 0.370 ml of washing solution. Respect a soak time for 20
to 60 seconds. Aspirate again. Repeat this procedure 4 times (i.e. a total of a minimum of 5 washes). The residual
volume must be lower than 10 µl (if necessary, dry the plate by turning it upside down on absorbent paper).
11. Quickly distribute 100 µl of the Working Conjugate Solution 2 into all wells.
The conjugate must be shaken gently before use.
NB : The distribution of the Working Conjugate Solution 2 which is coloured green can be visually controlled at
this step of the manipulation.
12. If possible cover the microplate with adhesive film. Incubate the plate for 30 ± 5 minutes at 37 ± 1°C or 40
± 1°C using a dry-heat static incubator.
13. Remove the adhesive film, empty all wells by aspiration and wash a minimum of 5 times as described above. The
residual volume must be lower than 10 µl (if necessary, dry the strips by turning them upside down on absorbent
paper.)
14. Quickly dispense into each well 100 µl of prepared development solution (R8+R9), freshly prepared before use.
Allow the reaction to develop in the dark for 30 ± 5 minutes at room temperature (18 - 30°C). Do not use
adhesive film during this incubation.
N.B.: The distribution of the development solution, which is coloured pink, can be visually controlled at this step
of the manipulation : There is a clear difference of colouration between empty well and well containing the pink
substrate solution. (refer to section 12 for automatic verification : SPECTROPHOTOMETRIC VERIFICATION OF
SAMPLE AND REAGENT PIPETTING)
15. Add 100 µl stopping solution (R10) by using the same sequence and rate of distribution as for the substrate
solution. Homogenize the reaction mixture.
N.B.: The distribution of the stopping solution, which is not coloured, can be visually controlled at this step of the
manipulation. After the addition of the stopping solution the pink colouration of the substrate disappears (for the
negative samples) or turns from blue to yellow (for the positive samples).

16. Carefully wipe the plate bottom. At least 4 minutes after stopping solution addition and within 30 minutes of
stopping the reaction, read the optical density at 450/620-700 nm using a plate reader.
17. Check all results for agreement between the reading and the plate and sample distribution and identification plan.
11 - CALCULATION AND INTERPRETATION OF THE RESULTS
1 - Validation of results
A run is valid if the following criteria are met :
• The absorbance value of each Negative Control (NC) (or cell culture control, if applicable) is greater than 0.000
AU and less than or equal to 0.100 AU. One Negative Control value may be discarded and the mean of the
Negative Controls may be calculated from the two remaining values. The NC mean may be calculated from the
two remaining absorbance values. If two or more Negative Controls are out of limit, the plate is invalid and must
be repeated.
• The mean absorbance value of the Positive Controls (PCX) must be greater than or equal to 0.500 AU and the
individual absorbance values must be within a reproducibility range of 0.65 to 1.35 times the PCX. No Positive
Control values may be discarded.
2 - Calculation of the mean absorbances
From the validated controls, determine the mean absorbances for the Negative Controls and Positive Controls by
dividing the sum of their absorbance values by the number of acceptable controls.
3 - Cutoff Value
Determine the cutoff value by adding 0.070 to the NC mean (NCX) as shown in the example below :
NCX = 0.033
Cutoff Value = 0.070 + 0.033 = 0.103
4 - Interpretation of results
The presence or absence of HIV-1 antigen is determined by relating the absorbance value of the specimen to the
cutoff value.
Specimens with absorbance values that are

13 - PERFORMANCES
Sensitivity
• 138 patients infected by HIV at different stages (AIDS, ARC, others) have been tested and found positives with
the test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA.
• 20 well documented seroconversions panels were studied. The results obtained are comparable to those observed
with other HIV Ag assay.
• 55 cell culture supernatants of HIV 1 (53 group M and 2 group O) and the dilution panel «Ag VIH SFTS 96» have
been found positives with the GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA test except 2 dilutions of group O cell
culture supernatants.
- The 53 cell culture supernatants of the HIV-1 group M are composed of the following genotypes : 10 genotypes
of A, 10 of B, 9 of C, 5 of D, 11 of E, 2 of F, 2 of G, 1 of H, 2 of J, and 1 of N.
- The dilution panel «Ag VIH SFTS 96» includes the following genotypes : A, B, C, D, E, F, G, H genotypes from
the Group M and 1 from the group O.
Analytical Sensitivity
The sensitivity limit of the test has been evaluated on a range of dilutions prepared from the french national standard
(purified viral lysate of genotype B diluted in negative citrated plasma) and the BBI panel (PRA 801). The sensitivity
limit has been estimated at 8 pg/ml Ag HIV whatever protocol is.
The calibration curve obtained with HIV-1 Ag Standard (code 72217) calibrated sample is linear between 0 and
100 pg/ml
Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity evaluated on :
• 4038 blood donors has been estimated at 99.95%.
• 209 clinical patients has been estimated at 100%.
A panel of 105 patient samples has been tested. It is composed of samples :
• containing antibodies to HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubella, Toxoplasma Gondii, Treponema Pallidum, CMV
• containing auto-Ab, IgG, IgM rhumatoid factor
• from pregnant women, cirrhosis population, multiply transfused and patients reached of Systemic lupus erythematosus
Only one sample came from and patient reached of Systemic lupus erythematosus has been found reactive with the
Genetic Systems HIV-1 Ag EIA test but not confirmed with the confirmatory test.
Accuracy
The intra-assay reproductibility has been evaluated by testing 3 positive samples and one negative sample 30 times
in the same run.
The inter-assay reproductibility has been evaluated by testing testing 3 positive samples and one negative sample
during 5 days with 2 different technicians.
The coefficient of variation for positive samples was less than 10%.
14 - LIMITS OF THE TEST
• The GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA Procedure and the Interpretation of Results must be followed when
testing serum, plasma, or cell culture specimens for the presence of HIV-1 antigen. The user of this kit is advised
to read the package insert carefully prior to conducting the test. In particular, the test procedure must be carefully
followed for sample and reagent pipetting, plate washing, and timing of the incubation steps.
• A designation of reactive for HIV-1 antigen must not be based on a single reactive test result. Additional testing,
such as confirmatory testing, is required to establish the specificity of any specimen reactive by the screening
procedure.
• All highly sensitive immunoassays have a potential for non-specific reactions which can lead to false positive
results. The proportion of reactives that are false will depend on the sensitivity and specificity of the test kit.
• Negative results can occur if the quantity of marker present in the sample is too low for the detection limits of the
assay, or if the marker which is detected is not present during the stage of disease in which a sample is collected.
• The varaibility of HIV virus doesn’t allow to exclude the possibility of false negative results. No known test method
can offer complete assurance that the HIV virus is absent.
• Failure to add specimen or reagent as instructed in the procedure could result in a falsely negative test. Repeat
testing should be considered where there is clinical suspicion of infection or procedural error.
• An absorbance value of less than 0.000 AU indicates a procedural or instrument error and must be repeated.
• Factors that can affect the validity of results include failure to add the specimen to the well, inadequate washing
of microplate wells, failure to follow stated incubation times and temperatures, addition of wrong reagents to
12

wells, the presence of metals, or splashing of bleach into wells.
• Performances of the test have not been evaluated on post mortem samples or on biological fluid other than serum,
plasma or cell culture specimens.
• The sample diluent coloration may not change in presence of cell culture samples according to the cell culture
medium.
• Even the analytical sensitivity estimated at 8 pg/ml during the evaluations of this test, it may vary according to
the operating conditions and due to the variability inter-batch. Consequently, BIO-RAD guarantees only the
analytical sensibility below 15 pg/ml.
• The colorimetric method for the samples, conjugate and development solution deposition verification does not
allow to verify the accuracy of the dispensed volumes. This method only shows the presence of sample,
conjugate and development solution into wells. The rate of wrong answers with this method is closely linked to
the accuracy of the utilized system (cumulated coefficient of variation of dispensing and reading over 10%
significantly decrease the quality of the verification).
• In case of very poor washing efficiency after the conjugate incubation, the automatic verification of the
development solution pipetting (by reading OD of wells at 490 nm) may provide wrong results with OD above
0.100 in the absence of development solution. However this phenomena has not been observed during evaluation
on 939 tested samples.
15 - REFERENCES
See French version.
13

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tests 71120
TEST IMMUNOENZYMATIQUE (EIA) POUR LA DÉTECTION
DE L’ANTIGÈNE P24 DU VIRUS DE L’IMMUNODÉFICIENCE ACQUISE
HUMAINE DE TYPE 1 (VIH-1) DANS LE SÉRUM, LE PLASMA HUMAIN
ET LES SURNAGEANTS DE CULTURE CELLULAIRE
IVD
Contrôle de qualité du fabriquant
Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société BIO-RAD sont placés sous un système
d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des
produits finis.
Chaque lot du produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est
conforme aux critères d'acceptation.
La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par notre
société.
15

TABLE DES MATIÈRES
1 - INTÉRÊT CLINIQUE
2 - PRINCIPE DE LA TROUSSE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - COMPOSITION DE LA TROUSSE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
4 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
5 - CONSIGNES D’HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ
6 - PRÉCAUTIONS
7 - ÉCHANTILLONS
8 - RECONSTITUTION DES RÉACTIFS
9 - VALIDITÉ – CONSERVATION
10 - MODE OPÉRATOIRE
11 - CALCUL ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
12 - VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS
ET DES RÉACTIFS
13 - PERFORMANCES
14 - LIMITES DU TEST
15 - RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
16

1 - INTÉRÊT CLINIQUE
L’agent étiologique du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) est un rétrovirus que l’on a nommé Virus de
l’Immunodéficience Humaine (VIH). Le VIH a été isolé chez des patients atteints du SIDA et chez des individus sains
faisant partie d’une population à risque pour le SIDA 1, 2 . On sait que la transmission se fait par voie sexuelle, par
l’utilisation d’aiguilles contaminées, par transfusion de produits sanguins contaminés, et de la mère infectée au foetus
ou au nouveau-né par voie placentaire 1, 8 .
Il est normalement possible de détecter, dans le sang ou le plasma d’un individu ayant été exposé au virus, des
anticorps spécifiques du virus, confirmant ainsi l’exposition. Dans la phase qui précède l’apparition d’anticorps
détectables, des antigènes viraux libres sont déjà en circulation dans le sang. L’un de ces antigènes viraux est
l’antigène p24, qui correspond à la principale protéine de la nucléocapside.
Les tests de dépistage de l’antigène du VIH peuvent être utilisés pour détecter la présence d’antigènes viraux et donc
pour diagnostiquer une infection par le VIH, et ce avant que la séroconversion n’ait lieu.
La période d’antigénémie, qui précéde l’apparition des anticorps anti-VIH, est variable et peut durer de quelques
jours à quelques semaines chez les individus infectés. Lors de la séroconversion, les anticorps spécifiques du virus
forment des complexes immuns avec les antigènes circulants, avec pour conséquence une forte chute du taux
d’antigènes libres dans le sang et éventuellement la disparition complète de ces antigènes 9, 11 . L’antigénémie peut
réapparaître plus tard au cours de la progression de la maladie 12 .
Le test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen - EIA est destiné à être utilisé comme une aide au diagnostic et au
pronostic de l’infection par le VIH-1.
2 - PRINCIPE DE LA TROUSSE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
Le test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen - EIA est un test immunoenzymatique pour la détection in vitro de
l’antigène p24 de la capside du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) libre dans des échantillons
de sérum, de plasma humains et de surnageant de culture cellulaire. Le test «GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen
Confirmatory Assay» (code 71121) est un test utilisé en complément du test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen-
EIA pour confirmer la présence d’antigène p24 du VIH dans des échantillons dont la réactivité a été répétée.
Le test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen - EIA repose sur l’utilisation d'une phase solide préparée avec des
anticorps monoclonaux de souris anti-VIH-1, d’un premier conjugué préparé avec des anticorps biotinylés de mouton
anti-p24 et d’un deuxième conjugué préparé avec de l’avidine couplée à la peroxydase de Raifort.
La mise en œuvre du test comprend les étapes réactionnelles suivantes :
1. Les échantillons à étudier ainsi que les sérums de contrôle sont distribués dans leurs puits respectifs dans lesquels
le diluant des échantillons a été préalablement ajouté. Si des antigènes VIH-1 sont présents dans l’échantillon testé,
ils se lient alors aux anticorps qui tapissent les cupules et y resteront fixés pendant l’étape de lavage qui suit.
Le dépôt des échantillons est confirmé par un changement de couleur du diluant d’échantillon, du vert au bleu.
2. Le conjugué 1 est ensuite ajouté dans chaque cupule puis incubé. Ceci permet aux anticorps biotinylés de mouton
anti-p24 présents dans le conjugué 1 de se lier aux anticorps-antigènes VIH-1 capturés dans les cupules.
Ces complexes antigènes –anticorps demeurent fixés aux puits lors de l’étape de lavage qui suit.
3. Le conjugué 2 est alors distribué puis incubé. L’avidine du conjugué 2 se lie spécifiquement aux complexes
anticorps-antigènes VIH-1 liés aux cupules. L’excédent non-lié du conjugué est éliminé par lavage.
4. La révélation de la réaction se fait par ajout puis incubation de la solution de travail TMB. Une coloration bleue
ou bleu-vert se développe proportionnellement à la quantité d’antigène VIH-1 présente dans l’échantillon.
La réaction colorimétrique est arrêtée par l’adjonction d’acide, qui modifie la coloration du bleu-vert au jaune. La
densité optique des échantillons et des contrôles est déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde
de 450/620-700 nm.
17

3 - COMPOSITION DE LA TROUSSE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
ETIQUETAGE NATURE DES RÉACTIFS PRÉSENTATION
71120
R1 MICROPLAQUE 2 plaques
12 barrettes de 8 cupules sensibilisées avec des anticorps murins
monoclonaux anti-p24 du VIH-1
Conservateur : ProClin 300, Azide de Sodium (

• Dispositif de lavage manuel, semi-automatique ou appareil de lavage pour plaque de microtitration (*).
• Appareil de lecture pour microplaques équipé de filtres 450nm et 620-700nm (*).
• Barrettes non sensibilisées lorsque des plaques incomplètes sont testées sur automates.
• Récipients pour réactifs EIA (facultatif).
• Gants à usage unique.
• Papier absorbant.
• Récipients propres en plastique (polystyrène ou polypropyrène) pour la préparation des solutions de travail
conjugués et de la solution TMB.
• Milieu de culture cellulaire, par exemple RPMI-1640 contenant 10 % de sérum de veau foetal, équivalent à celui
utilisé pour la culture de cellules infectées (en cas de test effectué sur échantillons de cellules).
(*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareils validés par nos services techniques.
5 - CONSIGNES D’HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ
Tous les réactifs de la trousse sont destinés à l’usage du diagnostic «in vitro».
• Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs et des échantillons et se laver les mains
soigneusement après leur manipulation.
• Ne pas pipeter à la bouche.
• Le matériel d'origine humaine utilisé dans la préparation du contrôle négatif, a été testé et trouvé négatif en
antigène VIH1, en anticorps anti-VIH1 et VIH2, en antigène HB, en anticorps anti-VHC ainsi qu'en anticorps anti
HTLV1/HTLV 2
• Le contrôle positif a été inactivé par la chaleur en présence d'un agent dissociant
• Du fait qu'aucune méthode ne peut garantir de façon absolue l’absence de virus VIH, Hépatites B ou C ou d’autres
agents infectieux, considérer ces réactifs, ainsi que les échantillons de patients, comme potentiellement infectieux
et les manipuler avec les précautions d’usage.
• Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons et les réactifs, ainsi que les solutions de lavage,
comme des produits contaminés.
• Eviter les éclaboussures d’échantillons ou de solutions les contenant.
• Les surfaces souillées seront nettoyées par de l'eau de javel diluée à 10%. Si le liquide contaminant est un acide,
les surfaces souillées seront neutralisées au préalable avec du bicarbonate de soude, puis nettoyées à l'aide d'eau
de javel et séchées avec du papier absorbant. Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un
conteneur spécial pour déchets contaminés.
• Les échantillons, les réactifs d'origine humaine ainsi que le matériel et les produits contaminés seront éliminés
après décontamination :
- soit par trempage dans de l'eau de javel à la concentration finale de 5% d'hypochlorite de sodium (1 volume
d'eau de javel pour 10 volumes de liquide contaminé ou d'eau) pendant 30 minutes.
- soit par autoclavage à 121°C pendant 2 heures minimum.
ATTENTION : NE PAS INTRODUIRE DANS L’AUTOCLAVE DE SOLUTIONS CONTENANT DE L’HYPOCHLORITE DE
SODIUM.
• La fiche de données de sécurité est disponible sur demande.
• Eviter tout contact du tampon substrat, du chromogène et de la solution d’arrêt avec la peau et les muqueuses
(risques de toxicité, d’irritation et de brûlures).
• Ne pas omettre de neutraliser et/ou d’autoclaver les solutions ou effluents de lavage ou tout liquide contenant des
échantillons biologiques avant de les jeter dans l’évier.
• D’autre part, la manipulation et l’élimination des produits chimiques doivent être effectuées selon les bonnes
pratiques de laboratoire.
• Certains réactifs contiennent de l’azoture de sodium comme conservateur. L’azoture de sodium peut former des
azotures de plomb ou de cuivre dans les canalisations du laboratoire. Ces azotures sont explosifs. Pour éviter
toute accumulation d’azotures, rincer à grande eau les canalisations si les solutions contenant de l’azoture sont
éliminées par l’évier après leur inactivation.
• Certains réactifs contiennet du ProClin 300
ProClin 300 0,5% : Irritant
R43 : Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau.
S28-37 : Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l'eau
et du savon. Porter des gants appropriés.
Xi - Irritant
19

6 - PRÉCAUTIONS
La qualité des résultats est dépendante du respect des bonnes pratiques de laboratoires suivantes :
• Ne pas utiliser de réactifs après la date d’expiration.
• Ne pas modifier le mode opératoire.
• Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination.
• Ne pas mélanger des réactifs de lots différents au cours d’un même essai.
Remarque : Il est possible d'utiliser d'autres lots de solution de lavage (R2, identifié 10 x en bleu sur l'étiquette),
de tampon substrat (R8, identifié TMB buf. en bleu), de chromogène (R9, identifié TMB 11 x en violet) et de
solution d'arrêt (R10, identifié 1N en rouge), que ceux fournis dans la trousse sous réserve d'utiliser un seul et
même lot de ceux-ci au cours d'un même essai. Ces réactifs peuvent être utilisés avec d'autres produits de notre
société, contacter nos services techniques pour obtenir des informations détaillées.
• Avant utilisation, attendre 30 minutes pour que les réactifs s’équilibrent à la température du laboratoire (18-30°C).
• Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de poussières qui
pourraient altérer l’activité enzymatique des conjugués.
• Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l’eau distillée ou de préférence du matériel à usage unique.
• Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du lavage et le début de la distribution des réactifs.
• Vérifier l’exactitude et la précision des pipettes et le bon fonctionnement des appareils utilisés.
• Lavage:il est indispensable de respecter scrupuleusement les procédures de lavage afin d’obtenir les performances
maximales du test.
• Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solution de révélation.
• La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ions métalliques. En conséquence, aucun élément
métallique ne doit entrer en contact avec les différentes solutions contenant les conjugués ou le substrat.
• La solution de révélation (tampon substrat + chromogène) doit être colorée en rose. L'apparition d'une autre
coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé.
Pour cette préparation, utiliser de préférence des récipients et du matériel de distribution en plastique à usage
unique ou de la verrerie préalablement lavée à l'acide chlorhydrique 1N, rincée à l'eau distillée et séchée.
Conserver cette solution à l'abri de la lumière.
7 - ÉCHANTILLONS
Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage.
Les échantillons pouvant être utilisés sont: du sérum, du plasma ou des échantillons de culture cellulaire. Les
anticoagulants EDTA, héparine, citrate de sodium, CPDA-1 et ACD ont été évalués et sont considérés comme
utilisables. Les échantillons prélevés à l’aide de tubes anticoagulants doivent remplir le tube jusqu’au niveau indiqué
afin d’éviter une mauvaise dilution.
Extraire le sérum ou le plasma du caillot ou des globules rouges dès que possible pour éviter toute hémolyse. Une
hémolyse très prononcée peut affecter les performances du test. Les échantillons présentant des agrégats doivent être
clarifiés par centrifugation avant le test. Les particules ou agrégats de fibrine en suspension peuvent donner des
résultats faussement positifs.
Les échantillons de culture de cellules nécessitant une dilution avant utilisation peuvent être dilués avec du milieu de
culture cellulaire équivalent au milieu utilisé pour la culture.
NE PAS UTILISER D’ÉCHANTILLONS INACTIVÉS PAR LA CHALEUR.
Les échantillons seront conservés à + 2-8°C si le dépistage est effectué dans les 7 jours ou peuvent être conservés
congelés à -20°C. Les plasmas devront subir une décongelation rapide par chauffage pendant quelques minutes à
40°C (pour limiter la précipitation de la fibrine).
En raison de l’instabilité de l’Ag VIH à la chaleur, des températures supérieures à 40°C ne pourront pas être utilisées.
Les échantillons ayant été congelés et décongelés plus de 3 fois ne doivent pas être utilisés.
Si les échantillons doivent voyager, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents
étiologiques.
Extraire le sérum ou le plasma du caillot ou des globules rouges dès que possible pour éviter toute hémolyse.
NE PAS UTILISER DE SÉRUMS OU PLASMAS CONTAMINÉS, HYPERLIPÉMIQUES OU HYPERHÉMOLYSES.
Remarque : Aucune interférence n’a été mise en évidence sur des échantillons contenant 80 mg/l de bilirubine,
36 mg/l d’immunoglobuline M ou G ainsi que sur des échantillons lipémiques contenant jusqu’à 5 g/l de lipides et
sur des échantillons hémolysés contenant jusqu’à 5 g/l d’hémoglobine.
8 - RECONSTITUTION DES RÉACTIFS
Tous les réactifs doivent être à température ambiante (18 à 30°C) avant utilisation, exception faite des conjugués
concentrés 1 et 2 (R4 et R5).
20

1) Réactifs prêts à l’emploi
Réactif R1 : Microplaque
Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionné en sachet ”ZIP“. Couper le sachet à l’aide de ciseaux
ou scalpel 0,5 à 1 cm au-dessus du ZIP. Ouvrir le sachet et sortir le cadre. Replacer dans le sachet les barrettes
inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8°C.
Réactif R3 : Diluant pour échantillons
Réactif C0 : Sérum de contrôle négatif
Réactif C1 : Sérum de contrôle positif
Réactif R10 : Solution d’arrêt
2) Réactifs à reconstituer
Solution de lavage concentrée 10 fois (R2) :
Diluer au 1/10è la solution R2 dans l’eau distillée. Homogénéiser.
REMARQUE : La solution de lavage GENETIC SYSTEMS EIA (30X), qui fait partie d’autres kits GENETIC SYSTEMS,
peut également être utilisée pour ce test. Dans ce cas, diluer un volume de solution de lavage concentrée dans 29
volumes d’eau.
Solution de travail conjugué 1 (R4 + R6) et Solution de travail conjugué 2 (R5 + R6)
Les conjugués 1 (R4) et 2 (R5) sont des solutions conecntrées (100 X). Préparer séparément la solution de travail
conjugué 1 et la solution de travail conjugué 2 en diluant chacune au 1:101ème dans le diluant de conjugué (R6).
Effectuer la préparation dans des récipients propres en plastique. Inscrire sur le récipient le numéro de lot, la date
et l’heure de préparation et la date des conjugués concentrés (1 ou 2) ainsi que l’heure limite d’utilisation (24 heures
après préparation). Mélanger doucement les solutions de travail avant utilisation. Après avoir été mélangées, la
solution de travail conjugué 1 est jaune et la solution de travail conjugué 2 est verte.
Préparation de la solution de travail conjugué 1 ou 2 par barette
Nombre de barettes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
nécessaires
Quantité de conjugué 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
concentré (µl
Quantité de diluant 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
du conjugué (ml)
*une plaque entière **deux plaques entières
Solution de révélation enzymatique (R8 + R9)
Diluer le R9 dans le R8 au 1/11ème (exemple : 1 ml de réactif R9 dans10 ml de réactif R8) sachant que 10 ml sont
nécessaires et suffisants pour traiter 12 barrettes. Homogénéiser.
9 - VALIDITÉ - CONSERVATION
La trousse doit être gardée à +2-8°C.
Chaque élément de la trousse GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA conservé à +2-8°C peut être utilisé après
une permière ouverture jusqu’à la date de péremption indiquée sur le coffret, sauf indication spécifique :
R1 : Après ouverture du sachet, les barrettes conservées à +2-8°C dans leur sachet d’origine, refermé avec soin,
sont stables pendant 1 mois.
R2 : Après dilution, la solution de lavage se conserve 14 jours maximum à +2-8°C dans un récipient en plastique.
R8 + R9 : Après reconstitution les réactifs conservés à l’obscurité sont stables 6 heures à température ambiante
(18-30°C).
R4 - R5 : Après reconstitution, les conjugués sont stables 24 heures à température ambiante (18-30°C).
21

10 - MODE OPÉRATOIRE
Deux procédures pour la détection de l’antigène p24 du VIH-1 dans le sérum ou le plasma humains ou dans des
échantillons de culture cellulaire sont présentées ci-dessous :
22
Procédure Incubation Conjugué 1 Conjugué 2 Révélation
incubation incubation colorimétrique
Incubation Incubation statique Incubation statique Incubation statique 18 à 30°C,
37°C 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, dans l'obscurité
chaleur sèche chaleur sèche chaleur sèche 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Incubation Incubation statique Incubation statique Incubation statique 18 à 30°C,
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, dans l'obscurité
chaleur sèche chaleur sèche chaleur sèche 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Pour les échantillons testés à l’origine à 37 ou 40°C, tout nouveau test ou toute confirmation devra être effectué selon
la même procédure.
La durée indicative de ce test est d’environ 3 h 30 à 4 heures à partir du début de la première étape d’incubation.
Chaque cycle de la procédure d’utilisation du test doit être effectué intégralement et sans interruption une fois
commencé.
Deux contrôles positifs et trois contrôles négatifs doivent être réalisés sur chaque plaque. En cas de test effectué sur
échantillons de cellules, trois contrôles négatifs de milieu de culture cellulaire sont nécessaires au lieu du contrôle
négatif de la trousse (C0). Le seuil de réactivité pour les échantillons de patients est déterminé en fonction des
signaux obtenus avec les contrôles sur chaque plaque individuelle.
Eviter que les plaques ne soient exposées à la lumière au cours de la dernière étape d’incubation (après adjonction
de la solution de travail TMB).
Suivre strictement le protocole proposé et appliquer les bonnes pratiques de laboratoire :
1. Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des échantillons
2. Préparer la solution de lavage diluée,
3. Sortir le cadre support et les barrettes (R1) de l'emballage protecteur
4. Déposer directement, sans prélavage de la plaque, successivement (suggestion de plan de distribution de la
plaque) :
4.1 50 µl de diluant d’échantillon dans chaque cupule
4.2 150 µl de contrôle négatif (C0) en A1- B1- C1
4.3 150 µl de contrôle positif (C1) en D1-E1
4.4 150 µl d’échantillon en G1, etc...
En cas de test effectué sur échantillons de cellules, trois contrôles négatifs de milieu de culture cellulaire sont
nécessaires au lieu du contrôle négatif de la trousse (C0). S’assurer que le diluant d’échantillon est bien mélangé
à l’échantillon (ou au contrôle).
NB : la distribution des échantillons et du diluant échantillons peut être contrôlée visuellement à ce stade de la
manipulation : Le diluant d’échantillon passe du vert au bleu pour signaler que l’échantillon ou le contrôle a bien
été ajouté dans le puits. Lorsque les solutions contenues dans chaque puits sont bien mélangées, elles ont une
couleur uniforme.
Les échantillons de culture cellulaire peuvent ne pas changer de couleur en fonction du milieu de culture utilisé.
(se référer au chapitre 12 pour la vérification automatique - VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU
DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS).
5. Lorsque cela est possible, couvrir d'un film autocollant en appuyant bien sur toute la surface pour assurer
l'étanchéité.
6. Incuber la plaque pendant 60±5 minutes à 37±1°C ou à 40±1°C avec un incubateur statique à chaleur sèche.
7. Retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés
(contenant de l'hypochlorite de sodium) et ajouter immédiatement dans chacune d'elles un minimum de 0,370 ml
de solution de lavage. Respecter un temps de trempage (temps d'attente) de 20 à 60 secondes. Aspirer de
nouveau. Répéter le lavage 4 fois (un minimum de 5 lavages). Le volume résiduel doit être inférieur à 10 µl (si
nécessaire sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant).
Si l'on dispose d'un laveur automatique, respecter le même cycle opératoire

8. Distribuer rapidement 100 µl de la solution de travail conjugué 1 dans toutes les cupules. Le conjugué doit être
agité avant emploi.
N.B : La distribution de la solution de travail du conjugué 1 qui est coloré en jaune peut être vérifiée visuellement
à ce stade de la manipulation.
9. Si cela est possible, recouvrir la microplaque d'un film neuf. Incuber 30 ± 5 minutes à 37 ± 1°C ou à 40 ± 1°C
dans un incubateur statique à chaleur sèche.
10. Retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés
(contenant de l'hypochlorite de sodium) et ajouter immédiatement dans chacune d'elles un minimum de 0,370 ml
de solution de lavage. Respecter un temps de trempage (temps d'attente) de 20 à 60 secondes. Aspirer de
nouveau. Répéter le lavage 4 fois (un minimum de 5 lavages). Le volume résiduel doit être inférieur à 10 µl (si
nécessaire sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant).
11. Distribuer rapidement 100 µl de la solution de travail conjugué 2 dans toutes les cupules. Le conjugué doit être
agité avant emploi.
N.B. La distribution de la solution de travail du conjugué 2 qui est coloré en vert peut être vérifiée visuellement à
ce stade de la manipulation
12. Si cela est possible, recouvrir la microplaque d'un film neuf. Incuber 30 ± 5 minutes à 37 ± 1°C ou à 40 ± 1°C
dans un incubateur statique à chaleur sèche.
13. Retirer le film adhésif, vider toutes les cupules par aspiration et laver au moins 5 fois comme précédemment.
Le volume résiduel doit être inférieur à 10 µl (si nécessaire, sécher les barrettes par retournement sur une feuille
de papier absorbant).
14. Distribuer rapidement dans toutes les cupules 100 µl de la solution de révélation de l'activité enzymatique (R8
+ R9) préalablement préparée. Laisser la réaction se développer à l'obscurité pendant 30 ± 5 minutes à
température ambiante (18 à 30°C). Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif.
N.B.: La distribution de la solution de révélation, qui est colorée en rose, peut être contrôlée visuellement à ce
stade de manipulation : Il y a une différence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule
contenant la solution de révélation rosée. (se reporter au paragraphe 12 pour la vérification automatique
VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DES RÉACTIFS)
15. Ajouter 100 µl de la solution d'arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de distribution
que pour la solution de révélation. Homogénéiser le mélange réactionnel.
N.B.: La distribution de la solution d'arrêt, qui est incolore, peut être contrôlée visuellement à ce stade de la
manipulation. La coloration du substrat, rosée (pour les échantillons négatifs) ou bleu (pour les échantillons
positifs), disparaît des cupules qui deviennent incolores (pour les échantillons négatifs) ou jaunes (pour les
échantillons positifs) après addition de la solution d'arrêt.
16. Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Au moins 4 minutes après la distribution de la solution d'arrêt et
dans les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique à 450/620-700 nm à l'aide d'un
lecteur de plaques.
17. S’assurer avant la transcription des résultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et
d’identification des plaques et des échantillons.
11 - CALCUL ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
1) Validation de l'essai
Un test est valide si les critères suivants sont remplis :
• Les valeurs d’absorbance individuelles des contrôles négatifs (ou des contrôles de milieu de cultures de cellules,
le cas échéant) doivent être supérieures à 0,000 UA et inférieures ou égales à 0,100 UA. Une des valeurs
d’absorbance d’une cupule du contrôle négatif peut être éliminée si elle est située en dehors de ces normes. La
moyenne des contrôles négatifs peut dans ce cas être calculée à partir des deux valeurs d’absorbance restantes.
Si deux contrôles négatifs ou plus ne respectent pas ces critères, le dosage doit être de nouveau effectué.
• Les absorbances moyennes des contrôles positifs doivent être supérieures ou égales à 0,500 UA et la valeur
d’absorbance de chaque contrôle positif doit être située dans le domaine de reproductibilité de 0,65 à 1,35 fois
la moyenne des contrôles positifs. Toutes les valeurs d’absorbance des contrôles positifs doivent être prises en
compte.
2) Calcul de la moyenne des absorbances
A partir des contrôles validés, déterminer les absorbances moyennes des contrôles négatifs et positifs en divisant la
somme de leurs valeurs d’absorbance par le nombre de contrôles utilisés.
23

3) Calcul de la valeur seuil
La valeur seuil est calculée par la somme d’un facteur constant (0,070) avec la valeur d’absorbance moyenne des
contrôles négatifs (CNX).
Valeur seuil = 0,070 + CNX
Exemple :
CNX = 0.033
Valeur Seuil = 0,070 + 0,033 = 0,103
4) Interprétation des résultats
La présence ou l'absence des antigènes VIH1 est déterminée en comparant pour chaque échantillon l'absorbance
enregistrée à celle de la valeur seuil calculée.
Les échantillons dont les valeurs d’absorbance sont inférieures à 0,000 doivent être de nouveau testés. Les
échantillons dont les valeurs d’absorbance sont supérieures aux limites de linéarité du lecteur sont considérés
réactifs.
Les échantillons dont les valeurs d’absorbance sont inférieures à la valeur seuil sont considérés non réactifs au test
EIA antigène VIH-1 GENETIC SYSTEMS et peuvent être considérés comme négatifs pour l’antigène VIH-1. Dans ce
cas, il n’est pas nécessaire d’effectuer un autre test.
Les échantillons dont les valeurs d’absorbance sont supérieures ou égales à la valeur seuil sont considérés comme
initialement réactifs au test EIA GENETIC SYSTEMS antigène VIH-1. Les échantillons initialement réactifs doivent être
de nouveau testés deux foix afin de valider les résultats du test initial. Si à la suite de ces nouveaux tests les deux
nouvelles valeurs d’absorbance obtenues sont inférieures à la valeur seuil, le résultat initial est non reproductible et
l’échantillon d’origine est déclaré négatif pour l’antigène VIH-1 selon le test "GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen".
L'origine des réactions non reproductibles est souvent en relation avec les causes suivantes :
• lavage insuffisant des microplaques,
• contamination croisée d’échantillons non réactifs par un échantillon fortement titré en antigène VIH-1.
• contamination ponctuelle de la solution de révélation par des agents chimiques oxydants (eau de javel, ions
métalliques, etc...).
• contamination ponctuelle de la solution d'arrêt.
Si après la répétition de l'essai, la valeur d’absorbance mesurée sur l'un des deux doublets est supérieure ou égale
à la valeur seuil, le résultat initial est reproductible et l’échantillon est déclaré réactif selon le test GENETIC
SYSTEMS HIV-1 Antigen, conformément aux limites décrites ci-après. Les échantillons dont la réactivité a été
répétée avec le test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen - EIA doivent être confirmés avec le test GENETIC
SYSTEMS HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (code : 71121). L’échantillon peut être considéré positif pour
l’antigène VIH-1 seulement si l’antigène VIH-1 est neutralisé lors de la procédure de confirmation.
12 - VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS
ET DES RÉACTIFS
Vérification spectrophotométrique du dépôt des échantillons
Après la distribution successive du diluant des échantillons (R3) puis des échantillons, il est possible de vérifier la
présence des échantillons à tester dans les cupules par une lecture spectrophotométrique à 620 nm : la densité
optique d'une cupule contenant un échantillon devra être supérieure à 0,250 (une DO inférieure indique une
mauvaise distribution de celui-ci).
Remarque : les échantillons de culture cellulaire peuvent ne pas changer de couleur en fonction du milieu de culture
utilisé. Dans ce cas ne pas appliquer cette vérification automatique.
Vérification spectrophotométrique du dépôt de la solution de révélation
Il est possible de vérifier la présence de la solution de révélation rosée par lecture automatique à 490 nm : une
cupule contenant la solution de révélation doit avoir une densité optique supérieure à 0.100 (une DO plus faible
indique une mauvaise distribution de la solution de révélation).
Il y a une différence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de révélation
rosée.
13 - PERFORMANCES
Sensibilité diagnostique
• 138 échantillons de patients infectés par le VIH à différents stades de l'infection (AIDS, ARC, autres) ont été testés
et trouvés positifs avec le test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA.
• 20 panels de séroconversion bien documentés ont été étudiés. Les résultats obtenus sont comparables aux résultats
obtenus avec d’autres tests de dosage de l’antigène HIV.
• 55 surnageants de cultures cellulaires de VIH1 (dont 53 de groupe M et 2 de groupe O) ainsi que le panel de
24

dilution "Ag VIH SFTS 96" ont tous été trouvés positifs avec le test Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA à l'exception
de 2 dilutions d'un surnageant de culture cellulaire de groupe O.
- Les 53 surnageants de cultures cellulaires de VIH1 de groupe M sont composés des génotypes suivants : 10 de
génotype A, 10 de B, 9 de C, 5 de D, 11 de E, 2 de F, 2 de G, 1 de H, 2 de J et 1 de N.
- Le panel de dilution "Ag VIH SFTS 96" comprend les génotypes suivants : A, B, C, D, E, F, G, H du groupe M
et 1 génotype de groupe O.
Sensibilité analytique
Le seuil de sensibilité du test a été étudié sur une gamme de dilutions préparées à partir de l’étalon national français
(lysat viral purifié de génotype B dilué en plasma citraté négatif) ainsi que sur le panel BBI (PRA 801). Lors de ces
essais, le seuil de détection a été estimé à 8 pg/ml d'antigène HIV, quelque soit le protocole utilisé.
La gamme d’étalonnage obtenue avec le standard “HIV-1 Ag Standard” (code 72217) de BIO-RAD est linéaire de
0 à 100 pg/ml.
Spécificité diagnostique
La spécificité du test déterminée à partir :
• d’une population de 4038 donneurs de sang est estimée à 99,95%.
• d’une population de 209 patients hospitalisés est estimée à 100%.
Un panel de 105 échantillons de patients a été testé. Il comprend des échantillons :
• contenant des anticorps dirigés contre HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubella, Toxoplasma Gondii, Treponema
pallidum, CMV
• contenant des autoanticorps, des taux d’IgG, d’IgM de facteur rhumatoïde élevés provenant de femmes enceintes,
de cirrhotiques, de polytransfusés ainsi que de patients atteints de Lupus Erythémateux Systématique.
Un seul échantillon provenant d’un patient atteint de Lupus Erythémateux a été trouvé réactif avec le test GENETIC
SYSTEMS HIV-1 Antigen EIA mais n’a pas été confirmé positif avec le test de confirmation.
Précision
La répétabilité intra-essai a été étudiée en testant 3 échantillons positifs et 1 négatif 30 fois chacun lors du même
essai.
La reproductibilité inter-essai é été étudiée en testant 3 échantillons positifs et un négatif en triplicate pendant 5 jours
par deux techniciens différents.
Les coefficients de variation obtenus sur les échantillons positifs testés sont inférieurs à 10%.
14 - LIMITES DU TEST
• La procédure du test GENETIC SYSTEMS HIV-1 Antigen - EIA et le mode d’interprétation des résultats doivent
être utilisés pour la recherche de l’antigène VIH-1 dans des échantillons de sérum, de plasma ou de cultures
cellulaires. Il est recommandé aux utilisateurs de ce kit de lire la présente notice d’utilisation avec attention avant
réalisation du test. Les procédures du test doivent tout particulièrement être respectées en ce qui concerne le
pipetage des échantillons et des réactifs, le lavage des plaques et la durée des étapes d’incubation.
• Un échantillon ne doit pas être considéré comme réactif pour l’antigène VIH-1 à partir d’un seul résultat réactif.
Afin d’établir la spécificité de la réactivité de chaque échantillon selon ce test, il est nécessaire d’effectuer de
nouveaux dosages comme par exemple un test de confirmation.
• Tout test immunoenzymatique hautement sensible peut être sujet à des réactions non spécifiques qui peuvent
entraîner des résultats faussement positifs. La proportion des échantillons réactifs faussement réactifs dépend de
la sensibilité et de la spécificité du kit utilisé.
• Des résultats négatifs peuvent être obtenus pour des échantillons dont le taux en antigène VIH est trop bas
comparativement aux limites de détection du test, tout comme des résultats négatifs peuvent être observés si le
marqueur recherché n’est pas présent au stade de la maladie auquel l’échantillon a été prélevé.
• La variabilité des virus VIH ne permet pas d'exclure la possibilité de réactions faussement négatives. Aucune
méthode connue ne peut offrir l'assurance que le virus VIH est absent.
• Si l’addition d’échantillon ou de réactif n’a pas été faite conformément aux instructions, il est possible d’obtenir
un résultat faussement négatif. Il faut envisager d’effectuer un nouveau dosage en cas de suspicion clinique
d’infection ou d’erreur au cours de la procédure.
• Une valeur d’absorbance inférieure à 0,000 UA signale une erreur au cours de la procédure ou un problème lié
au matériel. L’échantillon concerné doit alors être retesté.
• Les facteurs pouvant affecter la validité des résultats sont les suivants : mauvais dépôt de l’échantillon dans le puits,
mauvais lavage des puits des microplaques, non respect des temps et températures d’incubation indiqués, erreurs
dans les dépôts des réactifs, présence de métaux ou d’eau de javel dans les puits.
• Les performances de ce test n’ont pas été évaluées sur des échantillons post mortem ou sur fluides biologiques
25

autres que le sérum ou le plasma ou échantillons de culture cellulaire.
• La sensibilité analytique, estimée à 8 pg/ml lors des évaluations du test peut varier en fonction des conditions
opératoires et de la variabilité interlots. En conséquence, seule une sensibilité analytique inférieure à 15 pg/ml
peut être garantie par BIO-RAD.
• La coloration du diluant des échantillons peut ne pas être modifiée en présence d'échantillon de culture cellulaire
en fonction du milieu de culture utilisée
• La méthode colorimétrique de vérification du dépôt des échantillons et/ou des conjugués et/ou de la solution
de révélation ne permet pas de vérifier l'exactitude des volumes distribués mais seulement de montrer la
présence d'échantillons et/ou des conjugués et/ou de la solution de révélation. Le taux de réponses erronées
obtenues avec cette méthode est liée à la précision du système utilisé (des CV cumulés de pipetage et de lecture
supérieurs à 10% peuvent dégrader significativement la qualité de cette vérification).
• Dans le cas d'un lavage inefficace après l'étape d'incubation du conjugué, la vérification automatique de la
distribution de la solution de révélation (par lecture à 490 nm des densités optiques des cupules) peut donner des
résultats erronés avec des densités optiques supérieures à 0.100 en l'absence de solution de révélation.
Cependant, ce phénomène n'a pas été observé durant les évaluations conduites sur 939 échantillons testés.
15 - RÉFERÉNCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al: Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired
immune deficiency syndrome(AIDS). Science 220:868-871,1983.
2. Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al: Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-lll)
from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 224:500-503,1984.
3. Coffin J, Haase A, Levy JA, et al: What to call the AIDS virus? Nature 321:10, 1986.
4. Van der Graff M, Diepersloot R: Transmission of human immunodeficiency virus (HIV/ HTLV-III/ LAV): a review,
Infection 14:203-211,1986.
5. Weis R: Retrovirus and human disease. J Clin Pathol 40:1064-69,1987.
6. Tovo P, Gabiano C, Riva C, et al: Specific antibody and virus antigen expression in congenital HIV infection,
Lancet 1:1201,1987.
7. Tegtmeier G: Current tests for serologic detection of HlV-1 infection. J Clin lmmunoassay 11:123-125,1988.
8. Schumacher R, Garrett P, Tegtmeier G, et al: Comparative detection of anti-HIV in early HIV seroconversion. J Clin
lmmunoassay 11:130-134,1988.
9. Casey JM, Kim Y, Andersen PR, et al: Human T-cell lymphotropic virus type III: immunologic characterization and
primary structure analysis of the major internal protein, p24. J Virology 55:417-423,1985.
10. Ritter J, Escaich S, Trepo C, et al: HIV antigen detection in antibody negative sera. Abstract 1627, IV International
Conference on AIDS, 1988.
11. Veronese FD, Sarngadharan MG, Rahman R, et al: Monoclonal antibodies specific for p24, the major core
protein of human T-cell Leukemia virus type III. Natl Acad Sci USA, 82:5199-5202,1985.
12. Schaeffler B, Flesher A, Shriver K, Tam MR: Monoclonal antibody detection of p25 HIV antigen in the serum and
CSF of patients within the AIDS spectrum. Abstract 7759, IV International Conference on AIDS, 1988.
13. Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schurs AHWM: 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine as an Ames test
negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J lmmunoassay 2:187-204,1981.
14. Garner RC, Walpole AL, Rose FL: Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial
mutagens. Cancer Letters 1:39-42,1975.
15. Resnick L, Veren K, Salahuddin SZ, et al: Stability and inactivation of HTLV-III/LAV under clinical laboratory
environments. JAMA 255:1887-1891,1986.
16. Sarngadharan MG, Markham PD: The role of human T-Lymphotropic retroviruses in leukemia and AIDS, in
Wormser GP (ed.): AIDS and Other Manifestations of HlV Infection. New Jersey, Noyes Publications 1987, pp
218- 220.
17. Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, et al: Inactivation of Hepatitis B virus by intermediate-to-high level disinfectant
chemicals. J Clin Micro 18:535-538,1983.
26

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tests 71120
TEST IMMUNOENZIMÁTICO (EIA, ENZYME IMMUNOASSAY)
PARA LA DETECCIÓN DEL ANTÍGENO P24 DEL VIRUS
DE LA IMMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA HUMANA DE TIPO 1
(VIH-1) EN EL SUERO HUMANO, EL PLASMA HUMANO
Y LOS SOBRENADANTES DE CULTIVO CELULAR
IVD
Control de calidad del fabricante
Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad forman parte de un
sistema que asegura la calidad desde la recepción de las materias primas hasta la
comercialización de los productos terminados.
Cada lote del producto terminado es objeto de un control de calidad y su comercialización sólo
tiene lugar si está conforme con los criterios de aceptación.
Nuestra sociedad conserva la documentación relativa a la producción y al control de cada lote.
27

ÍNDICE
1 - INTERÉS CLÍNICO
2 - PRINCIPIO DEL GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - COMPOSICIÓN DEL ESTUCHE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
4 - MATERIAL NECESARIO, PERO NO INCLUIDO
5 - CONSIGNAS DE HIGIENE Y DE SEGURIDAD
6 - PRECAUCIONES
7 - MUESTRAS
8 - RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS
9 - VALIDEZ – CONSERVACIÓN
10 - MODO OPERATORIO
11 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
12 - VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL PIPETEADO DE LAS MUESTRAS
Y DE LOS REACTIVOS
13 - RESULTADOS
14 - LÍMITES DEL TEST
15 - REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS
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1 - INTERÉS CLÍNICO
El agente etiológico del síndrome de immunodeficiencia adquirida (SIDA) es un retrovirus que recibió la
denominación de Virus de la Immunodeficiencia Humana (VIH). El VIH ha sido aislado en pacientes afectados por
el SIDA, así como en individuos sanos que forman parte de una población sometida a un riesgo de padecer el
SIDA 1,2 . Se sabe que la transmisión tiene lugar por vía sexual, por la utilización de agujas contaminadas, por
transfusión de productos sanguíneos contaminados y también por vía placentaria, desde la madre infectada al feto
o al recién nacido 1,8 .
Normalmente, es posible detectar anticuerpos específicos contra el virus en la sangre o en el plasma de un individuo
que ha sido expuesto al virus, lo cual confirma así la exposición. En la fase que precede a la aparición de
anticuerpos detectables, ya existen antígenos víricos libres que circulan en la sangre. Uno de estos antígenos víricos
es el antígeno p24, que corresponde a la principal proteína de la nucleocápside.
Los tests de detección del antígeno del VIH se pueden utilizar para detectar la presencia de antígenos víricos y, por
lo tanto, para diagnosticar una infección por el VIH, y ello antes de que haya tenido lugar la seroconversión.
El periodo de antigenemia, que precede a la aparición de los anticuerpos anti-VIH, es variable y puede durar desde
algunos días a varias semanas entre los individuos infectados. En el momento de la seroconversión, los anticuerpos
específicos del virus forman complejos inmunes con los antígenos circulantes, de tal manera que tiene lugar una
fuerte caída del índice de antígenos libres en la sangre y, eventualmente, la desaparición completa de estos
antígenos 9,11 . La antigenemia puede reaparecer más tarde en el curso de la progresión de la enfermedad 12 .
El test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA está destinado a su utilización como ayuda en el diagnóstico y el
pronóstico de la infección por el VIH-1.
2 - PRINCIPIO DEL GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
El test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA es un test inmunoenzimático para la detección in vitro del antígeno
p24 de la cápside del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) libre en muestras humanas de suero,
de plasma y del sobrenadante del cultivo celular. El test «Genetic Systems HIV-1 Antigen Confirmatory Assay»
(código 71121) se utiliza como complemento del test Genetic Systems HIV-1 Antigen-EIA para confirmar la
presencia de antígeno p24 del VIH en muestras repetidamente reactivas.
El test Genetic Systems HIV-1 Antigen – EIA se basa en la utilización de una fase sólida preparada con
anticuerpos monoclónicos de ratón anti-VIH-1, de un primer conjugado preparado con anticuerpos biotinilados de
carnero anti-p24 y de un segundo conjugado preparado con avidina acoplada a la peroxidasa de Raifort.
La realización del test comprende las siguientes etapas reactivas:
1. Las muestras que hay que estudiar, así como los sueros de control, se distribuyen en sus pocillos respectivos, a
los cuales se les ha añadido con anterioridad el disolvente de las muestras. En el caso de que existan antígenos
VIH-1 en la muestra sometida a test, éstos se fijan entonces a los anticuerpos que tapizan los pocillos, donde
quedan fijos durante la siguiente etapa de lavado.
El depósito de las muestras queda confirmado por un cambio de color del disolvente de muestra, que pasa del
verde al azul.
2. El conjugado 1 se añade luego en cada pocillo y se somete después a incubación. Esto permite a los anticuerpos
biotinilados de carnero anti-p24 presentes en el conjugado 1 que se fijen a los antígenos-anticuerpos VIH-1 fijos
en los pocillos. Estos complejos antígeno-anticuerpo permanecen fijos en los pocillos en el momento de la
siguiente etapa de lavado.
3. El conjugado 2 se distribuye entonces y luego se incuba. La avidina del conjugado 2 se liga de forma específica
a los complejos antígeno-anticuerpo VIH-1 fijos en los pocillos. El excedente no fijo del conjugado se elimina
mediante lavado.
4. Se añade la solución de trabajo TMB y se procede después a incubación. Aparece una coloración azul o verde
azulada, proporcional a la cantidad de antígeno VIH-1 presente en la muestra. Se detiene la reacción
colorimétrica añadiendo ácido, que modifica la coloración, desde el azul verdoso al amarillo. La densidad óptica
de las muestras y de los controles se determina por espectrofotometría a una longitud de onda de 450/620-700 nm.
29

3 - COMPOSICIÓN DEL ESTUCHE GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
ETIQUETADO NATURALEZA DE LOS REACTIVOS PRESENTACIÓN
71120
R1 MICROPLACA : 2 placas
12 tiras de 8 pocillos con anticuerpos murinos monoclónicos
anti-p24 del VIH-1
Conservante : ProClin 300, Azida sódica (< 0,1 %)
R2 SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA (10x) : 1 frasco
Tampón TrisNaCl pH 7,4
250 ml
Conservante : Mertiolato sódico al 0,01 %
R3 DISOLVENTE DE LAS MUESTRAS : 1 frasco
Conservante : ProClin 300 al 0,5 %
20 ml
Colorante verde testigo de la adición de las muestras
C0 SUERO DE CONTROL NEGATIVO (HUMANO) : 1 frasco
Suero humano no reactivo para el antígeno VIH y los anticuerpos
10 ml
anti-VIH, anti-VHC, anti-HTLV-I y AgHbs Sulfato de gentamicina al 0,005 %
Conservante : ProClin 300 al 0,5 %
C1 SUERO DE CONTROL POSITIVO : 1 frasco
Antígeno VIH-1 purificado y disociado
7 ml
Conservante : ProClin 300 0,5%
R4 CONJUGADO CONCENTRADO 1 (100 X) : 1 frasco
Anticuerpo de carnero biotinilado anti-p24 Sulfato de gentamicina al 0,005 % 1 ml
Conservante : ProClin 300 el 0,5 %
Colorante amarillo
R5 CONJUGADO CONCENTRADO 2 (100 X) : 1 frasco
Avidina acoplada a la peroxidasa de Raifort
1 ml
Sulfato de gentamicina al 0,005 % Conservante: ProClin 300 0,5%
Colorante verde
R6 DISOLVENTE DE LOS CONJUGADOS : 1 frasco
Tapón con estabilizantes de proteínas
100 ml
Conservante: ProClin 300 al 0,5 %
R8 TAMPÓN SUBSTRATO : 1 frasco
Solución de ácido cítrico y de acetato sódico pH 4,0 que contiene
60 ml
un 0,015 % de agua oxigenada y un 4 % de dimetilsulfóxido (DMSO)
R9 CROMÓGENO : 1 frasco
Solución que contiene tetrametil benzidina (TMB)
5 ml
R10 SOLUCIÓN DE INTERRUPCIÓN : 2 frascos
Solución de ácido sulfúrico 1N
2 x 28 ml
PELÍCULAS ADHESIVAS PARA MICROPLACAS
25 películas
4 - MATERIAL NECESARIO, PERO NO INCLUIDO
• Agua destilada.
• Lejía (hipoclorito sódico del 5 al 8 %) que se puede diluir a una concentración mínima del 10 % de lejía (o hipoclorito
sódico al 0,5 %). Otros desinfectantes posibles: etanol al 70 % o Wescodyne al 0,5 % (West Chemical Products, Inc.).
• Pipetas de precisión para distribuir volúmenes de 10 a 200 µl, 1 ml, 5 ml y 10 ml (precisión ± el 10 %).
Pipeteador multicanales para distribuir 100 µl o 200 µl: facultativo.
• Probetas graduadas de 25 ml; 100 ml; 1000 ml.
• Contenedor de desechos contaminados.
• Baño María o incubadora de microplacas con termostato a 37°C ± 1°C (o 40 ± 1°C). (*)
• Dispositivo de lavado manual y semiautomático o aparato de lavado para placa de microvaloración. (*)
30

• Aparato de lectura para microplacas equipado con filtros 450nm y 620-700nm. (*)
• Tiras no sensibilizadas cuando las placas incompletas son sometidas a un test automático.
• Recipientes para reactivos EIA (facultativo).
• Guantes de uso único.
• Papel absorbente.
• Recipientes limpios de plástico (poliestireno o polipropireno) para la preparación de las soluciones de trabajo
conjugadas y de la solución TMB.
• Medio de cultivo celular, por ejemplo, RPMI-1640, que contiene un 10 % de suero de carnero fetal, equivalente
al utilizado para el cultivo de células infectadas (en caso de test efectuado con muestras de células).
(*) Sírvase el usuario consultarnos para una información precisa relativa a los aparatos validados por nuestros
servicios técnicos.
5 - CONSIGNAS DE HIGIENE Y DE SEGURIDAD
Todos los reactivos del estuche están destinados para uso diagnóstico in vitro.
• Es necesario llevar guantes de uso único en el momento de la manipulación de los reactivos y de las muestras,
así como lavarse las manos cuidadosamente después de su manipulación.
• No se debe pipetear con la boca.
• El material de origen humano utilizado para la preparación del control negativo ha sido sometido a un test y
encontrado negativo en cuanto al antígeno VIH1, a los anticuerpos anti-VIH1 y VIH2, al antígeno HB, al
anticuerpo anti-VHC y a los anticuerpos anti HTLV1 / HTLV 2
• El control positivo ha sido inactivado al calor en presencia de un agente disociador
• Dado que ningún método puede garantizar de modo absoluto la ausencia de virus VIH, de virus de la hepatitis
B o C o de otros agentes infecciosos, estos reactivos, así como las muestras de pacientes, son potencialmente
infecciosas y deben ser manipuladas con las precauciones habituales.
• Los materiales que entren en contacto directo con las muestras y los reactivos, así como las soluciones de lavado,
se considerarán como productos contaminados.
• Se evitará cualquier salpicado de las muestras o de las soluciones que las contienen.
• Las superficies manchadas se limpiarán con lejía diluida al 10 %. Si el líquido que contamina es un ácido, las
superficies manchadas se neutralizarán previamente con bicarbonato sódico y luego se limpiarán con la ayuda
de lejía y se secarán con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza se desechará en un contenedor
especial para desechos contaminados.
• Las muestras, los reactivos de origen humano y el material y los productos contaminados se eliminarán después
de su descontaminación:
- ya sea mediante remojo en lejía a la concentración final del 5 % de hipoclorito sódico (1 volumen de lejía para
10 volúmenes de líquido contaminado o de agua) durante 30 minutos.
- ya en el autoclave a 121°C durante 2 horas como mínimo.
ATENCIÓN : NO SE DEBEN INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES QUE CONTENGAN HIPOCLORITO
SÓDICO.
• La ficha de datos sobre la seguridad está disponible a petición.
• Se evitará cualquier contacto con la piel y las mucosas del tampón substrato, del cromógeno y de la solución de
interrupción (riesgos de toxicidad, de irritación y de quemaduras).
• Se procurará no omitir la neutralización o el proceso de autoclave de las soluciones o los efluentes de lavado o
de todo líquido que contenga muestras biológicas antes de desecharlos en el fregadero.
• Por otra parte, la manipulación y la eliminación de los productos químicos se llevarán a cabo de acuerdo con
las buenas prácticas de laboratorio.
• Algunos reactivos contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede formar azidas de plomo o
de cobre en las tuberías del laboratorio. Estas azidas son explosivas. Para evitar cualquier acumulación de
azidas, se enjuagarán con abundante agua las tuberías si las soluciones que contienen azida se eliminan por el
fregadero después de su inactivation.
• Algunos reactivos contienen 0,05 % ProClin 300
ProClin 300 0,5 % : irritante
R43 : puede provocar una sensibilización por contacto con la piel.
S28-37 : después del contacto con la piel, se procederá inmediatamente a un lavado con agua
abundante y jabón. Es preciso utilizar guantes apropiados.
Xi - Irritante
31

6 - PRECAUCIONES
La calidad de los resultados depende del respeto de las buenas prácticas de laboratorio siguientes :
• No se utilizarán los reactivos después de la fecha de caducidad.
• No se modificará el modo operatorio.
• Se reconstituirán con sumo cuidado los reactivos y se evitará cualquier contaminación.
• No mezclar en un mismo ensayo reactivos que procedan de lotes diferentes.
Nota: se pueden utilizar otros lotes de solución de lavado (R2, identificada 10 x en azul sobre la etiqueta), de
tampón sustrato (R8, identificado TMB buf. en azul), de cromógeno (R9, identificado TMB 11x. en violeta) y de
solución de parada (R10, identificado 1N en rojo), diferentes a los suministrados en el kit siempre y cuando se
utilice un mismo y único lote durante todo el ensayo. Estos reactivos también pueden utilizarse con otros productos
de nuestro laboratorio; contacte con nuestros servicios técnicos para una información más detallada.
• Antes de la utilización, se esperarán 30 minutos para que los reactivos se equilibren a la temperatura del laboratorio (18-30°C).
• No se llevará a cabo el test en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldehídos) o de polvos que
pudieran alterar la actividad enzimática de los conjugados.
• Se utilizarán frascos de vidrio perfectamente lavados y enjuagados con agua destilada o, con preferencia,
material de uso único.
• No se dejará secar la microplaca entre el final del lavado y el principio de la distribución de los reactivos.
• Se verificará la exactitud y la precisión de las pipetas y el buen funcionamiento de los aparatos utilizados.
• Lavado: es indispensable respetar escrupulosamente los procedimientos de lavado con el fin de obtener los
resultados máximos del test.
• No se utilizará jamás el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la solución de revelado.
• La reacción enzimática es muy sensible a todo metal o iones metálicos. En consecuencia, ningún elemento
metálico deberá entrar en contacto con las diferentes soluciones que contienen los conjugados o el substrato.
• La solución de revelado (tampón sustrato + cromógeno) debe estar coloreada en rosa. La aparición de otra
coloración en los minutos siguientes a la reconstitución indica que el reactivo es inutilizable y se debe sustituir.
Para esta preparación, utilizar preferentemente recipientes y material de distribución de plástico de uso único o
una cristalería previamente lavada con ácido clorhídrico 1N y perfectamente aclarada con agua destilada y
secada. Conservar esta preparación protegida de la luz.
7 - MUESTRAS
Se obtendrá una muestra de sangre según las prácticas habituales.
Las muestras que se pueden utilizar son: suero, plasma o las muestras de cultivo celular. Los anticoagulantes EDTA,
heparina, citrato sódico, CPDA-1 y ACD han sido evaluados y están considerados como utilizables. La cantidad de
las muestras obtenidas con la ayuda de tubos anticoagulantes deberá llegar hasta la altura del nivel indicado, con
el fin de evitar una mala dilución.
Se extraerá cuanto antes el suero o el plasma del coágulo o de los glóbulos rojos para evitar cualquier hemólisis.
Una hemólisis muy pronunciada puede afectar los resultados del test. Las muestras que tengan agregados han de
ser clarificadas mediante centrifugación antes del test. Las partículas o los agregados de fibrina en suspensión
pueden dar resultados falsamente positivos.
Las muestras de cultivo de células que necesitan una dilución antes de su utilización pueden diluirse con un medio
de cultivo celular equivalente al medio utilizado para el cultivo.
NO SE UTILIZARÁN MUESTRAS INACTIVADAS POR EL CALOR.
Las muestras se conservarán a + 2-8°C si la detección se lleva a cabo durante los 7 días posteriores a su obtención,
o bien se pueden conservar congeladas a – 20°C. Los plasmas se someterán a un descongelado rápido por
calentamiento durante varios minutos a 40°C (para limitar la precipitación de fibrina).
Debido a la inestabilidad del Ag VIH al calor, no se podrán utilizar temperaturas superiores a 40°C. Las muestras
que han sido congeladas y descongeladas más de 3 veces no se deberán utilizar.
Si las muestras deben ser transportadas, habrá que embalarlas según los reglamentos existentes para el transporte
de agentes etiológicos.
Se extraerá cuanto antes el suero o el plasma del coágulo o de los glóbulos rojos para evitar cualquier hemólisis.
NO SE UTILIZARÁN SUEROS O PLASMAS CONTAMINADOS, HYPERLIPÉMICOS O HIPERHEMOLIZADOS.
Observación: no se ha observado interferencia alguna en las muestras que contenían 80 mg / l de bilirrubina,
36mg / l de inmunoglobulina M o G, así como en las muestras lipémicas que contenían hasta 5 g/l de lípidos y
en las muestras hemolizadas que contenían hasta 5 g/l de hemoglobina.
32

8 - RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 a 30°C) antes de su utilización, con excepción de los
conjugados concentrados 1 y 2 (R4 y R5).
1) Reactivos listos para su empleo
Reactivo R1 : microplaca
Cada marco soporte con 12 tiras está incluido en un saquito "CREMALLERA". Córtese el saquito con la ayuda de
unas tijeras o una hoja de bisturí a una distancia de entre 0,5 y 1 cm por encima de la CREMALLERA. Ábrase el
saquito y sáquese el marco. Se repondrán en el saquito las tiras no utilizadas. Luego, se cerrará el saquito
cuidadosamente y se volverá a conservar a + 2-8°C.
Reactivo R3 : disolvente para muestras
Reactivo C0 : suero de control negativo
Reactivo C1 : suero de control positivo
Reactivo R10 : solución de interrupción
2) Reactivos para reconstituir
Solución de lavado concentrada 10 veces (R2)
Se diluye al 1/10 la solución R2 en agua destilada. Se homogeniza.
OBSERVACIÓN : La solución de lavado Genetic Systems EIA (30X), que forma parte de otro estuche Genetic
Systems, se puede también utilizar para este test. En tal caso, se diluye un volumen de solución de lavado
concentrada en 29 volúmenes de agua.
Solución de trabajo conjugado 1 (R4 + R6) y Solución de trabajo conjugado 2 (R5 + R6)
Los conjugados 1 (R4) y 2 (R5) son unas soluciones concentradas (100 X). Se prepara por separado la solución de
trabajo conjugado 1 y la solución de trabajo conjugado 2 diluyendo cada una de ellas al 1:101 en el disolvente
de conjugado (R6). Se lleva a cabo la preparación en recipientes limpios de plástico. Se inscribe sobre el recipiente
el número de lote, la fecha y la hora de preparación, y la fecha de los conjugados concentrados (1 o 2), así como
la hora límite de utilización (24 horas después de la preparación). Se mezclan despacio las soluciones de trabajo
antes de su utilización. Una vez mezcladas, la solución de trabajo conjugado 1 es amarilla y la solución de trabajo
conjugado 2 es verde.
Preparación de la solución de trabajo conjugado 1 o 2 por tira
Número de tiras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
necesarias
Cantidad de conjugado 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
concentrado (µl)
Cantidad de disolvente 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
de conjugado (ml)
*una placa entera ** dos placas enteras
Solución de revelado enzimático (R8 + R9)
Se diluye R9 en R8 al 1/11 (ejemplo : 1 ml de reactivo R9 en 10 ml de reactivo R8) a sabiendas de que 10 ml
son necesarios y suficientes para tratar 12 tiras. Se homogeneiza.
9 - VALIDEZ – CONSERVACIÓN
El estuche debe conservarse a + 2-8°C.
Cada elemento del estuche Genetic SystemsTM HIV-1 Antigen EIA conservado a + 2-8°C se puede utilizar después
de una primera abertura hasta la fecha de caducidad indicada sobre el estuche, salvo indicación específica:
R1 : después de la abertura del saquito, las tiras conservadas a + 2-8°C en su saquito de origen, cerrado con
cuidado, son estables durante 1 mes.
R2 : después de la dilución, la solución de lavado se conserva durante 14 días como máximo a + 2-8°C en un
recipiente de plástico.
R8 + R9 : después de la reconstitución, los reactivos conservados al abrigo de la luz son estables durante 6 horas
a temperatura ambiente (18-30°C).
R4 - R5 : después de la reconstitución, los conjugados son estables durante 24 horas a temperatura ambiente
(18-30°C).
33

10 - MODO OPERATORIO
A continuación se presentan dos procedimientos para la detección del antígeno p24 del VIH-1 en el suero o en el
plasma humanos o en muestras de cultivo celular :
Procedimiento Incubación Conjugado 1 Conjugado 2 Revelado
incubación incubación colorimétrico
Incubación Incubación estática Incubación estática Incubación estática 18 à 30°C,
37°C 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, en la oscuridad
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Incubación Incubación estática Incubación estática Incubación estática 18 à 30°C,
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, en la oscuridad
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Para las muestras sometidas a un test en un principio a 37 o 40°C, todo nuevo test o toda confirmación deberán
efectuarse de acuerdo con el mismo procedimiento.
La duración indicativa de este test es de cerca de 3h 30 a 4 horas a partir del inicio de la primera etapa de
incubación. Cada ciclo del procedimiento de utilización del test debe efectuarse íntegramente y sin interrupción una
vez comenzado.
Sobre cada placa se deben realizar dos controles positivos y tres controles negativos. En caso de que el test sea
efectuado con muestras de células, son necesarios tres controles negativos de medio de cultivo celular, en lugar del
control negativo del estuche (C0). El umbral de reactividad para las muestras de pacientes se determina con arreglo
a las señales obtenidas con los controles de cada placa individual.
Se evitará la exposición a la luz de las placas durante la última etapa de incubación (después de añadir la solución
de trabajo TMB).
Se ha de seguir estrictamente el protocolo propuesto y aplicar las buenas prácticas de laboratorio:
1. Establecimiento cuidadoso del plan de distribución y de identificación de las muestras
2. Preparación de la solución diluida de lavado
3. Extracción del marco soporte y las tiras (R1) del embalaje protector
4. Disposición directa, sin lavado previo de la placa y sucesivamente (sugerencia de plan de distribución de la
placa) :
4.1 50 µl de disolvente de muestra en cada pocillo
4.2 150 µl de control negativo (C0) en A1-B1-C1
4.3 150 µl de control positivo (C1) en D1-E1
4.4 150 µl de muestra en G1, etc.
En caso de que el test se lleve a cabo con muestras de células, son necesarios tres controles negativos de medio
de cultivo celular en lugar del control negativo del estuche (C0). Es preciso asegurarse de que el disolvente de
muestra está bien mezclado con la muestra (o con el control).
NB: la distribución de las muestras y del disolvente de muestras se puede controlar visualmente en este estadio
de la manipulación: el disolvente de muestra cambia del verde al azul para señalar que la muestra o el control
han sido añadidos en el pozo. Cuando las soluciones contenidas en cada pozo están bien mezcladas, tienen
un color uniforme.
Puede que las muestras de cultivo celular no cambien de color con arreglo al medio de cultivo utilizado.
(para la comprobación automática es preciso referirse al capítulo 12 - VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA
DEL PIPETEADO DE LAS MUESTRAS).
5. Cuando sea posible, se cubrirá con una película autoadhesiva, procurando apretar bien toda la superficie para
asegurar la impermeabilidad.
6. Se incuba la placa durante 60 ± 5 minutos a 37 ± 1°C o a 40 ± 1°C con una incubadora estática de calor seco.
7. Se retira la película adhesiva. Se aspira el contenido de todos las pocillos en un contenedor para desechos
contaminados (que contenga hipoclorito sódico) y se añade inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de
0,370 ml de solución de lavado. Se respeta un tiempo de remojo (tiempo de espera) de 20 a 60 segundos. Se
aspira de nuevo. Se repite el lavado 4 veces (un mínimo de 5 lavados). El volumen residual debe ser inferior a
10 µl (si es necesario, se ha de secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente).
Si se dispone de un lavador automático, se ha de respetar el mismo ciclo operatorio
8. Se distribuyen rápidamente 100 µl de la solución de trabajo conjugado 1 en todos las pocillos. El conjugado se
34

ha de agitar antes de su empleo.
N.B. La distribución de la solución de trabajo del conjugado 1 que está coloreada de color amarillo se puede
verificar visualmente en este estadio de la manipulación.
9. Si es posible, se recubre la microplaca con una nueva película. Se incuba 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C en una incubadora estática de calor seco.
10. Se retira la película adhesiva. Se aspira el contenido de todos las pocillos en un contenedor para desechos
contaminados (que contenga hipoclorito sódico) y se añade inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de
0,370 ml de solución de lavado. Se respeta un tiempo de remojo (tiempo de espera) de 20 a 60 segundos. Se
aspira de nuevo. Se repite el lavado 4 veces (un mínimo de 5 lavados). El volumen residual debe ser inferior a
10 µl (si es necesario, se secará la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente).
11. Se distribuyen rápidamente 100 µl de la solución de trabajo conjugado 2 en todos los pocillos. El conjugado se
debe agitar antes de su empleo.
N.B. La distribución de la solución de trabajo del conjugado 2 que está coloreada de verde se puede verificar
visualmente en este estadio de la manipulación
12. Si es posible, se recubre la microplaca con una nueva película. Se incuba 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C en una incubadora estática de calor seco.
13. Se retira la película adhesiva, se vacían todos los pocillos por aspiración y se lavan por lo menos 5 veces, como
anteriormente. El volumen residual debe ser inferior a 10 µl (si es necesario, se secan las tiras dándoles la vuelta
sobre una hoja de papel absorbente).
14. Distribuir rápidamente en todos los pocillos 100 µl de la solución de revelado de la actividad enzimática (R8
+ R9) previamente preparada. Dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a
temperatura ambiente (18 a 30°C). Durante esta incubación, no utilizar película adhesiva.
N.B.: La distribución de la solución de revelado, que presenta un color rosa, puede controlarse visualmente en
esta etapa de la manipulación: hay una diferencia de coloración significativa entre un pocillo vacío y un pocillo
que contiene la solución de revelado rosada (ver apartado 12 para la comprobación automática
COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS)
15. Añadir 100 µl de solución de parada (R10) manteniendo la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución
que para la solución de revelado. Homogeneizar la mezcla de reacción.
N.B.: La distribución de la solución de parada, que es incolora, puede controlarse visualmente en esta etapa de
la manipulación. La coloración del sustrato, rosa (en caso de muestras negativas) o azul (en caso de muestras
positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (si las muestras son negativas) o amarillos (si las
muestras son positivas) tras la adición de la solución de parada.
16. Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Esperar un mínimo de 4 minutos tras la distribución de la
solución de parada y, en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción, leer la densidad óptica a
450/620-700 nm con un lector de placas.
17. Antes de la transcripción de los resultados es preciso asegurarse de la concordancia entre la lectura y el plan de
distribución y de identificación de las placas y de las muestras.
11 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1) Validación del ensayo
Un test es válido si se cumplen los criterios siguientes:
• Los valores de absorbancia individuales de los controles negativos (o controles de medio de cultivo de células, si
llega el caso) deben ser superiores a 0,000 UA e inferiores o iguales a 0,100 UA. Uno de los valores de
absorbancia de uno pocillo del control negativo se puede eliminar si está situado fuera de estas normas. La media
de los controles negativos se puede calcular en este caso a partir de ambos valores restantes de absorbancia. Si
dos controles negativos o más no respetan estos criterios, la dosificación se debe efectuar de nuevo.
• Las absorbancias medias de los controles positivos deben ser superiores o iguales a 0,500 UA y el valor de absorbancia
de cada control positivo debe estar situado en el ámbito de reproducibilidad de 0,65 a 1,35 veces la media de los
controles positivos. Todos los valores de absorbancia de los controles positivos se deben tomar en consideración.
2) Cálculo de la media de las absorbancias
A partir de los controles validados, se determinan las absorbancias medias de los controles negativos y positivos
dividiendo la suma de sus valores de absorbancia por el número de controles utilizados.
3) Cálculo del valor umbral
El valor umbral se calcula sumando un factor constante (0,070) al valor de absorbancia media de los controles
negativos (CNX).
Valor umbral = 0,070 + CNX
35

Ejemplo :
CNX = 0,033
Valor umbral = 0,070 + 0,033 = 0,103
4) Interpretación de los resultados
La presencia o la ausencia del antígeno VIH1 se determinan comparando para cada muestra la absorbancia
registrada con la del valor umbral calculado.
Las muestras cuyos valores de absorbancia sean inferiores a 0,000 se deben someter a un nuevo test. Las muestras cuyos
valores de absorbancia sean superiores a los límites de linealidad del lector están consideradas como reactivas.
Las muestras cuyos valores de absorbancia sean inferiores al valor umbral están consideradas como no reactivas
al test EIA Antigen VIH-1 Genetic Systems y pueden ser consideradas como negativas para el antígeno VIH-1. En
este caso, no es necesario efectuar otro test.
Las muestras cuyos valores de absorbancia sean superiores o iguales al valor umbral están consideradas como
inicialmente reactivas al test EIA Genetic Systems Antigen VIH-1. Las muestras inicialmente reactivas se deben
someter a un nuevo test dos veces, con el fin de validar los resultados del test inicial. Si después de estos nuevos
tests los dos nuevos valores de absorbancia obtenidos son inferiores al valor umbral, el resultado inicial no es
reproducible y la muestra de origen se considera negativa para el antígeno VIH-1 según el test «Genetic Systems
HIV-1 Antigen». El origen de las reacciones no reproducibles está a menudo relacionado con las causas siguientes:
• lavado insuficiente de las microplacas,
• contaminación cruzada de muestras no reactivas por una muestra con fuerte valoración de antígeno VIH-1.
• contaminación puntual de la solución de revelado por agentes químicos oxidantes (lejía, iones metálicos, etc.).
• contaminación puntual de la solución de interrupción.
Si después de repetir el ensayo, el valor de absorbancia medido sobre uno de ambos dobletes es superior o igual
al valor umbral, el resultado inicial es reproducible y la muestra se considera reactiva según el test Genetic Systems
HIV-1 Antigen, conforme a los límites descritos a continuación. Las muestras cuya reactividad ha sido repetida con
el test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA se deben confirmar con el test Genetic Systems HIV-1 Antigen
Confirmatory Assay (código : 71121). La muestra se puede considerar como positiva para el antígeno VIH-1
solamente si el antígeno VIH-1 queda neutralizado en el momento del procedimiento de confirmación.
12 - VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL PIPETEADO DE LAS MUESTRAS
Y DELOS REACTIVOS
Verificatión espectrofotométrica del pipeteado de las muestras
Después de la distribución sucesiva del disolvente de las muestras (R3) y luego de las muestras, es posible verificar
la presencia de las muestras que hay que someter a un test en los pocillos mediante una lectura espectrofotométrica
de 620 nm: la densidad óptica de una pocillo que contiene una muestra deberá ser superior a 0,250 (una DO
inferior indica una mala distribución de ésta).
Observación : las muestras de cultivo celular pueden no cambiar color con arreglo al medio utilizado de cultivo. En
este caso, no se aplica esta comprobación automática.
Verificatión espectrofotométrica de la distribución de la solución de revelado
Se puede comprobar la presencia de la solución de revelado rosada mediante la lectura automática a 490 nm: un
pocillo que contiene la solución de revelado debe tener una densidad óptica superior a 0,100 (una DO más baja
indica una distribución incorrecta de la solución de revelado).
Existe una diferencia de coloración significativa entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene la solución de
revelado rosada.
13 - RESULTADOS
Sensibilidad diagnóstica
• 138 muestras de pacientes infectados por el VIH en diferentes estadios de la infección (AIDS, ARC, otros) fueron
sometidas a un test y dieron positivo con el test Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA.
• Se han estudiado 20 grupos de seroconversión bien documentados. Los resultados obtenidos son comparables a
los resultados obtenidos con otros tests de dosificación del antígeno HIV.
• 55 sobrenadantes de cultivos celulares de VIH1 (entre ellos 53 del grupo M y 2 del grupo O), así como el grupo
de dilución «Ag VIH SFTS 96», dieron positivo con el test Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA, a excepción de 2
diluciones de un sobrenadante de cultivo celular de grupo O.
- Los 53 sobrenadantes de cultivos celulares de VIH1 de grupo M estaban compuestos por los siguientes
genotipos: 10 del genotipo A, 10 de B, 9 de C, 5 de D, 11 de E, 2 de F, 2 de G, 1 de H, 2 de J y 1 de N.
- El grupo de dilución «Ag VIH SFTS 96» comprende los genotipos siguientes: A, B, C, D, E, F, G, H del grupo
M y 1 genotipo de grupo O.
36

Sensibilidad analítica
El umbral de sensibilidad del test ha sido evaluado con una serie de diluciones preparadas según el estándar
nacional francés (lisado vírico purificado de genotipo B diluido en plasma citrado negativo), así como el grupo BBI
(PRA 801). En el momento de estos ensayos, el umbral de detección tenía un valor de 8 pg / ml de antígeno HIV,
sea cual sea el protocolo utilizado.
La gama de amplitud obtenida con el estándar HIV-1 Ag Standard (código 72217) de Bio-Rad es lineal de 0 a 100 pg / ml.
Especificidad diagnóstica
La especificidad diagnóstica del test, determinada a partir de una población de 4038 donantes de sangre, se
estima en un 99,95 %. En 209 pacientes clínicos se estimó al 100%.
Se sometió a un test un grupo de 105 muestras de pacientes. Comprendía muestras :
• Que contenían anticuerpos dirigidos contra HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubeola, Toxoplasma Gondii, Treponema
pallidum, CMV
• Que contenían autoanticuerpos, índices elevados de IgG, de IgM de factor reumatoideo
• Provenientes de mujeres embarazadas, de enfermos con cirrosis, de pacientes que habían recibido muchas
transfusiones y de pacientes cons lupus eritematoso generalizado.
Sólo se encontró una muestra reactiva con el test Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA, proveniente de un pacientes
con lupus eritematoso generalizado, pero no fue confirmada con el test de confirmación.
Precisión
Se estudió la reproducibilidad dentro del mismo ensayo sometiendo a test 3 muestras positivas y 1 negativa,
30 veces cada una, durante el mismo ensayo.
Se estudió la reproducibilidad entre ensayos diferentes sometiendo a test 3 muestras positivas y 1 negativa por
triplicado durante 5 días, por dos técnicos diferentes.
Los coeficientes de variación obtenidos con las muestras positivas sometidas a un test fueron inferiores al 10 %.
14 - LÍMITES DEL TEST
• El procedimiento del test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA y el modo de interpretación de los resultados se
deben utilizar para la búsqueda del antígeno VIH-1 en muestras de suero, de plasma o de cultivos celulares. Se
recomienda a los usuarios de este estuche que lean con atención la presente nota de utilización antes de llevar
a cabo el test. Es importante respetar los procedimientos del test, en particular en lo relativo al pipeteado de las
muestras y de los reactivos, al lavado de las placas y a la duración de las etapas de incubación.
• No se debe considerar que una muestra es como reactiva al el antígeno VIH-1 a partir de un solo resultado
reactivo. Con el fin de establecer la especificidad de la reactividad de cada muestra según este test, es necesario
efectuar nuevas dosificaciones, por ejemplo, un test de confirmación.
• Todo test inmunoenzimático altamente sensible puede estar sujeto a reacciones no específicas que pueden dar
lugar a resultados falsamente positivos. La proporción de las muestras reactivas falsamente reactivas depende de
la sensibilidad y de la especificidad del estuche utilizado.
• Se pueden obtener resultados negativos con muestras cuyo índice de antígeno VIH es demasiado bajo en
comparación con los límites de detección del test y, asimismo, se pueden observar resultados negativos si el
marcador buscado no está presente en el estadio de la enfermedad en que se obtuvo la muestra.
• La variabilidad del virus VIH no permite excluir la posibilidad de reacciones falsamente negativas. Ningún
método conocido puede ofrecer la seguridad de que el virus VIH está ausente.
• Si la adición de muestra o de reactivo no se ha llevado a cabo conforme a las instrucciones, es posible obtener
un resultado falsamente negativo. En caso de sospecha clínica de infección o de error en el curso del
procedimiento se debe prever el efectuar una nueva dosificación
• Un valor de absorbancia inferior a 0,000 UA señala un error en el curso del procedimiento o un problema
vinculado al material. Se debe someter a un nuevo test la muestra concernida.
• Los factores que pueden afectar la validez de los resultados son los siguientes : depósito deficiente de la muestra
en el pozo, mal lavado de los pocillos de las microplacas, incumplimiento de los tiempos y de las temperaturas
de incubación indicados, errores en los depósitos de los reactivos, presencia de metales o de lejía en los pocillos.
• Las realizaciones de este test no han sido evaluados con muestras post mortem o con otros fluidos biológicos
aparte de suero o plasma o muestras de cultivo celular.
• La sensibilidad analítica, considerada como 8 pg / ml en el momento de las evaluaciones del test, puede variar
con arreglo a las condiciones operatorias y a la variabilidad entre los lotes. En consecuencia, Bio-Rad sólo puede
garantizar una sensibilidad analítica inferior a 15 pg / ml.
• La coloración del disolvente de las muestras puede no modificarse en presencia de muestras de cultivo celular,
en función del medio de cultivo utilizado.
37

• El método colorimétrico de comprobación de la distribución de las muestras y/o de los conjugados y/o de la
solución de revelado no permite comprobar la exactitud de los volúmenes dispensados: únicamente indica la
presencia de muestras y/o de conjugados y/o de la solución de revelado. El grado de respuestas erróneas
obtenidas con este método está en relación con la precisión del sistema utilizado (los CV acumulados de pipeteo
y de lectura superiores al 10% pueden rebajar significativamente la calidad de esta comprobación).
• En el caso de un lavado incorrecto tras la etapa de incubación del conjugado, la comprobación automática de
la distribución de la solución de revelado (mediante la lectura a 490 nm de las densidades ópticas de los pocillos)
puede dar resultados erróneos con densidades ópticas superiores a 0,100 en ausencia de solución de revelado.
Sin embargo, este fenómeno no se ha observado durante las evaluaciones realizadas en 939 muestras
ensayadas.
15 - REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS
Vésae la versión francesa
38

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tests 71120
ENZYMIMMUNOASSAY (EIA) ZUM NACHWEIS DES P24-ANTIGENS
VON HIVTYP I (HUMANES IMMUNDEFIZIENZ VIRUS)
IN HUMANSERUM, -PLASMA UND ZELLKULTURÜBERSTAND
IVD
Qualitätskontrolle des Herstellers
Alle hergestellten oder im Handel erhältlichen Reagenzien unterliegen einem umfassenden
Qualitätssystem vom Eingang der Rohmaterialien bis zur Vermarktung des Produktes.
Jede Charge unterliegt einer Qualitätskontrolle und wird nur für den Markt freigegeben, wenn die
Akzeptanzkriterien erfüllt sind.
Die Produktions- und Kontrolldokumentation zu jeder einzelnen Charge wird in der Firma
aufbewahrt.
39

INHALT
1 - KLINISCHE BEDEUTUNG
2 - PRINZIP DES GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - INHALT DES GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA KITS
4 - BENÖTIGTE,JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN
5 - SICHERHEITSVORSCHRIFTEN
6 - VORSICHTSMASSNAHMEN
7 - ENTNAHME UND HANDHABUNG DER PROBEN
8 - REKONSTITUTION DER REAGENZIEN
9 - LAGERUNGSBEDINGUNGEN - HALTBARKEIT
10 - TESTDURCHFÜHRUNG
11 - BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
12 - SPEKTROPHOTOMETRISCHE ÜBERPRÜFUNG DER PROBEN- UND REAGENZPIPETTIERUNG
13 - LEISTUNGSFÄHIGKEIT DES TESTS
14 - GRENZEN DES TESTS
15 - LITERATUR
40

1 - KLINISCHE BEDEUTUNG
Erreger des Immunschwächesyndroms AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) ist ein Retrovirus, das
sogenannte humane Immundefizienzvirus (HIV). HIV wurde von AIDS-Patienten sowie von gesunden Personen mit
hohem AIDS-Risiko isoliert ( 1,2 ). Das Virus wird durch Sexualkontakt, über kontaminierte Nadeln, durch Transfusionen
kontaminierter Blutprodukte und perinatal von der infizierten Mutter auf den Föten oder das Kind übertragen.( 1,8 )
Eine frühere Exposition gegenüber HIV wird in der Regel durch vorhandene virusspezifische Antikörper im Serum
oder Plasma nach Exposition gegenüber dem Virus nachgewiesen. Bevor nachweisbare Antikörper vorhanden sind,
zirkulieren in einem frühen Stadium Virusantigene im Blut. Eines dieser Virusantigene ist das Virus-Core-Protein p24.
Mit HIV-Antigen-Assays können vorhandene Virusantigene und somit eine HIV-Infektion vor der Serokonversion
nachgewiesen werden. Der Zeitraum der Antigenämie vor Auftreten von HIV-Antikörpern schwankt bei Infizierten
zwischen Tagen und Wochen. Bei der Serokonversion bilden virusspezifische Antikörper mit den zirkulierenden
Antigenen einen Komplex, so dass die Konzentrationen an freien Antigenen im Blut sinken oder nicht mehr
nachweisbar sind.( 9,11 ) Im Verlauf der Krankheit kann sich jedoch erneut eine Antigenämie entwickeln 12 .
Der Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA ist für das Screening von Blut- und Plasmaspenden und als Hilfe für die
Diagnose und Prognose einer HIV-1-Infektion vorgesehen.
2 - PRINZIP DES GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
Der Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA basiert auf der Verwendung einer mit monoklonalemMaus-Anti--HIV-1-
Antigen beschichteten Festphase, eines ersten Konjugates aus biotinyliertem Anti-p24-Antikörper (Schaf) und einem
zweiten Konjugat aus Avidin, gebunden an Meerrettich-Peroxidase.
Die Testdurchführung umfasst folgende Reaktionsschritte:
1. Probenverdünnungsmittel wird in jede Vertiefung pipettiert. Die zu testenden Proben und die Kontrollseren werden
in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert. Ist HIV-1 Ag in der Probe vorhanden, bindet dieses an die
Antikörper in der Vertiefung. Gebundenes HIV-1 Ag bleibt während des darauf folgenden Waschschrittes
gebunden.
Die Farbe des Probenverdünnungsmittels ändert sich von grün nach blau. Damit wird bestätigt, dass Probe (oder
Kontrolle) in die Vertiefung pipettiert wurde.
2. Konjugat 1 wird jeder Vertiefung zugesetzt und die Mikrotiterplatte wird inkubiert. Dadurch kann der biotinylierte
Anti-p24-Antikörper (Schaf) in Konjugat 1 an das in der Vertiefung gebundene HIV-1 Ag binden. Die Antigen-
Antikörper-Komplexe bleiben während des darauf folgenden Waschschrittes gebunden.
3. Anschließend wird Konjugat 2 jeder Vertiefung zugesetzt und die Mikrotiterplatte wird erneut inkubiert. Das
Avidin in Konjugat 2 bindet spezifisch an die Antikörper-HIV-1 Ag-Komplexe in der Vertiefung. Durch den
nachfolgenden Waschschritt wird ungebundenes Konjugat entfernt.
4. Die angesetzte TMB- Lösung wird der Platte zugesetzt und inkubiert. Eine blaue oder blau-grüne Färbung
entwickelt sich im Verhältnis zu der in der Probe vorhandenen Menge an HIV-1 Ag. Die Farbentwicklung wird
durch Zugabe von Säure gestoppt, so dass die Farbe von blau-grün nach gelb umschlägt. Die Extinktion der
Proben und Kontrollen wird in einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 450/620-700 nm bestimmt.
41

3 - INHALT DES GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA KITS
ETIKETT ART DER REAGENZIEN DARREICHUNGS-
FORM
71120
R1 MIKROTITERPLATTE 2 Platten
12 Streifen mit 8 Vertiefungen, beschichtet mit monoklonalem
Maus- Antikörper gegen HIV-1 p24
Konservierungsmittel : ProClin 300, Natriumazid (< 0,1%)
R2 Konzentrierte Waschlösung (10x) 1 Flasche
Puffer Tris NaCl pH 7,4
250 ml
Konservierungsmittel : 0,01 % Natriummerthiolat
R3 Probenverdünnungsmittel 1 Flasche
Konservierungsmittel : 0,5% ProClin 300
20 ml
Probenfarbzusatz (grün)
C0 Negatives Kontrollserum (human) 1 Flasche
Humanserum, nicht reaktiv für HIV-Antigen, HBs Ag und
10 ml
Antikörper gegen HIV-1, HIV-2, HCV und HTLV-10,005% Gentamicin-Sulfat
Konservierungsmittel : 0,5% ProClin 300
C1 Positives Kontrollserum 1 Flasche
Gereinigtes, aufgespaltenes HIV-1-p24 Antigen
7 ml
Konservierungsmittel : 0,5 % ProClin 300
R4 Konzentriertes Konjugat 1 (100x) 1 Flasche
Anti-p24-Konjugat (Schaf) 0,005 % Gentamicin-Sulfat
1 ml
Konservierungsmittel : 0,5 % ProClin 300
Gelber Farbstoff
R5 Konzentriertes Konjugat 2 (100x) 1 Flasche
Avidin-Peroxydase Konjugat 0,005% Gentamicin-Sulfat
1 ml
Konservierungsmittel : 0,5% ProClin 300
Grüner Farbstoff
R6 Konjugatverdünnungsmittel 1 Flasche
Puffer mit Proteinstabilisatoren
100 ml
Konservierungsmittel : 0,5% ProClin 300
R8 Substratpuffer 1 Flasche
Zitronensäure/Natriumacetatpuffer pH 4,0 Wasserstoffperoxid 0,015%
60 ml
Dimethylsulfoxid (DMSO) 4%
R9 Chromogen 1 Flasche
Tetramethylbenzidin (TMB)
5 ml
R10 Stopplösung 2 Flasche
1N H 2 SO 4
2 x 28 ml
Folie zum Versiegeln der Platten
25 films
4 - BENÖTIGTE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN
• Destilliertes Wasser
• Chlorbleichlauge (5% - 8% Natriumhypochloridlösung), die auf eine Mindestkonzentration von 10% Bleichlauge
(oder 0,5% Natriumhypochloridlösung) verdünnt werden kann. Andere Desinfektionsmittel: 70% Ethanol oder
0,5% Wescodyne (West Chemical Products, Inc.).
• Präzisionspipetten zum Pipettieren von 10 µl, 200 µl, 1 ml, 5 ml und 10 ml (Genauigkeit innerhalb von ± 10%).
Eine Mehrkanalpipette zum Pipettieren von 100 µl oder 200 µl (wahlweise).
• Zylinder mit Maßeinteilung für 25 ml, 100 ml und 1000 ml.
• Behälter für infektiösen Abfall.
42

• Wasserbad oder Trockeninkubator*, auf 37°C ± 1°C oder 40°C ± 1°C eingestellt.
• Manuelles, halbautomatisches oder automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät (*).
• Mikrotiterplatten-Lesegerät, mit 450 nm- und 620 .- 700 nm-Filtern (*).
• Null-Streifen zum Testen auf einem Automaten.
• EIA-Reagenzienbehälter (wahlweise).
• Einweghandschuhe.
• Saugfähige Papiertücher.
• Saubere Kunststoffbehälter (aus Polystyrol oder Polypropylen) zur Herstellung der Konjugatarbeitslösung und der
TMB-Lösung.
• Zellkulturmedium, z. B. RPMI-1640 mit 10% fötalem Kälberserum, entsprechend dem für die infizierte Zellkultur
benutzten (bei Analyse von Zellkulturproben).
(*) Weitere Informationen zu den von uns empfohlenen Geräten erhalten Sie beim Technischen Service .
5 - SICHERHEITSVORSCHRIFTEN
Alle Reagenzien in diesem Kit sind für die In-vitro-Diagnostik bestimmt.
• Beim Umgang mit Reagenzien und Proben Einweghandschuhe tragen und anschließend gründlich die Hände
waschen.
• Nicht mit dem Mund pipettieren.
• Das Humanmaterial zur Herstellung der Negativkontrolle wurde getestet und war nicht reaktiv für HIV-1-Antigen,
Antikörper gegen HIV-1, HIV-2, Hepatitis-B-Antigen (HBs Ag), Antikörper gegen HCV, HTLV-1/HTLV-2
• Die Positivkontrolle ist in Anwesenheit eines dissoziierenden Reagenzes hitzeinaktiviert.
• Da mit keiner heute bekannten Testmethode mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden kann, dass HIV-,
Hepatitis B- oder C-Viren oder andere infektiöse Erreger vorhanden sind, sollten alle Reagenzien und
Patientenproben als potentiell infektiös angesehen und mit entsprechender Sorgfalt gehandhabt werden.
• Alle Materialien, die mit Proben und Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen,
einschließlich der Pufferlösungen, sollten als potentiell infektiös betrachtet und entsprechend gehandhabt werden.
• Verschütten von Proben oder probenhaltigen Lösungen vermeiden.
• Kontaminierte Oberflächen sollten mit 10%iger verdünnter Bleichlauge gereinigt werden. Wenn es sich bei der
kontaminierenden Flüssigkeit um eine Säure handelt, muss die kontaminierte Oberfläche zunächst mit
Natriumbicarbonat neutralisiert und anschließend mit Natriumhypochloridlösung gereinigt und mit Papiertüchern
getrocknet werden. Das zum Reinigen verwendete Material muss in einen Behälter für infektiösen Abfall entsorgt
werden.
• Proben, Reagenzien, die Material humanen Ursprungs enthalten, sowie kontaminierte Materialien und Produkte
sollten nach einer Dekontaminierung entsorgt werden, und zwar
- entweder durch Eintauchen in Natriumhypochloridlösung mit einer Natriumhypochlorid-Endkonzentration von
5% (1 Teil Natriumhypochloridlösung auf 10 Teile kontaminierte Flüssigkeit oder Wasser) für die Dauer von
30 Minuten
- oder durch Autoklavieren bei 121°C für mindestens 2 Stunden.
VORSICHT : NATRIUMHYPOCHLORIDHALTIGE LÖSUNGEN NICHT IN DEN AUTOKLAVEN STELLEN.
• Ein Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage erhältlich.
• Substratpuffer, Chromogen und Stopplösung nicht mit der Haut oder den Schleimhäuten in Berührung bringen
(giftig, reizend und kann Verbrennungen verursachen).
• Waschabfälle oder Flüssigkeiten, die biologische Proben enthalten, müssen vor dem Ausgießen in den Abfluss
neutralisiert und/oder autoklaviert werden.
• Chemikalien müssen gemäß den GLP-Richtlinien gehandhabt und entsorgt werden.
• Einige Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann zur Bildung von Blei- oder
Kupferaziden in Rohrleitungen führen. Solche Azide können explosiv sein. Um die Azidbildung zu vermeiden,
Leitungen mit reichlich Wasser nachspülen, wenn die azidhaltigen Lösungen nach Inaktivierung über den Abfluss
entsorgt werden.
• Einige Reagenzien enthalten 0,5% ProClin 300.
ProClin 300 < 0,5%: Reizend
R43 : Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich.
S28-37 : Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Seife und Wasser abwaschen.
Geeignete Schutzhandschuhe tragen.
Xi - Reizend
43

6 - VORSICHTSMASSNAHMEN
Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt von der korrekten Anwendung folgender GLP-Richtlinien ab :
• Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.
• Das Testverfahren darf nicht geändert werden.
• Reagenzien vorsichtig auflösen und jegliche Kontamination vermeiden.
• Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen innerhalb einer Messreihe vermischen.
Anmerkung : Für die Waschlösung (R2, Etikett: 10 x, blau), Peroxidase-Substrat-Puffer (R8, Etikett: TMB-Puffer,
blau), Chromogen (R9, Etikett: TMB, 11x, violett) und die Stopplösung (R10, Etikett: 1N rot) können Chargen
aus unterschiedlichen Kits miteinander verwendet werden, sofern immer die gleiche Charge für eine bestimmte
Messreihe verwendet wird. Diese Reagenzien können mit einigen anderen Produkten unserer Firma verwendet
werden. Detaillierte Informationen erhalten Sie von unserer Technikabteilung.
• Vor der Verwendung 30 Minuten warten, damit sich die Reagenzien bei Raumtemperatur (18 - 30°C) stabilisieren.
• Den Test nicht durchführen, wenn Staub oder reaktive Dämpfe (saure, alkalische, Aldehyd-Dämpfe) vorhanden
sind, die zu Veränderungen der Enzymaktivität des Konjugats führen können.
• Sorgfältig gewaschene und mit destilliertem Wasser gespülte Glasgefäße oder vorzugsweise Einwegmaterial
verwenden.
• Die Mikrotiterplatte nach Beendigung des Waschvorgangs und vor dem Pipettieren der Reagenzien nicht
austrocknen lassen.
• Für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden.
• Die Pipetten auf Genauigkeit, Präzision und Funktionstüchtigkeit überprüfen.
• WASCHEN: Die beschriebenen Waschschritte befolgen, um eine optimale Leistung des Tests zu erreichen.
• Nie das gleiche Gefäß zum Pipettieren des Konjugates und der Farbentwicklungslösung verwenden.
• Die Enzymreaktion weist gegenüber Metallionen eine hohe Sensitivität auf. Daher dürfen Metallelemente nicht mit
den verschiedenen Konjugat- und Substratlösungen in Berührung kommen.
• Die Entwicklungslösung (Substratpuffer + Chromogen) muss pink sein. Tritt wenige Minuten nach der Auflösung
eine pinke Verfärbung auf, darf das Reagenz nicht verwendet werden und muss ersetzt werden. Die
Entwicklungslösung kann in sauberen Einwegblotwannen aus Kunststoff oder in Glasgefäßen vorbereitet werden,
die zuvor mit 1N HCl gewaschen und mit destilliertem Wasser gründlich gespült und getrocknet wurden. Dieses
Reagenz muss lichtgeschützt aufbewahrt werden.
7 - ENTNAHME UND HANDHABUNG DER PROBEN
Die Blutproben gemäß der gültigen Richtlinien entnehmen.
Für die Analyse können Serum-, Plasma- oder Zellkulturproben verwendet werden. Folgende Antikoagulanzien
wurden evaluiert und als akzeptabel befunden : EDTA, Heparin, Natriumcitrat, CPDA-1 und ACD. Werden Proben
in Röhrchen mit Antikoagulanzien gesammelt, sollten die Röhrchen gemäß der Angaben gefüllt werden, um eine
falsche Verdünnung zu vermeiden.
Das Serum bzw. das Plasma vom Blutkuchen bzw. den Erythrozyten so schnell wie möglich trennen, um eine
Hämolyse zu vermeiden. Eine starke Hämolyse kann die Testleistung beeinträchtigen. Proben, die Partikel enthalten,
müssen vor dem Test durch Zentrifugation geklärt werden. Aufgeschwemmte Fibrinaggregate oder -partikel können
zu falsch positiven Ergebnissen führen.
Zellkulturproben, die vor der Analyse verdünnt werden müssen, können mit Zellkulturmedium verdünnt werden, das
dem für die Zellkultur entspricht.
KEINE HITZEINAKTIVIERTEN PROBEN VERWENDEN.
Die Proben sollten bei +2 - 8°C gelagert werden, sofern die Analyse innerhalb von 7 Tagen erfolgt, andernfalls
sollten sie bei -20°C tiefgefroren aufbewahrt werden. Plasmaproben sollten rasch aufgetaut werden, indem sie
wenige Minuten im Wasserbad auf 40°C erwärmt werden (um die Fibrinausfällung auf ein Minimum zu reduzieren).
Aufgrund der Instabilität von HIV Ag, können keine Temperaturen über 40°C angewendet werden.
Proben, die mehr als dreimal eingefroren und wieder aufgetaut wurden, können nicht verwendet werden.
Zum Transport sind die Proben gemäß den Bestimmungen für den Transport infektiöser Stoffe zu verpacken.
KEINE KONTAMINIERTEN, HYPERLIPÄMISCHEN ODER STARK HÄMOLYTISCHEN SEREN ODER PLASMEN
VERWENDEN.
Anmerkung : Proben mit einer Bilirubinkonzentration bis 80 mg/l, einer Konzentration an Immunglobulin M oder G
bis 36 mg/l, lipämische Proben mit einer entsprechenden Konzentration an Lipiden bis 5 g/l sowie hämolytische
Proben mit einer Hämoglobinkonzentration bis 5 g/l beeinträchtigen die Ergebnisse nicht.
44

8 - REKONSTITUTION DER REAGENZIEN
Anmerkung: Die Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (18 -30°C) bringen, ausgenommen die
konzentrierten Konjugate 1 und 2 (R4 und R5).
1) Gebrauchsfertige Reagenzien
Reagenz R1 : Mikrotiterplatte
Jeder Rahmen mit 12 Teststreifen a´8 Vertiefungen ist in einen versiegelten Folienbeutel verpackt. Den Beutel mit einer
Schere oder einem Skalpell 0,5 – 1 cm über der Linie abschneiden. Den Beutel öffnen und die Mikrotiterplatte
herausnehmen. Unbenutzte Streifen zurück in den Beutel stecken. Den Beutel wieder versiegeln und bei +2-8°C lagern.
Reagenz R3 : Probenverdünnungsmittel
Reagenz C0 : Negatives Kontrollserum
Reagenz C1 : Positives Kontrollserum
Reagenz R10 : Stopplösung
2) Anzusetzende Reagenzien
Waschlösung (10fach) (R2)
Waschlösung R2 im Verhältnis 1:10 in destilliertem Wasser mischen.
ANMERKUNG : Die Genetic Systems EIA konzentrierte Waschlösung (30fach), eine Komponente anderer Genetic
Systems-Testkits, kann auch für diesen Assay verwendet werden. 1 Teil Konzentrat mit 29 Teilen Wasser verdünnen.
Konjugatlösung 1 (R4 + R6) und Konjugatlösung 2 (R5 + R6)
Die Konjugate 1 (R4) und 2 (R5) werden 100fach konzentriert geliefert. Die Konjugat-Arbeitslösung 1 und Konjugat-
Arbeitslösung 2 durch Verdünnen jedes Konjugates im Verhältnis 1:100 in Konjugatverdünnungsmittel (R6)
in sauberen Kunststoffgefäßen herstellen. Beschriften Sie die Gefäße mit der Chargennummer des
Konjugatkonzentrates, Datum und Zeitpunkt der Herstellung sowie Verfallsdatum und –zeitpunkt (24 Stunden nach
der Herstellung). Vor der Verwendung die Arbeitsreagenzien vorsichtig mischen. Nach dem Mischvorgang ist die
Konjugatlösung 1 gelb und die Konjugatlösung 2 grün.
Herstellung der Konjugat-Arbeitslösung 1 oder 2 pro Streifen
Anzahl der zu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
verwendenden Streifen
Konjugatmenge 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
Konzentrat (µl)
Konjugatmenge 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
Verdünnungsmittel (ml)
*Eine komplette Platte; **Zwei komplette Platten
Enzymatische Entwicklungslösung (R8 + R9)
Chromogen (R9) in Substratpuffer (R8) im Verhältnis 1:11 verdünnen (z.B.: 1 ml Reagenz R9 + 10 ml Reagenz R8).
Für 1 bis 12 Teststreifen werden 10 ml benötigt. Die Lösung homogenisieren.
9 - LAGERUNGSBEDINGUNGEN - HALTBARKEIT
Der Kit sollte bei +2-8°C gelagert werden. Jedes Reagenz des Genetic Systems HIV-1 Ag EIA Kits kann nach dem
ersten Öffnen bis zum auf der Packung angegebenen Verfallsdatum verwendet werden, sofern nicht anders
vorgeschrieben:
R1 : Nach dem Öffnen des vakuumversiegelten Beutels sind die Streifen im sorgfältig wieder versiegelten Beutel bei
+2-8°C 1 Monat haltbar.
R2 : Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung in einem Kunststoffgefäß bei +2-8°C bis zu 14 Tage haltbar
R8 + R9 : Nach der Rekonstitution ist das Reagenz lichtgeschützt bei Raumtemperatur (18-30°C) 6 Stunden haltbar.
R4 - R5 : Nach der Rekonstitution sind die Konjugat-Arbeitslösungen bei Raumtemperatur (18-30°C) 24 Stunden haltbar.
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10 - TESTDURCHFÜHRUNG
Nachfolgend sind zwei Verfahren zum Nachweis des HIV-1 p24-Antigens in Humanserum, -plasma oder
Zellkulturproben beschrieben:
Testablauf Inkubation Inkubation Inkubation Farbentwicklung
der Probe von Konjugat 1 von Konjugat 2
Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation
37°C 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, 18 à 30°C,
Trockenhitze Trockenhitze Trockenhitze (lichtgeschützt)
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Inkubation bei Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation Statische Inkubation
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 18 à 30°C,
Trockenhitze, Trockenhitze, Trockenhitze, (lichtgeschützt)
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Proben, die bei 37°C oder 40°C inkubiert wurden, müssen bei der Testwiederholung unter den gleichen
Bedingungen getestet werden.
Bei diesem Verfahren beträgt die zu erwartende Testdauer ca. 3,0 – 3,5 Stunden ab dem Beginn des ersten
Inkubationsschrittes. Jede Messreihe des Assays muss nach dem Beginn ohne Unterbrechung bis zum Ende
durchgeführt werden.
Auf jeder Platte müssen zwei positive und drei negative Kontrollen mitgetestet werden. Anstatt der Negativen
Kontrolle (C0) des Kits sind für die Analyse von Zellkulturproben drei Zellkulturkontrollen erforderlich. Der Grenzwert
für Patientenproben wird durch die Kontrollen jeder einzelnen Platte bestimmt.
Die Platten während des letzten Inkubationsschrittes (nach Zugabe der TMB-Arbeitslösung) keiner direkten
Lichteinwirkung aussetzen.
Befolgen Sie strikt das Verfahren und beachten Sie die folgenden GLP-Richtlinien:
1. Probenverteilung und Identifikationsplan sorgfältig festlegen.
2. Verdünnte Waschlösung vorbereiten.
3. Den Rahmen und die Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen.
4. Folgende Komponenten werden direkt und aufeinander folgend hinzugefügt, ohne die Mikrotiterplatte vorher zu
reinigen:
4.1 50 µl Verdünnungsmittel in jede Vertiefung
4.2 150 µl negatives Kontrollserum (C0) in die Vertiefungen A1- B1 – C1
4.3 150 µl positives Kontrollserum (C1) in die Vertiefungen D1 - E1
4.4 150 µl Probe in die Vertiefungen G1, etc ...
Anstatt der Negativen Kontrolle des Kits sind für die Analyse von Zellkulturproben drei Zellkulturkontrollen
erforderlich. Stellen Sie sicher, dass das Probenverdünnungsmittel mit der Probe (oder Kontrolle) gründlich
gemischt ist.
Anmerkung : Die Probenverteilung kann bei diesem Schritt optisch kontrolliert werden: Nach Zugabe der Probe
ändert sich die Farbe des Probenverdünnungsmittels von grün nach blau. Damit wird bestätigt, dass Probe (oder
Kontrolle) in die Vertiefung pipettiert wurde. Bei korrekter Vermischung weisen die Vertiefungen eine einheitliche
Farbe auf. Zellkulturproben zeigen je nach verwendetem Zellkulturmedium keine Farbveränderung an.
(Siehe Abschnitt 12: SPEKTROPHOTOMETRISCHE ÜBERPRÜFUNG DER PROBENPIPETTIERUNG).
5. Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken. Die Folie fest auf die Platte drücken, um die Platte
dicht zu versiegeln.
6. Die Mikrotiterplatte in einem statischen Trockeninkubator bei 37 ± 1°C oder 40 ± 1°C
60 ± 5 Minuten inkubieren.
7. Die Klebefolie entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit
Natriumhypochlorid) absaugen. Mindestens 0,370 ml Waschlösung in jede Vertiefung geben. Die Mikrotiterplatte
20 – 60 Sekunden stehen lassen. Anschließend Überstände absaugen. Dieses Verfahren viermal wiederholen (d.
h. der Waschvorgang wird insgesamt fünfmal wiederholt). Die Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10 µl
betragen (ggf. die Mikrotiterplatte umdrehen und auf einem Papiertuch ausklopfen ).
Wird eine automatische Waschvorrichtung benutzt, ist die Vorgehensweise die gleiche (siehe Abschnitt 10 :
Empfehlungen).
46

8. 100 µl der Konjugat-Arbeitslösung 1 rasch in alle Vertiefungen geben.
Vor der Verwendung muss das Konjugat vorsichtig geschüttelt werden.
Bitte beachten : Die Probenverteilung der gelben Konjugat-Arbeitslösung 1 kann bei diesem Schritt optisch
kontrolliert werden.
9. Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken. Die Mikrotiterplatte in einem statischen
Trockeninkubator bei 37 ± 1°C oder 40 ± 1°C 30 ± 5 Minuten inkubieren.
10. Die Klebefolie entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit
Natriumhypochlorid) absaugen. Mindestens 0,370 ml Waschlösung in jede Vertiefung geben. Die Mikrotiterplatte
20 – 60 Sekunden stehen lassen. Anschließend Überstände absaugen. Dieses Verfahren viermal wiederholen
(d. h. der Waschvorgang wird insgesamt fünfmal wiederholt). Die Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10
µl betragen (ggf. die Mikroplatte umdrehen und auf einem Papiertuch ausklopfen ).
11. 100 µl der Konjugat-Arbeitslösung 2 rasch in alle Vertiefungen geben.
Vor der Verwendung muss das Konjugat vorsichtig geschüttelt werden.
Bitte beachten.: Die Probenverteilung der grünen Konjugat-Arbeitslösung 2 kann bei diesem Schritt optisch
kontrolliert werden.
12. Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken. Die Mikrotiterplatte in einem statischen
Trockeninkubator bei 37 ± 1°C oder 40 ± 1°C 30 ± 5 Minuten inkubieren.
13. Die Folie entfernen, den Inhalt aller Vertiefungen absaugen und wie oben beschrieben fünfmal waschen. Die
Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10 µl betragen (ggf. die Streifen umdrehen und auf einem Papiertuch
ausklopfen ).
14. 100 µl der frisch vor der Verwendung hergestellten Entwicklungslösung (R8+R9) schnell in alle Vertiefungen
geben. Für die Entwicklung der Reaktion die Platte lichtgeschützt bei Raumtemperatur (18-30°C) 30 ± 5 Minuten
stehen lassen. Während dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden.
Bitte beachten.: Die Probenverteilung der pinkfarbenen Entwicklungslösung kann bei diesem Schritt optisch
kontrolliert werden. Es gibt einen deutlichen Farbunterschied zwischen leeren Vertiefungen und Vertiefungen, die
bereits pinkfarbene Substratlösung enthalten (siehe Abschnitt 12 für Informationen zur automatischen
Überprüfung: SPEKTROPHOTOMETRISCHE ÜBERPRÜFUNG DER PROBEN- UND REAGENZPIPETTIERUNG).
15. 100 µl Stopplösung (R10) in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Verteilungsmenge wie die
Substratlösung zusetzen. Die Reaktionsmischung homogenisieren.
Bitte beachten.: Die Verteilung der farblosen Stopplösung kann bei diesem Schritt optisch kontrolliert werden.
Nach Zugabe der Stopplösung verschwindet die pinke Verfärbung der Substratlösung (bei negativen Proben) bzw.
wird blau bis gelb (bei positiven Proben).
16. Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Bis zum Ablesen des Ergebnisses. mindestens 4 Minuten nach Zugabe
der Stopplösung abwarten, die optische Dichte jedoch innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion mit
einem Plattenleser bei 450/620-700 nm ablesen.
17. Alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmung zwischen den Werten und der Probenverteilung prüfen.
11 - BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
1) Validierung der Ergebnisse
Eine Messreihe ist nur dann gültig, wenn die folgenden Kriterien erfüllt werden:
• Die Extinktion jeder Negativkontrolle (NK) (bzw. Zellkulturkontrolle) muss größer als 0,000 und kleiner als oder
gleich 0,100sein. Ein Wert einer Negativkontrolle kann verworfen und der Mittelwert der Negativkontrollen aus
den übrigen beiden Werten berechnet werden. Der Mittelwert der Negativkontrolle kann aus den übrigen beiden
Extinktionswerten berechnet werden. Liegen zwei oder mehr Negativkontrollwerte außerhalb des angegebenen
Bereiches, ist die Platte nicht auswertbar und der Test muss wiederholt werden.
• Der Mittelwert der Extinktionen der Positivkontrollen (PKX) muss größer oder gleich 0,500 und die einzelnen
Extinktionswerte innerhalb des Reproduzierbarkeitsbereiches von 0,65 – 1,35 mal PKX sein. Keine Werte der
Positivkontrollen dürfen verworfen werden.
2) Berechnung der Mittelwerte der Extinktionen
Von den validierten Kontrollen die Mittelwerte der Negativ- und Positivkontrollen bestimmen, indem die Summe ihrer
Extinktionen durch die Anzahl der eingehenden Werte geteilt wird.
3) Grenzwert
Den Grenzwert durch Addieren von 0,070 zum Mittelwert der Negativkontrollen (NKX) berechnen (siehe folgendes
Beispiel) :
NKX = 0,033
Grenzwert = 0,070 +0,033 = 0,103
47

4) Interpretation der Ergebnisse
Das Vorliegen oder Nichtvorhandensein von HIV-1-Antigen wird durch den Vergleich der Extinktionen jeder Probe
mit dem Grenzwert ermittelt.
Proben mit Extinktionen größer 0,000 müssen erneut getestet werden. Proben mit Extinktionen, die oberhalb der
Linearitätsgrenze des Photometers liegen, sollten als reaktiv ausgegeben werden.
Proben mit Extinktionen kleiner als der Grenzwert gelten als nicht reaktiv im Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA
und können als negativ für HIV-1-Antigen betrachtet werden. Diese Proben müssen nicht weiter getestet werden.
Proben mit Extinktionen größer oder gleich dem Grenzwert gelten als initial reaktiv im Genetic Systems HIV-1
Antigen EIA. Jede initial reaktive Probe muss in Doppelbestimmung erneut getestet werden, damit diese
Testergebnisse validiert werden können. Liegen die Extinktionen beider Doppelbestimmungen nach der
Testwiederholung unterhalb des Grenzwertes, wird die Probe als nicht wiederholt reaktiv und somit negativ für HIV-
1-Antigen bewertet. Aus folgenden Gründen kann es zu nicht wiederholt reaktiven Proben kommen:
• nicht korrekt durchgeführte Waschschritte der Mikrotiterplatten
• Kreuzkontamination nicht reaktiver Proben mit HIV-1 Ag aus einer Probe mit hoher Reaktivität Kontamination des
Substratpuffers durch Oxidationsmittel (Bleichlauge, Metallionen, etc.)
• Kontamination der Stopplösung
Ist die Extinktion einer der beiden Doppelbestimmungen nach der Testwiederholung größer oder gleich dem
Grenzwert, ist das anfängliche Ergebnis reproduzierbar und die Probe muss gemäß den nachfolgend aufgeführten
Grenzen des Tests als reaktiv im Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA bewertet werden. Proben, die im Genetic
Systems HIV-1 Antigen EIA wiederholt reaktiv waren, können mit dem Genetic Systems HIV-1 Antigen
Bestätigungstest (Artikel-Nr. 71121) überprüft werden. Die Probe kann nur dann als positiv für HIV-1 Antigen
betrachtet werden, wenn das HIV-1 Antigen im Bestätigungstest neutralisiert werden kann.
12 - SPEKTROPHOTOMETRISCHE ÜBERPRÜFUNG DER PROBEN-
UND REAGENZPIPETTIERUNG
Spektrophotometrischz überprüfung der proben
Nach Zugabe des Probenverdünnungsmittels (R3) und der Proben kann das Vorhandensein von zu testenden Proben
in den Vertiefungen durch eine spektrophotometrische Messung bei 620 nm überprüft werden: Bei einer Vertiefung
mit Probe liegt die optische Dichte größer 0,250 (eine niedrigere OD weist auf eine schlechte Pipettierung der Probe hin).
Anmerkung : Zellkulturproben zeigen je nach verwendetem Zellkulturmedium keine Farbveränderung an. In diesem
Fall kann keine automatische Überprüfung durchgeführt werden.
Überprüfung der Pipettierung der Entwicklungslösung
Das Vorhandensein von pinkfarbener Entwicklungslösung in den Vertiefungen kann durch automatisches Ablesen bei
490 nm überprüft werden: Bei einer Vertiefung mit Entwicklungslösung muss die optische Dichte über 0,100 liegen
(eine niedrigere OD weist auf eine schlechte Pipettierung der Entwicklungslösung hin).
13 - LEISTUNGSFÄHIGKEIT DES TESTS
Sensitivität
• 138 HIV-infizierte Patienten in unterschiedlichen Stadien (u. a. AIDS, ARC) wurden getestet und waren im Genetic
Systems HIV-1 Antigen EIA positiv.
• 20 gut dokumentierte Serokonversionspanels wurden untersucht. Die erzielten Ergebnisse sind mit denen eines
anderen HIV Ag-Assays vergleichbar.
• 55 HIV-1-Zellkulturüberstande (53 der Gruppe M und 2 der Gruppe O) und das Verdünnungspanel « Ag VIH SFTS
96 » waren im Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA-Test positiv, außer 2 Verdünnungen der Zellkulturüberstände
der Gruppe O.
- Die 53 Zellkulturüberstände der HIV-1-Gruppe M bestanden aus den folgenden Genotypen: 10 Genotypen A,
10 B, 9 C, 5 D, 11 E, 2 F, 2 G, 1 H, 2 J und 1 N.
- Das Verdünnungspanel « Ag VIH SFTS 96 » bestand aus folgenden Genotypen: Genotypen A, B, C, D, E, F, G,
H der Gruppe M und 1 der Gruppe O.
Analytische Sensitivität
Die Sensitivitätsgrenze des Tests wurde mit mehreren Verdünnungen, die aus dem französischen Standard
(gereinigtes Viruslysat des Genotypen B, verdünnt mit negativem citriertem Plasma) und dem BBI-Panel (PRA 801)
hergestellt wurden, evaluiert. Die Sensitivitätsgrenze lag bei beiden Protokollen bei 8 pg/ml HIV Ag.
Die Kalibrierungskurve des HIV-1 Ag Standards (Code 72217) ist zwischen 0 und 100 pg/ml linear.
48

Diagnostische Spezifität
Die diagnostische Spezifität wurde evaluiert:
• Mit 4038 Blutspendern lag sie bei 99,95%.
• Mit 209 klinischen Patienten lag sie bei 100%.
Hierfür wurde ein Panel mit 105 Patientenproben getestet. Dieses Panel besteht aus folgenden Proben:
• Proben mit Antikörpern gegen HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubella, Toxoplasma Gondii, Treponema Pallidum,
CMV
• Proben mit Auto-Antikörpern, IgG, IgM, Rheumafaktor
• Schwangere, Zirrhose-Population, Mehrfachtransfusion und Patienten mit systemischem Lupus erythematodes.
Lediglich eine Probe eines Patienten mit systemischem Lupus erythematodes war im Genetic Systems HIV-1 Ag EIA-
Test reaktiv, sie konnte jedoch mit dem Bestätigungstest nicht bestätigt werden.
Präzision
Die Intraassay-Reproduzierbarkeit wurde durch die Analyse von 3 positiven Proben und einer negativen Probe
30fach in der gleichen Messreihe bestimmt.
Die Interassay-Reproduzierbarkeit wurde durch die Analyse von 3 positiven Proben und einer negativen Probe über
5 Tage mit 2 unterschiedlichen Assistenten bestimmt.
Der Variationskoeffizient für positive Proben lag unter 10%.
14 - GRENZEN DES TESTS
• Das Verfahren des Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA-Tests und die Interpretation der Ergebnisse müssen für die
Analyse von Serum, Plasma oder Zellkulturproben auf vorhandenes HIV-1 Antigen strikt befolgt werden. Vor der
Durchführung des Tests sollten Benutzer dieses Kits die Packungsbeilage sorgfältig lesen. Insbesondere muss das
Testverfahren für die Pipettierung der Proben und Reagenzien, der Waschschritte und der Inkubationszeiten genau
beachtet werden.
• Die Bestimmung eines reaktiven Ergebnisses für HIV-1 Antigen darf nicht allein auf einem einzigen reaktiven
Testergebnis basieren. Zur Bestimmung der Spezifität einer im Screeningverfahren reaktiven Probe sind weitere
Untersuchungen, wie z. B. ein Bestätigungstest, erforderlich.
• Bei allen hoch sensitiven Immunoassays können nicht spezifische Reaktionen auftreten, die zu falsch positiven
Ergebnissen führen können. Der Anteil falsch reaktiver Ergebnisse hängt von der Sensitivität und Spezifität des
Testkits ab.
• Negative Ergebnisse können auftreten, wenn die Menge des in der Probe vorhandenen Markers unter der
Nachweisgrenze des Assays liegt oder der nachzuweisende Marker in dem Krankheitsstadium, in dem die Probe
entnommen wurde, nicht vorhanden ist.
• Aufgrund der Varianz des HIV-Virus kann die Möglichkeit falsch negativer Ergebnisse nicht gänzlich
ausgeschlossen werden. Mit keiner heute bekannten Testmethode kann mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen
werden, dass kein HI-Virus vorhanden ist.
• Wird die Probe oder das Reagenz nicht gemäß der Testanleitung zugegeben, kann dies zu einem falsch negativen
Ergebnis führen. Bei Verdacht auf eine Infektion oder einen Fehler im Verfahren sollte erneut getestet werden.
• Eine Extinktion kleiner 0,000 weist auf einen Fehler im Verfahren oder am Gerät hin. In diesem Fall muss erneut
getestet werden.
• Zu den möglichen Faktoren, die die Validität der Ergebnisse beeinträchtigen können, gehören falsche oder
fehlende Probenzugabe inkorrektes Waschen Mikrotiterplatte, falsche Inkubationszeiten und –temperaturen,
Zugabe der falschen Reagenzien in die Vertiefungen, vorhandene Metalle und Verspritzen von Bleichlauge in die
Vertiefungen und abgelaufene Reagenzien.
• Die Leistung des Tests wurde nicht mit postmortalen Proben oder anderen biologischen Flüssigkeiten als
Humanserum-, -plasma- oder Zellkulturproben evaluiert.
• Die Färbung des Probenverdünnungsmittels kann je nach verwendetem Zellkulturmedium bei Zellkulturproben
ausbleiben.
• Obwohl die analytische Sensitivität des Tests während der Evaluierung des Tests 8 pg/ml angenommen wurde,
kann diese je nach Bedingungen und aufgrund der Varianz zwischen den Serien schwanken. Daher garantiert
Bio-Rad lediglich eine analytische Sensitivität kleiner 15 pg/ml.
• Mit der kolorimetrischen Methode für die Überprüfung der Pipettierung der Proben, des Konjugates und der
Entwicklungslösung kann die Genauigkeit der pipettierten Menge nicht kontrolliert werden. Diese Methode
ermittelt nur das Vorhandensein von Probe, Konjugat und Entwicklungslösung in den Vertiefungen.
49

Die mit dieser Methode erzielten falschen Reaktionen stehen in unmittelbarem Zusammenhang mit der Präzision
des verwendeten Systems (ein kumulierter Variationskoeffizient für Pipettierung und Ablesen von Messwerten von
über 10 % beeinträchtigt die Qualität der Überprüfung erheblich).
• Bei ungenügenden Waschvorgängen nach der Konjugatinkubation kann die automatische Überprüfung der
Pipettierung der Entwicklungslösung (durch Ablesen der OD der Vertiefungen bei 490 nm) bei nicht vorhandener
Entwicklungslösung zu falschen Ergebnissen mit einer OD über 0,100 führen. Dies wurde während der
Evaluierung von 939 getesteten Proben nie beobachtet.
15 - LITERATUR
Siehe französische Version.
50

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tests 71120
TEST IMMUNOENZIMATICO (EIA) PER LA RILEVAZIONE
DELL'ANTIGENE P24 DEL VIRUS DELL'IMMUNODEFICIENZA
UMANA ACQUISITA DI TIPO 1 (HIV-1) NEL SIERO,
NEL PLASMA UMANO E NEI SURNATANTI DI COLTURA CELLULARE
IVD
Controllo di qualità del produttore
Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono sottoposti ad un sistema di
assicurazione di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione dei
prodotti finiti.
Ciascun lotto di prodotto finito è soggetto a un controllo di qualità e viene messo in commercio
soltanto se risulta conforme ai criteri di approvazione.
La documentazione relativa alla produzione e al controllo di ciascun lotto è conservata negli archivi
della nostra società.
51

SOMMARIO
1 - INTERESSE CLINICO
2 - PRINCIPIO DEL KIT GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - COMPOSIZIONE DEL KIT GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
4 - MATERIALE NECESSARIO, MA NON FORNITO
5 - ISTRUZIONI PER L'IGIENE E LA SICUREZZA
6 - PRECAUZIONI
7 - CAMPIONI
8 - RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI
9 - VALIDITÀ - CONSERVAZIONE
10 - PROCEDURA OPERATIVA
11 - CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
12 - VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI
13 - PRESTAZIONI
14 - LIMITI DEL TEST
15 - BIBLIOGRAFIA
52

1 - INTERESSE CLINICO
L'agente eziologico della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) è costituito da un retrovirus denominato
Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV). Il virus HIV è stato isolato in pazienti affetti da AIDS e in individui sani
appartenenti ad una popolazione a rischio di contrarre l'AIDS 1,2 . È noto che la trasmissione avviene per via
sessuale, tramite l'impiego di aghi infetti, attraverso la trasfusione di prodotti ematici contaminati, e dalla madre
infetta al feto o al neonato per via placentare 1,8 .
In genere è possibile rilevare, nel sangue o nel plasma di un individuo esposto al virus, anticorpi specifici del virus
stesso, che ne confermano pertanto l'esposizione. Nella fase precedente all'apparizione di anticorpi rilevabili,
antigeni virali liberi si trovano già in circolo nel flusso ematico. Uno di tali antigeni virali è l'antigene p24 che
corrisponde alla principale proteina della nucleocapside.
I test per il monitoraggio dell'antigene dell'HIV possono essere utilizzati per rilevare la presenza di antigeni virali e
quindi per diagnosticare un'infezione da HIV e questo già prima che abbia luogo la sieroconversione.
Il periodo di antigenemia, che precede l'apparizione degli anticorpi anti-HIV, è variabile e può durare da alcuni
giorni a qualche settimana negli individui infettati. Nella fase di sieroconversione, gli anticorpi specifici del virus
formano dei complessi immuni con gli antigeni in circolo, con conseguente forte diminuzione dei tassi di antigeni
liberi nel sangue ed eventuale completa sparizione di detti antigeni 9,11 . L'antigenemia può ripresentarsi in seguito,
nella fase di sviluppo della malattia 12 .
Il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA è destinato ad essere utilizzato come ausilio per la diagnosi e la
prognosi dell'infezione da HIV-1.
2 - PRINCIPIO DEL KIT GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
Il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA è un test immunoenzimatico per la rilevazione in vitro dell'antigene p24
del capside del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) libero in campioni di siero, di plasma umano
e di surnatante di coltura cellulare. Il test "Genetic Systems HIV-1 Antigen Confirmatory Assay" (codice 71121) è
un test utilizzato in abbinamento con il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA per la conferma della presenza
dell'antigene p24 dell'HIV in campioni in cui si è verificata una ripetizione della reattività.
Il test Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA si basa sull'impiego di una fase solida preparata con anticorpi
monoclonali anti-HIV-1 di topo, di un primo coniugato preparato con anticorpi biotinilati di pecora anti-p24 e di un
secondo coniugato preparato con avidina legata alla perossidasi di rafano (HRP).
L'esecuzione del test comprende le seguenti fasi di reazione:
1. I campioni da analizzare così come i sieri di controllo sono distribuiti nei loro rispettivi pozzetti nei quali sarà
stato precedentemente aggiunto il diluente dei campioni. Se nel campione testato sono presenti antigeni HIV-1,
questi si legano agli anticorpi che rivestono i pozzetti e vi rimangono fissati durante la fase di lavaggio che segue.
Il deposito dei campioni viene confermato da un cambiamento di colore, dal verde al blu del diluente del campione.
2. Il coniugato 1 viene quindi aggiunto in ciascun pozzetto e poi incubato. Questo permette agli anticorpi biotinilati
di pecora anti-p24 presenti nel coniugato 1 di legarsi ai complessi anticorpi-antigeni HIV-1 fissati sui pozzetti.
Detti complessi antigeni-anticorpi rimangono fissati ai pozzetti durante la successiva fase di lavaggio.
3. Successivamente viene distribuito e poi incubato il coniugato 2. L'avidina del coniugato 2 si lega specificamente
ai complessi anticorpi-antigeni HIV-1 legati ai pozzetti. L'eccesso non legato di coniugato viene eliminato
mediante lavaggio.
4. La rivelazione della reazione avviene aggiungendo e poi incubando la soluzione di lavoro TMB.
Proporzionalmente alla quantità di antigene HIV-1 presente nel campione, si sviluppa una colorazione blu o bluverde.
La reazione colorimetrica si arresta per l'aggiunta di acido, che trasforma la colorazione dal blu-verde al
giallo. La densità ottica dei campioni e dei controlli è determinata mediante spettrofotometria ad una lunghezza
d'onda pari a 450/620-700 nm.
53

3 - COMPOSIZIONE DEL KIT GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
ETICHETTATURA NATUREZA DOS REAGENTES PRESENTAZIONE
71120
R1 MICROPIASTRA 2 piastre
12 strip da 8 pozzetti sensibilizzati
con anticorpi murini monoclonali anti-p24 dell'HIV-1
Conservante: ProClin 300, Sodio azide (

• Strip non sensibilizzate qualora piastre incomplete siano testate su dispositivi automatici.
• Recipienti per reagenti EIA (facoltativo).
• Guanti monouso
• Carta assorbente
• Recipienti di plastica puliti (polistirene o polipropilene) per la preparazione delle soluzioni di lavoro, dei coniugati
e della soluzione TMB.
• Terreno di coltura cellulare, ad esempio RPMI-1640, contenente il 10% di siero fetale di vitello, equivalente a
quello utilizzato per la coltura di cellule infettate (in caso di test eseguito su campioni di cellule).
(*) Consultateci per informazioni precise riguardo agli apparecchi approvati dai nostri servizi tecnici
5 - ISTRUZIONI PER L'IGIENE E LA SICUREZZA
Tutti i reagenti del kit sono destinati all'uso diagnostico "in vitro".
• Indossare guanti mono-uso per maneggiare i reagenti e i campioni e lavarsi le mani con cura dopo la
manipolazione.
• Non pipettare con la bocca.
• Il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione del controllo negativo è stato sottoposto a test ed è
risultato negativo all'antigene HIV-1, agli anticorpi anti-HIV-1 e anti-HIV-2, all'antigene HB, agli anticorpi anti-
HCV, come pure agli anticorpi HTLV-1 / HTLV-2.
• Il controllo positivo è stato inattivato mediante calore in presenza di un agente dissociante.
• Poiché nessun metodo può dare la certezza assoluta dell'assenza di virus HIV, Epatite B o C o di altri agenti
infettivi, considerare sia questi reagenti sia i campioni prelevati dai pazienti come potenzialmente infettivi e
maneggiarli con le precauzioni d'uso.
• Considerare sia il materiale a diretto contatto con i campioni e i reagenti, sia le soluzioni di lavaggio come
prodotti contaminati.
• Evitare schizzi di campioni o di soluzioni che li contengono.
Le superfici sporche devono essere pulite con candeggina diluita al 10 %. Se il liquido contaminante è un acido,
le superfici sporche devono essere neutralizzate preventivamente con bicarbonato di sodio, poi lavate con
candeggina e asciugate con carta assorbente. Il materiale utilizzato per pulire dovrà essere gettato in un
contenitore speciale per residui contaminati.
• I campioni, i reagenti di origine umana come pure il materiale e i prodotti contaminati devono essere eliminati
dopo essere stati decontaminati:
- o immergendoli in candeggina a concentrazione finale del 5 % di ipoclorito di sodio (1 volume di candeggina
per 10 volumi di liquido contaminato o acqua) per 30 minuti.
- oppure mediante autoclavaggio a 121°C per un minimo di 2 ore. .
ATTENZIONE : NON INTRODURRE NELL'AUTOCLAVE SOLUZIONI CONTENENTI IPOCLORITO DI SODIO.
• La scheda con i dati relativi alla sicurezza è disponibile su richiesta.
• Evitare qualunque contatto del tampone substrato, del cromogeno e della soluzione di arresto con la pelle e le
mucose (rischi di tossicità, irritazioni e bruciature).
• Non dimenticare di neutralizzare e/o autoclavare le soluzioni o i residui di lavaggio o qualunque liquido
contenente campioni biologici, prima di eliminarli nel lavello.
• D'altra parte, la manipolazione e l'eliminazione dei prodotti chimici devono essere effettuate attenendosi alle
buone pratiche di laboratorio.
• Certi reagenti contengono sodio azide come conservante. Il sodio azide può formare azoturi di piombo o rame
nelle tubature di scarico del laboratorio. Detti azoturi sono esplosivi. Per evitare accumuli di azoturi, risciacquare
con abbondante acqua le tubature di scarico qualora le soluzioni contenenti azoturo vengano eliminate nel
lavandino una volta inattivate.
• Taluni reagenti contengono ProClin 300
ProClin 300 0.5% : Irritante
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
S28-37: In caso di contatto con la cute, lavarsi immediatamente con abbondante acqua e sapone.
Indossare guanti adatti.
Xi - Irritante
55

6 - PRECAUZIONI
La qualità dei risultati dipende dal rispetto delle buone pratiche di laboratorio di seguito riportate :
• Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza.
• Non modificare la procedura operativa.
• Ricostituire con cura i reagenti evitando qualunque contaminazione.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi nel corso di uno stesso dosaggio.
Nota : È possibile utilizzare altri lotti di soluzione di lavaggio (R2, indicata 10 x in blu sull’etichetta), di tampone
substrato (R8, indicato con TMB buf. in blu), di cromogeno (R9, identificato con TMB 11x. in viola) e di soluzione
di arresto (R10, indicata con 1N in rosso) diversi da quelli inclusi nel kit con riserva di utilizzare un solo e unico
lotto nel corso dello stesso dosaggio. Detti reattivi possono essere utilizzati con altri prodotti della nostra ditta.
Contattare il nostro servizio di assistenza tecnica per informazioni dettagliate.
• Prima dell'utilizzo è necessario attendere 30 minuti affinché i reagenti si riportino alla temperatura del laboratorio
(18-30°C).
• Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (acidi, alcalini, aldeidi) o di polveri che potrebbero alterare
l'attività enzimatica dei coniugati.
• Utilizzare recipienti di vetro perfettamente lavati e risciacquati con acqua distillata o preferire materiale mono-uso.
• Non lasciare che la micropiastra si asciughi tra la fine del lavaggio e la distribuzione dei reagenti.
• Verificare l'esattezza e la precisione delle pipette e il buon funzionamento degli strumenti utilizzati.
• Lavaggio: è indispensabile attenersi scrupolosamente alle procedure di lavaggio al fine di ottenere dal test
prestazioni ottimali.
• Non utilizzare mai lo stesso recipiente per distribuire il coniugato e la soluzione di rivelazione.
• La reazione enzimatica è molto sensibile a tutti i metalli o ioni metallici. Di conseguenza, nessun elemento
metallico deve venire a contatto con le diverse soluzioni contenenti i coniugati o il substrato.
• La soluzione di rivelazione (tampone substrato + cromogeno) deve essere di colore rosa. La presenza di una
colorazione diversa nei minuti successivi alla ricostituzione indica che il reagente è inutilizzabile e deve essere
sostituito.
Per questa preparazione utilizzare preferibilmente recipienti e materiale in plastica mono-uso distribuiti in
commercio o recipienti in vetro precedentemente lavati con acido cloridrico 1N, risciacquati con acqua distillata
e asciugati. Conservare la soluzione al riparo dalla luce.
7 - CAMPIONI
Prelevare un campione di sangue secondo le pratiche d'uso.
È possibile utilizzare i campioni seguenti: siero, plasma o campioni di coltura cellulare. Sono stati valutati e
considerati utilizzabili anche gli anticoagulanti EDTA, eparina, citrato di sodio, CPDA-1 e ACD. I campioni prelevati
mediante provette anticoagulanti devono riempire la provetta stessa fino al livello indicato onde evitare una cattiva
diluizione.
Estrarre il siero o il plasma dal coagulo o dai globuli rossi non appena possibile per evitare emolisi. Un'emolisi molto
evidente può avere ripercussioni sulle prestazioni del test. I campioni che presentano grumi devono essere
chiarificati prima del test mediante centrifugazione. Le particelle o aggregati di fibrina in sospensione possono
produrre risultati falsi positivi.
I campioni di coltura di cellule che necessitano di diluizione prima dell'uso possono essere diluiti con terreno di
coltura cellulare equivalente al mezzo impiegato per la coltura.
NON UTILIZZARE CAMPIONI INATTIVATI MEDIANTE CALORE.
Se il monitoraggio è eseguito entro 7 giorni i campioni vanno conservati a +2-8°C oppure possono essere congelati
a - 20°C. Lo scongelamento dei plasmi deve essere rapido mediante riscaldamento per qualche minuto a 40°C (per
limitare la precipitazione della fibrina).
A causa dell'instabilità dell'Ag HIV al calore, non sarà possibile adottare temperature superiori a 40°C. Si
raccomanda di non utilizzare i campioni sottoposti a più di tre cicli di congelamento/scongelamento.
Se i campioni devono essere trasportati, imballarli secondo le normative vigenti in materia di trasporto di agenti
eziologici.
Estrarre il siero o il plasma dal coagulo o dai globuli rossi non appena possibile per evitare emolisi.
NON UTILIZZARE SIERI O PLASMI CONTAMINATI, IPER-LIPEMICI O IPER-EMOLIZZATI
Nota : Non sono state messe in evidenza interferenze sia nei campioni contenenti 80 mg/l di bilirubina, 36 mg/l
di immunoglobulina M o G sia nei campioni lipemici contenenti fino a 5 g/l di lipidi sia nei campioni emolizzati
contenenti fino a 5 g/l di emoglobina.
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8 - RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI
Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (18 – 30°C) prima dell'uso, ad eccezione dei coniugati
concentrati 1 e 2 (R4 e R5).
1) Reagenti pronti per l'uso
Reagente R1 : Micropiastra
Ciascun telaio supporto contenente 12 strip è confezionato in una bustina "ZIP". Tagliare la bustina con le forbici
o un taglierino ad una distanza di 0,5 - 1 cm sotto la ZIP. Aprire la bustina ed estrarre il telaio. Riporre nella bustina
le strip inutilizzate. Richiudere la bustina con cura e riporla a +2-8°C.
Reagent R3 : Diluente per campioni
Reagent C0 : Siero di controllo negativo
Reagent C1 : Siero di controllo positivo
Reagent R10 : Soluzione di arresto.
2) Reagenti da ricostituire
Soluzione di lavaggio concentrata 10 volte (R2)
Diluire a 1/10 la soluzione R2 in acqua distillata. Omogeneizzare.
NOTA: La soluzione di lavaggio Genetic Systems EIA (30X), che fa parte di altri kit Genetic Systems, può essere
utilizzata anche per questo test. In tal caso, diluire un volume di soluzione di lavaggio concentrata in 29 volumi di
acqua.
Soluzione di lavoro coniugato 1 (R4 + R6) e Soluzione di lavoro coniugato 2 (R5 + R6)
I coniugati 1 (R4) e 2 (R5) sono soluzioni concentrate (100 X). Preparare separatamente la soluzione di lavoro
coniugato 1 e la soluzione di lavoro coniugato 2 diluendo ciascuno a 1:101 nel diluente di coniugato (R6). Eseguire
la preparazione in recipienti di plastica puliti. Trascrivere sul recipiente il numero di lotto, la data e l'ora della
preparazione e la data dei coniugati concentrati (1 o 2) come pure l'ora limite di utilizzo (24 ore dopo la
preparazione). Mescolare delicatamente le soluzioni di lavoro prima dell'uso. Dopo essere state mescolate, la
soluzione di lavoro coniugato 1 risulta essere gialla e la soluzione di lavoro coniugato 2 verde..
Preparazione della soluzione di lavoro coniugato 1 o 2 per strip
Numero di strip 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
necessarie
Quantità di coniugato 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
concentrato (µl)
Quantità di diluente del 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
coniugato (ml)
* una piastra intera **due piastre intere
Soluzione di rivelazione enzimatica R8 + R9
Diluire il reagente R9 nel reagente R8 in proporzione pari a 1/11 (esempio: 1 ml di reagente R9 in 10 ml di
reagente R8) sapendo che per l'analisi di 12 strip sono necessari e sufficienti 10 ml. Omogeneizzare.
9 - VALIDITÀ E CONSERVAZIONE
Il kit deve essere conservato a +2-8°C.
Una volta aperto, ciascun componente del kit Genetic SystemsTM HIV-1 Antigen EIA conservato a +2-8°C può essere
utilizzato fino alla data di scadenza indicata sulla confezione, salvo diversa indicazione specifica:
R1 : Una volta aperta la bustina, le strip conservate a +2-8°C nella loro bustina originaria ben chiusa rimangono
stabili per 1 mese.
R2 : Una volta diluita, la soluzione di lavaggio si conserva per un massimo di 14 giorni a +2-8°C in un contenitore
di plastica.
R8 - R9 : Dopo la ricostituzione, i reagenti conservati al riparo dalla luce rimangono stabili per 6 ore a temperatura
ambiente (18-30°C).
R4 - R5 : Dopo la ricostituzione i coniugati rimangono stabili per 24 ore a temperatura ambiente (18-30°C).
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10 - PROCEDURA OPERATIVA
58
Di seguito sono presentate due procedure per la rilevazione dell'antigene p24 dell'HIV nel siero o nel
plasma umani o in campioni di coltura cellulare :
Procedura Incubazione Coniugato 1 Coniugato 2 Rivelazione
Incubazione Incubazione colorimetrica
Incubazione Incubazione statica Incubazione statica Incubazione statica 18 to 30°C,
37°C , 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, al riparo dalla
caldo secco caldo secco caldo secco luce
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Incubazione Incubazione statica Incubazione statica Incubazione statica 18 to 30°C,
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, al riparo dalla
dry heat, dry heat, dry heat, luce
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Per i campioni testati originariamente a 37 o a 40°C, qualunque test ulteriore o qualsiasi conferma dovranno essere
eseguiti attenendosi alla stessa procedura.
La durata indicativa del presente test è di circa 3 h 30 – 4 ore a partire dall'inizio della prima fase di incubazione.
Ciascun ciclo della procedura di utilizzo del test deve essere eseguito integralmente e senza interruzioni una volta
iniziato.
Per ciascuna piastra devono essere eseguiti due controlli positivi e tre controlli negativi. Nel caso di test eseguiti su
campioni di cellule, sono necessari tre controlli negativi di terreno di coltura cellulare al posto del controllo negativo
del kit (C0). La soglia di reattività per i campioni dei pazienti è determinata in funzione delle indicazioni ottenute
con i controlli su ogni singola piastra.
Evitare l'esposizione delle piastre alla luce nel corso dell'ultima fase di incubazione (dopo l'aggiunta della soluzione
di lavoro TMB).
Attenersi strettamente al protocollo proposto e applicare le buone pratiche di laboratorio:
1. Stabilire accuratamente il piano di distribuzione e identificazione dei campioni.
2. Preparare la soluzione di lavaggio diluita.
3. Estrarre il telaio supporto e le strip (R1) dall'imballaggio di protezione.
4. Porre direttamente, senza prelavaggio della piastra, in successione (piano di distribuzione nella piastra
suggerito) :
4.1 50 µl di diluente per campione in ciascun pozzetto
4.2 150 µl di controllo negativo (C0) in A1 - B1 - C1
4.3 150 µl di controllo positivo (C0) in D1 - E1
4.4 150 µl di campione in G1, ecc. . .
Nel caso di test eseguito su campioni di cellule, sono necessari tre controlli negativi di terreno di coltura cellulare
al posto del controllo negativo del kit (C0). Accertarsi che il diluente per campioni sia ben mescolato con il
campione stesso (o con il controllo).
NB: a questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione dei campioni e del
diluente per campioni: il colore del diluente cambia dal verde al blu per indicare che il campione, o il controllo,
è stato effettivamente aggiunto nel pozzetto. Quando le soluzioni contenute in ciascun pozzetto sono ben
mescolate, assumono una colorazione uniforme.
I campioni di coltura cellulare possono non cambiare colore in funzione del terreno di coltura impiegato.
(Fare riferimento al paragrafo 12 per la verifica automatica – VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO
DEI CAMPIONI).
5. Laddove possibile, ricoprire con un film autoadesivo esercitando una pressione omogenea su tutta la superficie
per assicurarne l'ermeticità.
6. Incubare la piastra per 60 ± 5 minuti a 37 ± 1°C o a 40 ± 1°C con un incubatore statico a calore secco.
7. Togliere il film adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti contaminati (contenente
ipoclorito di sodio) e aggiungere immediatamente in ogni pozzetto un minimo di 0,370 ml di soluzione di
lavaggio. Rispettare un tempo di immersione (tempo di attesa) pari a 20 – 60 secondi. Aspirare nuovamente.
Ripetere il lavaggio 4 volte (effettuare almeno 5 lavaggi). Il volume residuo deve risultare inferiore a 10 µl (se
necessario, asciugare la piastra capovolgendola su un foglio di carta assorbente).
Se si dispone di un lavatore automatico, seguire lo stesso ciclo di operazioni.

8. Distribuire rapidamente 100 µl della soluzione di lavoro coniugato 1 in tutti i pozzetti. Agitare il coniugato prima
dell'uso.
N.B. A questo stadio della manipolazione è possibile verificare visivamente la distribuzione della soluzione di
lavoro del coniugato 1 che presenta una colorazione gialla.
9. Se è possibile, coprire la micropiastra con una pellicola nuova. Incubare per 30 ± 5 minuti a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C in un incubatore statico a calore secco.
10. Togliere il film adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti contaminati (contenente
ipoclorito di sodio) e aggiungere immediatamente in ogni pozzetto un minimo di 0,370 ml di soluzione di
lavaggio. Rispettare un tempo di immersione (tempo di attesa) pari a 20 – 60 secondi. Aspirare nuovamente.
Ripetere il lavaggio 4 volte (effettuare almeno 5 lavaggi). Il volume residuo deve risultare inferiore a 10 µl (se
necessario, asciugare la piastra capovolgendola su un foglio di carta assorbente).
11. Distribuire rapidamente 100 µl della soluzione di lavoro coniugato 2 in tutti i pozzetti. Agitare il coniugato prima
dell'uso.
N.B. A questo stadio della manipolazione è possibile verificare visivamente la distribuzione della soluzione di
lavoro del coniugato 2 che presenta una colorazione verde.
12. Se è possibile, coprire la micropiastra con una pellicola nuova. Incubare per 30 ± 5 minuti a 37 ± 1°C o
a 40 ± 1°C in un incubatore statico a calore secco.
13. Togliere la pellicola adesiva, svuotare tutti i pozzetti mediante aspirazione e lavare almeno 5 volte come in
precedenza. Il volume residuo deve risultare inferiore a 10 µl (se necessario, asciugare le strip capovolgendole
su un foglio di carta assorbente).
14. Dispensare rapidamente in tutti i pozzetti 100 µl di soluzione di rivelazione dell'attività enzimatica (R8 + R9)
preparata in precedenza. Lasciare che la reazione si sviluppi al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente
(18 - 30°C). Durante questa incubazione, non utilizzare alcun film adesivo.
N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di
rivelazione, che presenta una colorazione rosa. Vi è una differenza evidente tra la colorazione di un pozzetto
vuoto e quella di un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione rosa. (fare riferimento al paragrafo 12 per
la verifica automatica VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI).
15. Aggiungere 100 µl della soluzione di arresto (R10) seguendo la stessa sequenza e lo stesso ritmo di
distribuzione come per la soluzione di rivelazione. Omogeneizzare la miscela di reazione.
N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di
arresto, che è incolore. La colorazione del substrato, rosa (per i campioni negativi) o blu (per i campioni positivi),
scompare dai pozzetti che diventano incolori (per i campioni negativi) o gialli (per i campioni positivi) in seguito
ad addizione della soluzione di arresto.
16. Asciugare accuratamente la parte inferiore delle piastre. Attendere almeno 4 minuti dopo la distribuzione della
soluzione di arresto e leggere la densità ottica a 450/620-700 nm per mezzo di un lettore di piastre, entro i
30 minuti successivi all’arresto della reazione.
17. Verificare, prima della trascrizione dei risultati, la concordanza tra la lettura ed il piano di distribuzione e di
identificazione delle piastre e dei campioni.
11 - CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
1 - Convalida della prova
Un test è considerato valido se vengono rispettati e seguenti criteri :
• I singoli valori di assorbanza dei controlli negativi (o dei controlli dei terreni di coltura di cellule, secondo il caso)
devono essere superiori a 0,000 AU e inferiori o uguali a 0,100 AU. Qualora uno dei valori di assorbanza di
un pozzetto del controllo negativo risulti al di fuori di detti parametri, detto valore può essere eliminato. La media
dei controlli negativi in questo caso può essere calcolata a partire dai due rimanenti valori di assorbanza.
Qualora due o più controlli negativi non rispettino detti criteri, il dosaggio dovrà essere ripetuto.
• Le assorbanze medie dei controlli positivi devono risultare superiori o uguali a 0,500 AU e il valore di assorbanza
di ciascun controllo positivo deve porsi entro il range di riproducibilità pari a 0,65 – 1,35 volte la media dei
controlli positivi. Tutti i valori di assorbanza dei controlli positivi devono essere presi in considerazione.
2 - Calcolo della media delle assorbanze
A partire dai controlli validati, determinare le assorbanze medie dei controlli negativi e positivi dividendo la somma
dei loro valori di assorbanza per il numero di controlli utilizzati.
3 - Calcolo del valore-soglia
Il valore-soglia viene calcolato sommando un fattore costante (0,070) al valore di assorbanza media dei controlli
negativi (CNX).
Valore-soglia = 0,070 + CNX
59

Esempio :
CNX = 0,033
Valore-soglia = 0,070 + 0,033 = 0,103
4 - Interpretazione dei risultati
La presenza o assenza degli antigeni HIV-1 è determinata confrontando, per ciascun campione, l'assorbanza
registrata con quella del valore-soglia calcolato.
I campioni con valori di assorbanza inferiori a 0,000 devono essere sottoposti a un nuovo test. I campioni con valori
di assorbanza superiori ai limiti di linearità del lettore sono considerati reattivi.
I campioni con valori di assorbanza inferiori al valore-soglia sono considerati non reattivi al test Genetic Systems
HIV-1 Antigen EIA e possono essere considerati negativi per l'antigene HIV-1. In tal caso, non è necessario effettuare
un altro test.
I campioni con valori di assorbanza superiori o uguali al valore-soglia sono considerati inizialmente reattivi al test
Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA. Al fine di validare i risultati del test iniziale, si consiglia di ripetere due volte il
test per quei campioni risultati inizialmente reattivi. Se, in seguito a questi ulteriori test, i due nuovi valori di
assorbanza ottenuti risultano inferiori al valore-soglia, il risultato iniziale è considerato non riproducibile e il
campione di origine viene dichiarato negativo per l'antigene HIV-1 secondo il test “Genetic Systems HIV-1
Antigen”. L'origine delle reazioni non riproducibili è spesso correlata alle seguenti cause :
• lavaggio insufficiente delle micropiastre,
• contaminazione crociata di campioni non reattivi da parte di un campione ad alto titolo di antigene HIV-1.
• contaminazione puntuale della soluzione di rivelazione da parte di agenti chimici ossidanti (candeggina, ioni
metallici, ecc.)
• contaminazione puntuale della soluzione di arresto.
Se, in seguito alla ripetizione del dosaggio, il valore di assorbanza misurato per uno dei due doppietti risulta
superiore o uguale al valore-soglia, il risultato iniziale è considerato riproducibile e il campione viene dichiarato
reattivo secondo il test Genetic Systems HIV-1 Antigen, conformemente ai limiti descritti di seguito. I campioni la
cui reattività è stata ripetuta con il test Genetic Systems HIV-1 Antigen – EIA devono essere confermati con il test
Genetic Systems HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (codice: 71121). Il campione può essere considerato positivo
per l'antigene HIV-1 soltanto se l'antigene HIV-1 viene neutralizzato nel corso della procedura di conferma.
12 - VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DELLA DISTRIBUZIONE DEI CAMPIONI
VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI
Dopo aver proceduto alla distribuzione del diluente per i campioni (R3) e successivamente a quella dei campioni
stessi, è possibile verificare la presenza dei campioni da testare nei pozzetti mediante una lettura spettrofotometrica
a 620 nm: la densità ottica di un pozzetto contenente un campione dovrà essere superiore a 0,250 (una DO
inferiore indica una cattiva distribuzione di quest'ultimo).
Nota: i campioni di coltura cellulare possono non cambiare colore in funzione del terreno di coltura impiegato. In
tal caso la presente verifica automatica non deve essere eseguita.
VERIFICA DEL DEPOSITO DELLA SOLUZIONE DI RIVELAZIONE
È possibile verificare la presenza della soluzione di rivelazione rosa mediante lettura automatica a 490 nm : un
pozzetto contenente la soluzione di rivelazione deve avere una densità ottica superiore a 0,100 (una DO inferiore
indica una cattiva distribuzione della soluzione di rivelazione).
Vi è una differenza evidente tra la colorazione di un pozzetto vuoto e quella di un pozzetto contenente la soluzione
di rivelazione rosa.
13 - PRESTAZIONI
Sensibilità diagnostica
• 138 campioni di pazienti affetti da HIV a diversi stadi di infezione (AIDS, ARC, altri) sono stati sottoposti a test
e risultati positivi con il test Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA.
• Sono stati esaminati 20 panel di sieroconversione ben documentati. I risultati ottenuti sono paragonabili ai risultati
ottenuti con altri test di dosaggio dell'antigene HIV.
• 55 surnatanti di colture cellulari di HIV-1 (di cui 53 del gruppo M e 2 del gruppo O) come pure il panel di
diluizione “Ag VIH SFTS 96” sono risultati tutti positivi con il test Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA ad eccezione
di 2 diluizioni di un surnatante di coltura cellulare di gruppo O.
- I 53 surnatanti di colture cellulari di HIV-1 del gruppo M sono composti dai seguenti genotipi: 10 di genotipo
A, 10 di B, 9 di C, 5 di D, 11 di E, 2 di F, 2 di G, 1 di H, 2 di J e 1 di N.
- Il panel di diluizione “Ag VIH SFTS 96” comprende i seguenti genotipi: A, B, C, D, E, F, G, H del gruppo M e
1 genotipo del gruppo O.
60

Sensibilità analitica
La soglia di sensibilità del test è stata studiata su una gamma di diluizioni preparate a partire dallo standard
nazionale francese (lisato virale purificato del genotipo B diluito in plasma citrato negativo) e sul panel BBI (PRA
801). Nel corso di tali dosaggi la soglia di rivelazione è stata stimata pari a 8 pg/ml di antigene HIV, qualunque
sia il protocollo utilizzato.
Il range di calibratura ottenuto con lo standard “HIV-1 Ag Standard” (codice 72217) di Bio-Rad è lineare da 0 a
100 pg/ml.
Specificità diagnostica
La specificità del test determinata a partire :
• da una popolazione di 4038 donatori di sangue è stimata pari al 99,95%.
• da una popolazione di 209 pazienti ospedalieri è stimata pari al 100%
È stato sottoposto a test un panel di 105 campioni prelevati da pazienti e formato da campioni:
• contenenti anticorpi diretti contro HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rosolia, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum,
CMV
• contenenti auto-anticorpi, tassi elevati di IgG e di fattore reumatoide IgM
• provenienti da donne in gravidanza, da pazienti cirrotici e politransfusi oltre che da pazienti affetti da Lupus
eritematoso sistemico
Un solo campione proveniente da un paziente affetto da lupus eritematoso è risultato reattivo con il test Genetic
Systems HIV-1 Antigen EIA ma non è stato confermato reattivo con il test di conferma.
Precisione
La ripetibilità intra-dosaggio è stata esaminata sottoponendo a test 3 campioni positivi e 1 negativo per 30 volte
ciascuno nel corso dello stesso dosaggio.
La riproducibilità inter-dosaggio è stata studiata sottoponendo a test eseguiti da due tecnici diversi 3 campioni
positivi e uno negativo in triplicato per 5 giorni.
I coefficienti di variazione ottenuti sui campioni positivi testati sono inferiori al 10%.
14 - LIMITI DEL TEST
• La procedura del test Genetic Systems HIV-1 Antigen – EIA e il modo di interpretazione dei risultati devono
essere utilizzati per la ricerca dell'antigene HIV-1 in campioni di siero, di plasma o di colture cellulari. Si
raccomanda agli utilizzatori del presente kit di leggere con attenzione il foglio illustrativo prima di procedere
all'esecuzione del test. Le procedure del test devono essere particolarmente rispettate per quanto riguarda il
pipettaggio dei campioni e dei reagenti, il lavaggio delle piastre e la durata delle fasi di incubazione.
• Un campione non deve essere considerato reattivo all'antigene HIV-1 a partire da un solo risultato reattivo. Al
fine di stabilire la specificità della reattività di ciascun campione secondo il presente test, è necessario effettuare
nuovi dosaggi come ad esempio un test di conferma.
• Qualunque test immunoenzimatico ad alta sensibilità può essere soggetto a reazioni non specifiche che possono
dare risultati falsi positivi. La percentuale di campioni risultati falsi reattivi dipende dalla sensibilità e dalla
specificità del kit impiegato.
• Risultati negativi si possono ottenere per quei campioni il cui tasso di antigene HIV risulta essere troppo basso
rispetto ai limiti di rilevazione del test, allo stesso modo è possibile osservare risultati negativi qualora il marker
cercato non è presente allo stadio della malattia in cui è stato prelevato il campione.
• La variabilità dei virus HIV non consente di escludere la possibilità di reazioni false negative. Nessun metodo noto
può fornire la garanzia che il virus HIV è assente.
• Se l'aggiunta di campioni o di reagente non è stata eseguita nel rispetto delle istruzioni, è possibile ottenere un
risultato falso negativo. In caso di sospetto clinico di infezione o di errore commesso nel corso della procedura
sarà necessario procedere alla ripetizione del dosaggio.
• Un valore di assorbanza inferiore a 0,000 AU è indice di un errore commesso nel corso della procedura o di
un problema dovuto al materiale. In tal caso il campione interessato dovrà essere sottoposto ad un nuovo test.
• I fattori che possono compromettere la validità dei risultati sono i seguenti: errata distribuzione del campione nei
pozzetti, lavaggio dei pozzetti delle micropiastre eseguito male, mancato rispetto dei tempi e delle temperature
di incubazione indicate, errori nella distribuzione dei reagenti, presenza di metalli o di candeggina nei pozzetti.
• Le prestazioni del presente test non sono state valutate su campioni post mortem o su fluidi biologici diversi dal
siero o dal plasma o da campioni di coltura cellulare
• La colorazione del diluente dei campioni può non essere modificata in presenza di campioni di coltura cellulare
in funzione del terreno di coltura impiegato.
61

• La sensibilità analitica, stimata 8 pg/ml nel corso delle valutazioni del test può variare in funzione delle
condizioni operative e della variabilità tra i diversi lotti. Pertanto, Bio-Rad può garantire soltanto una sensibilità
analitica inferiore a 15 pg/ml.
• Il metodo colorimetrico di verifica del deposito dei campioni e/o dei coniugati e/o della soluzione di rivelazione
non consente di verificare l'esattezza dei volumi distribuiti ma soltanto di evidenziare la presenza di campioni
e/o dei coniugati e/o della soluzione di rivelazione. Il tasso di risposte errate ottenute con tale metodo è
collegato alla precisione del sistema utilizzato (dei CV con cumuli di pipettaggio e di lettura superiori al 10%
possono deteriorare significativamente la qualità di detta verifica).
• Nel caso di lavaggio inefficace in seguito alla fase di incubazione del coniugato, la verifica automatica della
distribuzione della soluzione di rivelazione (mediante lettura a 490 nm delle densità ottiche dei pozzetti) può dare
risultati errati con densità ottiche superiori a 0,100 in assenza di soluzione di rivelazione. Tuttavia questo
fenomeno non è stato osservato nel corso delle valutazioni condotte su 939 campioni testati.
15 - REFERENCES
Vedere versione francese
62

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tests 71120
TESTE IMUNOENZIMÁTICO (EIA) PARA DETECÇÃO DO ANTIGÉNIO
P24 DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA HUMANA
DE TIPO 1 (HIV-1) NO SORO, PLASMA HUMANO
E SOBRENADANTES DE CULTURA CELULAR
IVD
Controlo da qualidade de fabrico
Todos os produtos fabricados e comercializados pela empresa Bio-Rad são submetidos a um
sistema de garantia da qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização
do produto final.
Cada lote de produto final é objecto de um controlo da qualidade, sendo comercializado apenas
quando em total conformidade com os critérios de aceitação.
A documentação relativa à produção e ao controlo de cada lote encontra-se arquivada na nossa
empresa.
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ÍNDICE
1 - INTERESSE CLÍNICO
2 - PRINCÍPIO DO DISPOSITIVO GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
4 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
5 - INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA
6 - PRECAUÇÕES
7 - AMOSTRAS
8 - RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES
9 - VALIDADE – CONSERVAÇÃO
10 - PROCEDIMENTO
11 - CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
12 - VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DOS REAGENTES
13 - DESEMPENHOS
14 - LIMITES DO TESTE
15 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1 - INTERESSE CLÍNICO
O agente etiológico do síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) é um retrovírus ao qual foi dado o nome de
Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). O HIV foi isolado em doentes com SIDA e em indivíduos saudáveis,
constituintes de uma população de risco para a SIDA 1,2 . Sabe-se que a transmissão se processa por via sexual, pela
utilização de agulhas contaminadas, por transfusão de produtos sanguíneos contaminados e pela mãe infectada ao
feto ou ao recém-nascido, por via placentária 1,8 .
Normalmente, é possível detectar, no sangue ou no plasma de um indivíduo que tenha estado exposto ao vírus,
anticorpos específicos do vírus, confirmando deste modo a exposição. Na fase que antecede o aparecimento de
anticorpos detectáveis, antigénios virais livres estão já em circulação no sangue. Um destes antigénios virais é o
antigénio p24 que corresponde à principal proteína da nucleocápside.
Os testes de detecção do antigénio do HIV podem ser utilizados para detectar a presença de antigénios virais e, deste
modo, diagnosticar uma infecção pelo HIV, antes de se verificar a seroconversão.
O período de antigenemia, que precede o aparecimento de anticorpos anti-HIV, é variável e pode durar desde alguns
dias até algumas semanas, nos indivíduos infectados. Na seroconversão, os anticorpos específicos do vírus formam
complexos imunes com os antigénios circulantes, o que tem como consequência uma forte quebra da taxa de
antigénios livres no sangue, acabando por conduzir ao desaparecimento completo destes antigénios 9,11
A antigenemia pode reaparecer mais tarde, com a progressão da doença 12 .
O teste Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA destina-se a ser utilizado como auxiliar de diagnóstico e prognóstico da
infecção pelo HIV-1.
2 - PRINCÍPIO DO DISPOSITIVO GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
O teste Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA é um teste imunoenzimático para detecção in vitro do antigénio p24
da cápside do vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1) livre, em amostras de soro ou de plasma
humanos e do sobrenadante de cultura celular. O teste «Genetic Systems HIV-1 Antigen Confirmatory Assay» (ref.
71121) é um teste utilizado em complemento do teste Genetic Systems HIV-1 Antigen-EIA para confirmação da
presença do antigénio p24 do HIV em amostras cuja reactividade tenha sido repetida.
O teste Genetic Systems HIV-1 Antigen – EIA assenta na utilização de uma fase sólida, preparada com anticorpos
monoclonais anti-HIV-1 de ratinho, de um primeiro conjugado preparado com anticorpos biotilinados anti-p24 de
carneiro e um segundo conjugado, preparado com avidina ligada à peroxidase de Raifort .
A preparação do teste compreende as seguintes fases reaccionais:
1. As amostras a estudar, bem como os soros de controlo, são distribuídos pelos respectivos poços, aos quais se
adicionou previamente diluente de amostras. Se os antigénios HIV-1 estiverem presentes na amostra testada, estes
ligam-se então aos anticorpos que revestem os poços, onde permanecerão fixados durante a fase de lavagem
que se segue.
O depósito das amostras é confirmado por uma alteração de cor do diluente da amostra, de verde para azul.
2. O conjugado 1 é, em seguida, adicionado em cada poço, e depois incubado. Isto permite que os anticorpos
biotinilados anti-p24 de carneiro, presentes no conjugado 1, se liguem aos anticorpos/antigénios HIV-1
capturados nos poços. Estes complexos antigénios/anticorpos permanecem fixados aos poços, durante a etapa
de lavagem que se segue.
3. O conjugado 2 é então distribuído e, depois, incubado. A avidina do conjugado 2 liga-se especificamente aos
complexos anticorpos/antigénios HIV-1 ligados aos poços. O excedente não ligado do conjugado é eliminado
por lavagem.
4. A revelação da reacção processa-se por adição, seguida de incubação, da solução de trabalho TMB. Uma
coloração azul ou azul esverdeada desenvolve-se proporcionalmente à quantidade de antigénio HIV-1 presente
na amostra. A reacção colorimétrica é interrompida por adição de ácido, que modifica a coloração de azul
esverdeado para amarelo. A densidade óptica das amostras e dos controlos é determinada por
espectrofotometria a um comprimento de onda de 450/620-700 nm.
65

3 - COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
ETIQUETAGEM NATUREZA DOS REAGENTES APRESENTAÇÃO
71120
R1 MICROPLACA : 2 placas
12 tiras de 8 poços sensibilizados com anticorpos
murinos monoclonais anti-p24 do HIV-1
Conservante: ProClin 300, Azida Sódica (

• Tiras não sensibilizadas para teste de placas incompletas em dispositivos automáticos.
• Recipientes para reagentes EIA (facultativo).
• Luvas descartáveis.
• Papel absorvente.
• Recipientes limpos em plástico (polistireno ou polipropireno) para preparação das soluções de trabalho
conjugadas e da solução TMB.
• Meio de cultura celular, por exemplo RPMI-1640, contendo 10% de soro de vitelo fetal, equivalente ao utilizado
para a cultura de células infectadas (em caso de teste efectuado em amostras de células).
(*) Para uma informação mais precisa sobre os aparelhos validados pelos nossos serviços técnicos é favor
contactar-nos.
5 - INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA
Todos os reagentes do dispositivo são destinados a utilização para diagnóstico «in vitro».
• Usar luvas descartáveis para manipulação dos reagentes e das amostras e lavar cuidadosamente as mãos após
a manipulação.
• Não «pipetar» com a boca.
• O material de origem humana, utilizado na preparação do controlo negativo, foi testado e comprovado como
negativo quanto ao antigénio HIV1, anticorpos anti-HIV1 e HIV2, antigénio HB, anticorpos anti-HCV, bem como
em anticorpos anti HTLV1 / HTLV 2
• O controlo positivo foi inactivado por calor, em presença de um agente dissociante
• Pelo facto de nenhum método poder garantir, de forma absoluta, a ausência de vírus HIV, Hepatites B ou C ou
outros agentes infecciosos, estes reagentes, bem como as amostras dos doentes, devem ser considerados como
potencialmente infecciosos e, como tal, manipulados com as precauções habituais.
• Considerar o material directamente em contacto com as amostras e os reagentes, bem como as soluções de
lavagem, como produtos contaminados.
• Evitar o derramamento de amostras ou soluções que as contenham.
• As superfícies contaminadas deverão ser limpas com lixívia diluída a 10%. Se o líquido contaminante for um
ácido, as superfícies afectadas deverão ser previamente neutralizadas com bicarbonato de sódio e, em seguida,
lavadas com lixívia e limpas com papel absorvente. O material utilizado para a limpeza deverá ser eliminado
num contentor especial destinado a resíduos contaminados.
• As amostras, os reagentes de origem humana, assim como o material e os produtos contaminados deverão ser
eliminados, após descontaminação:
- por imersão em lixívia à concentração final de 5% de hipocloreto de sódio (1 volume de lixívia para 10
volumes de líquido contaminado ou água), durante 30 minutos.
- ou por esterilização em autoclave, à temperatura de 121°C, durante um mínimo de duas horas.
Autoclaving is the best method to inactivate HIV and HBV.
ATENÇÃO : NÃO INTRODUZIR NA AUTOCLAVE SOLUÇÕES CONTENDO HIPOCLORETO DE SÓDIO.
• A ficha de dados de segurança está disponível a pedido.
• Evitar qualquer contacto do tampão substracto, do cromogénio e da solução de paragem com a pele e as
mucosas (risco de toxicidade, de irritação e de queimadura).
• Não esquecer a neutralização e/ou a esterilização em autoclave das soluções ou efluentes de lavagem, ou
qualquer líquido que contenha amostras biológicas, antes da sua eliminação na canalização de esgoto.
• Por outro lado, a manipulação e a eliminação de produtos químicos devem ser efectuadas em cumprimento das
boas práticas de laboratório.
• Certos reagentes contêm azida sódica como conservante. A azida sódica pode formar azidas de chumbo ou de
cobre nas canalizações do laboratório. Estas azidas são explosivas. Para evitar qualquer acumulação de azidas,
lavar com água abundante as canalizações, caso as soluções contendo azida tenham sido eliminadas pelo
esgoto após a sua inactivação.
• Certos reagentes contêm ProClin 300
ProClin 300 0,5%: Irritante
R43 : Pode provocar sensibilização por contacto com a pele.
S28-37 : Em caso de contacto com a pele, lavar imediatamente com água abundante e sabão. Usar
luvas apropriadas.
Xi - Irritante
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6 - PRECAUÇÕES
A qualidade dos resultados está dependente do cumprimento das seguintes boas práticas de laboratório:
• Não utilizar reagentes após o termo do respectivo prazo de validade.
• Não modificar o modo de funcionamento.
• Reconstituir cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação.
• Não misturar reagentes de lotes diferentes no decorrer de um mesmo ensaio.
Nota : É possível utilizar outros lotes de solução de lavagem (R2, identificado como 10 x a azul na etiqueta), de
tampão substracto (R8, identificado como TMB buf. a azul), de cromogénio (R9, identificado como TMB 11x . a
roxo) e de solução de paragem (R10, identificado como 1N a vermelho), para além dos fornecidos no dispositivo,
desde que se utilize apenas um único destes lotes no decorrer de um mesmo ensaio. Estes reagentes podem ser
utilizados com outros produtos da nossa empresa. Para obter informações detalhadas é favor consultar os nossos
serviços técnicosAntes de utilizar, aguardar 30 minutos para que os reagentes estabilizem à temperatura do
laboratório (18-30°C).
• Não efectuar o teste em presença de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldeídos) ou de poeiras que possam
alterar a actividade enzimática dos conjugados.
• Utilizar recipientes em vidro perfeitamente lavados e enxaguados com água destilada ou, de preferência, utilizar
material descartável.
• Não deixar que a microplaca seque entre o final da lavagem e o princípio da distribuição dos reagentes.
• Verificar se as pipetas são exactas e precisas e se os aparelhos utilizados se encontram em bom estado de
funcionamento.
• Lavagem: é indispensável respeitar escrupulosamente os procedimentos de lavagem a fim de obter os melhores
desempenhos do teste.
• Nunca utilizar o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de revelação.
• A reacção enzimática é muito sensível a todos os metais ou iões metálicos. Consequentemente, nenhum elemento
metálico deverá entrar em contacto com as diferentes soluções que contêm conjugados ou o substracto.
• A solução de revelação (tampão substracto + cromogénio) deve ser de cor rosa. O aparecimento de qualquer
outra coloração nos minutos que se seguem à reconstituição indica que o reagente não pode ser utilizado e deve
ser substituído.
Para esta preparação utilizar, de preferência, recipientes e material de distribuição em plástico descartável ou
recipientes em vidro previamente lavados com ácido clorídrico 1N, enxaguados com água destilada e
devidamente limpos. Conservar esta solução ao abrigo da luz.
7 - AMOSTRAS
Recolher uma amostra de sangue de acordo com a prática habitual.
As amostras que podem ser utilizadas são: soro, plasma ou amostras de cultura celular. Os anticoagulantes EDTA,
heparina, citrato de sódio, CPDA-1 e ACD foram estudados e são considerados como utilizáveis. As amostras
recolhidas por meio de tubos anticoagulantes devem encher o tubo até ao nível indicado, a fim de evitar qualquer
diluição incorrecta.
Extrair o soro ou o plasma do coágulo ou dos glóbulos vermelhos, o mais rapidamente possível a fim de evitar
qualquer hemólise. Uma hemólise muito pronunciada pode afectar o desempenho do teste. As partículas ou
agregados de fibrina em suspensão podem dar origem a resultados falsamente positivos.
As amostras de cultura de células que requerem uma diluição antes da utilização podem ser diluídas com um meio
de cultura celular equivalente ao meio utilizado para a cultura.
NÃO UTILIZAR AMOSTRAS INACTIVADAS POR ACÇÃO DO CALOR.
As amostras devem ser conservadas a + 2-8°C, se o teste de detecção for efectuado no prazo de 7 dias, ou
conservadas congeladas a -20°C. Os plasmas devem ser submetidos a uma descongelação rápida por
aquecimento durante alguns minutos a 40°C (para limitar a precipitação de fibrina).
Dada a instabilidade da Ag HIV ao calor, não poderão utilizar-se temperaturas superiores a 40°C. Não utilizar
amostras que tenham sido congeladas e descongeladas mais de 3 vezes.
Se for necessário transportar as amostras, estas deverão ser acondicionadas em cumprimento da regulamentação
em vigor relativa ao transporte de agentes etiológicos.
Extrair o soro ou o plasma do coágulo ou dos glóbulos vermelhos o mais rapidamente possível a fim de evitar
qualquer hemólise.
NÃO UTILIZAR SOROS OU PLASMAS CONTAMINADOS, HIPERLIPÉMICOS OU HIPER-HEMOLIZADOS.
Nota : Não se observou qualquer interferência em amostras contendo 80 mg/l de bilirrubina, 36 mg/l de
imunoglobulina M ou G, bem como em amostras lipémicas contendo até 5 g/l de lípidos e em amostras
hemolizadas contendo até 5 g/l de hemoglobina.
68

8 - RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES
Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (18 a 30°C) antes da utilização, à excepção dos
conjugados concentrados 1 e 2 (R4 e R5).
1) Reagentes prontos a utilizar
Reagente R1 : Microplaca
Cada suporte contendo 12 tiras é acondicionado em saqueta ”ZIP“. Cortar a saqueta por meio de uma tesoura ou
escalpelo, 0,5 a 1 cm acima do ZIP. Abrir a saqueta e retirar o tabuleiro. Colocar de novo dentro da saqueta as
tiras não utilizadas. Voltar a fechar cuidadosamente a saqueta e guardá-la à temperatura de +2-8°C.
Reagente R3 : Diluente para amostras
Reagente C0 : Soro de controlo negativo
Reagente C1 : Soro de controlo positivo
Reagente R10 : Solução de paragem
2) Reagentes a reconstituir
Solução de lavagem concentrada 10 vezes (R2)
Diluir a 1/10 a solução R2 em água destilada. Homogeneizar.
NOTA : A solução de lavagem Genetic Systems EIA (30X), que faz parte de outros dispositivos Genetic Systems,
pode ser igualmente utilizada para este teste. Neste caso, diluir um volume de solução de lavagem concentrada em
29 volumes de água.
Solução de trabalho conjugado 1 (R4+ R6) e Solução de trabalho conjugado 2 (R5+ R6)
Os conjugados 1 (R4) e 2 (R5) são soluções concentradas (100 X). Preparar separadamente a solução de trabalho
conjugado 1 e a solução de trabalho conjugado 2, diluindo cada uma delas a 1:101 no diluente de conjugado
(R6). Efectuar a preparação em recipientes limpos, de plástico. Inscrever no recipiente o número de lote, a data e
a hora de preparação e a data dos conjugados concentrados (1 ou 2), bem como a hora limite de utilização (24
horas após a preparação). Misturar lentamente as soluções de trabalho antes de utilizar. Depois de misturadas, a
solução de trabalho conjugado 1 fica amarela e a solução de trabalho conjugado 2 fica verde.
Preparação da solução de trabalho conjugado 1 ou 2 por tira
Número de tiras
necessárias 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
Quantidade de conjugado
concentrado (µl) 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
Quantidade de diluente
do conjugado (ml) 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
* uma placa inteira **duas placas inteiras
Solução de revelação enzimática R8 + R9
Diluir R9 no R8 a 1/11 (exemplo: 1 ml de reagente R9 em 10 ml de reagente R8), sabendo que 10 ml são
necessários e suficientes para o tratamento de 12 tiras. Homogeneizar.
9 - VALIDADE – CONSERVAÇÃO
O dispositivo deve ser guardado a +2-8°C.
Cada elemento do dispositivo Genetic SystemsTM HIV-1 Antigen EIA conservado a +2-8°C pode ser utilizado após
uma primeira abertura até ao termo do prazo de validade indicado na embalagem, salvo indicação específica:
R1 : Após abertura da saqueta, as tiras conservadas a +2-8°C na saqueta de origem, devidamente fechada,
mantêm-se estáveis durante 1 mês.
R2 : Após diluição, a solução de lavagem conserva-se durante 14 dias, máximo, a +2-8°C, num recipiente de
plástico.
R8 - R9 : Após reconstituição, os reagentes conservados em local escuro mantêm-se estáveis durante 6 horas à
temperatura ambiente (18-30°C).
R4 - R5 : Após reconstituição, os conjugados mantêm-se estáveis durante 24 horas à temperatura ambiente
(18-30°C).
69

10 - PROCEDIMENTO
70
Dois procedimentos para detecção do antigénio p24 do HIV-1 no soro ou no plasma humanos ou em
amostras de cultura celular são apresentados a seguir:
Procedime Incubação Conjugado 1 Conjugado 2 Revelação
nto Incubação Incubação colorimétrica
Incubação Incubação estática Incubação estática Incubação estática 18 to 30°C,
37°C, 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, no escuro
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Incubação Incubação estática Incubação estática Incubação estática 18 to 30°C,
40°C 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, no escuro
calor seco calor seco calor seco 30 ± 5 min.
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
Para as amostras originalmente testadas a 37 ou 40°C, deverá ser efectuado um novo teste ou uma nova
confirmação segundo o mesmo procedimento.
A duração indicativa deste teste é de, aproximadamente, 3 h 30 a 4 horas, a partir do início da primeira fase
de incubação. Cada ciclo do procedimento de utilização do teste deve ser efectuado integralmente e sem
interrupção, uma vez iniciado.
Dois controlos positivos e três controlos negativos devem ser realizados em cada placa. Em caso de teste
efectuado em amostras de células, três controlos negativos de meio de cultura celular serão necessários, em vez
do controlo negativo do dispositivo (C0). O valor de cut-off de reactividade para as amostras de doentes é
determinado em função dos sinais obtidos com os controlos, em cada placa individual.
Evitar que as placas fiquem expostas à luz durante a última etapa de incubação (após adição da solução de
trabalho TMB).
Seguir estritamente o protocolo proposto e aplicar as boas práticas de laboratório:
1. Estabelecer cuidadosamente o plano de distribuição e de identificação das amostras
2. Preparar a solução de lavagem diluída,
3. Retirar o tabuleiro de suporte e as tiras (R1) da embalagem de protecção
4. Depositar directamente, sem pré-lavagem da placa, em sucessão (sugestão do plano de distribuição da placa):
4.1 50 µl de diluente da amostra em cada poço
4.2 150 µl de controlo negativo (C0) em A1- B1- C1
4.3 150 µl de controlo positivo (C1) em D1-E1
4.4 150 µl de amostras em G1, etc. . .
Em caso de teste efectuado em amostras de células, três controlos negativos de meio de cultura celular serão
necessários, em vez do controlo negativo do dispositivo (C0). Assegurar que o diluente da amostra se encontra
devidamente misturado com a amostra (ou com o controlo).
Nota: a distribuição das amostras e do diluente de amostras pode ser controlada visualmente nesta fase da
manipulação: o diluente de amostras passa de verde a azul para assinalar que a amostra ou o controlo foi
devidamente adicionado nos poços. Quando as soluções contidas em cada poço se encontram correctamente
misturadas elas apresentam uma cor uniforme.
As amostras de cultura celular podem não mudar de cor, em função do meio de cultura utilizado.
(consultar o capítulo 12 para a verificação automática – VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO
DEPÓSITO DAS AMOSTRAS) .
5. Sempre que possível, cobrir com película adesiva, pressionando bem sobre toda a superfície para assegurar a
estanquicidade.
6. Incubar a placa durante 60 ± 5 minutos a 37 ± 1°C ou a 40 ± 1°C, por meio de uma incubadora estática de
calor seco.
7. Retirar a película adesiva. Aspirar o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados
(contendo hipocloreto de sódio) e adicionar imediatamente, em cada um deles, um mínimo de 0,370 ml de
solução de lavagem. Respeitar um tempo de imersão (tempo de espera) de 20 a 60 segundos. Aspirar de novo.
Repetir a lavagem 4 vezes (um mínimo de 5 lavagens). O volume resíduo deve ser inferior a 10 µl (se necessário,
secar a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente).
Se dispuser de um aparelho de lavagem automático, respeitar o mesmo ciclo operatório

8. Distribuir rapidamente 100 µl da solução de trabalho conjugado 1 por todos os poços. O conjugado deve ser
agitado, antes da utilização.
Nota: a distribuição da solução de trabalho do conjugado 1, de cor amarela, pode ser verificada visualmente
nesta fase da manipulação.
9. Se possível, cobrir a microplaca com uma película nova. Incubar 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C ou a 40 ± 1°C
numa incubadora estática de calor seco.
10. Retirar a película adesiva. Aspirar o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados
(contendo hipocloreto de sódio) e adicionar imediatamente, em cada um deles, um mínimo de 0,370 ml de
solução de lavagem. Respeitar um tempo de imersão (tempo de espera) de 20 a 60 segundos. Aspirar de novo.
Repetir a lavagem 4 vezes (num mínimo de 5 lavagens). O volume residual deve ser inferior a 10 µl (se
necessário, secar a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente).
11. Distribuir rapidamente 100 µl da solução de trabalho conjugado 2 em todos os poços. O conjugado deve ser
agitado antes da utilização.
Nota: a distribuição da solução de trabalho do conjugado 2, de cor verde, pode ser verificada visualmente nesta
fase da manipulação.
12. Se possível, cobrir a microplaca com uma película nova. Incubar durante 30 ± 5 minutos a 37 ± 1°C ou a 40
± 1°C, numa incubadora estática de calor seco.
13. Retirar a película adesiva, esvaziar todos os poços por aspiração e lavar, pelo menos, 5 vezes como
anteriormente. O volume residual deve ser inferior a 10 µl (se necessário, secar as tiras por inversão sobre uma
folha de papel absorvente).
14. Distribuir rapidamente por todos os poços 100 µl da solução de revelação da actividade enzimática (R8 + R9),
anteriormente preparada. Deixar que a reacção se desenvolva no escuro durante 30 ± 5 minutos à temperatura
ambiente (18 a 30°C). Nesta incubação não utilizar película adesiva.
Nota: A distribuição da solução de revelação, de cor rosa, pode ser controlada visualmente nesta fase da
manipulação : observa-se uma diferença de coloração significativa entre um poço vazio e um poço contendo a
solução de revelação rosa (consultar o parágrafo 12 para a verificação automática, VERIFICAÇÃO
ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DOS REAGENTES).
15. Adicionar 100 µl da solução de paragem (R10), adoptando a mesma sequência e o mesmo ritmo de distribuição
que para a solução de revelação. Homogeneizar a mistura reaccional.
Nota : A distribuição da solução de paragem, que é incolor, pode ser controlada visualmente nesta fase da
manipulação. A coloração do substracto, rosa (para as amostras negativas) ou azul (para as amostras positivas)
desaparece dos poços, que assim se tornam incolores (para as amostras negativas), ou amarelos (para as
amostras positivas), após adição da solução de paragem.
16. Secar cuidadosamente a superfície inferior das placas. Pelo menos 4 minutos após a distribuição da solução de
paragem e nos 30 minutos que se seguem à paragem da reacção, proceder à leitura da densidade óptica a
450/620-700 nm por meio de um leitor de placas.
17. Antes da passar à transcrição dos resultados, garantir a concordância entre a leitura e o plano de distribuição
e de identificação das placas e das amostras.
11 - CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
1 - Validação do teste
Um teste é válido se forem verificados os critérios seguintes :
• Os valores de absorvência individuais dos controlos negativos (ou dos controlos de meio de cultura de células,
se for o caso), devem ser superiores a 0,000 UA e inferior ou iguais a 0,100 UA. Um dos valores de absorvência
de um poço do controlo negativo pode ser eliminado, se se situar fora destes padrões. A média dos controlos
negativos pode, neste caso, ser calculada a partir dos dois valores de absorvência restantes. Se dois ou mais
controlos negativos não respeitarem estes critérios, a quantificação deve ser efectuada de novo.
• As absorvências médias dos controlos positivos devem ser superiores ou iguais a 0,500 UA e o valor de
absorvência de cada controlo positivo deve situar-se dentro do domínio de reprodutibilidade de 0,65 a 1,35
vezes a média dos controlos positivos. Todos os valores de absorvência dos controlos positivos devem ser tidos
em conta.
2 - Cálculo da média das absorvências
A partir dos controlos validados, determinar as absorvências médias dos controlos negativos e positivos, dividindo
a soma dos seus valores de absorvência pelo número de controlos utilizados.
71

3 - Cálculo do valor de cut-off
O valor de cut-off é calculado pela soma de um factor constante (0,070) com o valor de absorvência médio dos
controlos negativos (CNX).
Valor cut-off = 0,070 + CNX
Exemplo:
CNX = 0.033
Valor cut-off = 0,070 + 0,033 = 0,103
4 - Interpretação dos resultados
A presença ou a ausência dos antigénios HIV1 é determinada comparando, para cada amostra, a absorvência
registada com a do valor de cut-off calculado.
As amostras cujos valores de absorvência sejam inferiores a 0,000 devem ser testadas de novo. As amostras cujos
valores de absorvência sejam superiores aos limites de linearidade do leitor são considerados reactivos.
As amostras cujos valores de absorvência sejam inferiores ao valor de cut-off são consideradas não reactivas ao
teste EIA antigénio HIV-1 Genetic Systems e podem ser consideradas como negativas para o antigénio HIV-1. Neste
caso, não é necessário efectuar outro teste.
As amostras cujos valores de absorvência sejam superiores ou iguais ao valor de cut-off são consideradas como
inicialmente reactivas ao teste EIA Genetic Systems antigénio HIV-1. As amostras inicialmente reactivas devem ser
novamente testadas, duas vezes, a fim de validar os resultados do teste inicial. Se, depois disso, estes novos testes
de absorvência obtidos forem inferiores ao valor de cut-off, o resultado inicial é não reprodutível e a amostra de
origem é declarada negativa para o antigénio HIV-1, segundo o teste "Genetic Systems HIV-1 Antigen". A origem
de reacções não reprodutíveis está, muitas vezes, relacionada com as causas seguintes:
• lavagem insuficiente das microplacas,
• contaminação cruzada das amostras não reactivas, por uma amostra fortemente titulada em antigénio HIV-1.
• contaminação pontual da solução de revelação, por agentes químicos oxidantes (lixívia, iões metálicos, etc.).
• contaminação pontual da solução de paragem.
Se, após a repetição do ensaio, o valor de absorvência medido numa das duas repetições for superior ou igual ao
valor de cut-off, o resultado inicial é reprodutível e a amostra é declarada reactiva segundo o teste Genetic
Systems HIV-1 Antigen, em conformidade com os limites a seguir descritos. As amostras cuja reactividade tenha
sido repetida com o teste Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA devem ser confirmadas com o teste Genetic
Systems HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (ref.: 71121). A amostra só pode ser considerada positiva para o
antigénio HIV-1 se este antigénio for neutralizado durante o processo de confirmação.
12 - VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DA DISTRIBUIÇÃO DAS AMOSTRAS
VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DOS REAGENTES
Após a distribuição sucessiva do diluente das amostras (R3), seguido das amostras, é possível verificar a presença
de amostras a testar nos poços, através de leitura espectrofotométrica a 620 nm: a densidade óptica de um poço
contendo uma amostra deverá ser superior a 0,250 (uma DO inferior indica uma deficiente distribuição desta).
Nota: as amostras de cultura celular podem não mudar de cor, em função do meio de cultura utilizado. Neste caso,
não aplicar esta verificação automática.
VERIFICAÇÃO DO DEPOSITO DA SOLUÇÃO DE REVELAÇÃO
É possível verificar a presença da solução de revelação rosa por leitura automática a 490nm : um poço contendo
a solução de revelação deve apresentar uma densidade óptica superior a 0.100 (uma DO mais fraca indica uma
distribuição incorrecta da solução de revelação).
Observa-se uma diferença de coloração significativa entre um poço vazio e um poço contendo a solução de
revelação rosa.
13 - DESEMPENHOS
Sensibilidade de diagnóstico
• 138 amostras de doentes infectados pelo HIV, em diferentes fases da infecção (SIDA, ARC, outras) foram testados
e comprovados como positivos com o teste Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA.
• Foram estudados 20 painéis de seroconversão bem documentados. Os resultados obtidos são comparáveis aos
resultados obtidos com outros testes de quantificação do antigénio HIV.
• 55 sobrenadantes de culturas celulares de HIV1 (dos quais 53 do grupo M e 2 do grupo O), bem como o painel
de distribuição "Ag VIH SFTS 96" foram testados e comprovados como positivos com o teste Genetic Systems
HIV-1 Antigen EIA, à excepção de duas diluições de um sobrenadante de cultura celular do grupo O.
- Os 53 sobrenadantes de culturas celulares de HIV1 do grupo M são constituídos pelos genotipos seguintes:
10 de genotipo A, 10 de B, 9 de C, 5 de D, 11 de E, 2 de F, 2 de G, 1 de H, 2 de J e 1 de N.
72

- O painel de diluição "Ag VIH SFTS 96" compreende os genotipos seguintes: A, B, C, D, E, F, G, H do grupo
M e 1 genotipo do grupo O.
Sensibilidade analítica
O limiar de sensibilidade do teste foi estudado numa gama de diluições preparadas a partir da norma padrão
nacional francesa (lisato viral purificado de genotipo B, diluído em plasma de citrato negativo), bem como do painel
BBI (PRA 801). Nestes testes, o limiar de detecção foi calculado em 8 pg/ml de antigénio HIV, qualquer que seja
o protocolo utilizado.
A gama de aferição obtida com a norma «HIV-1 Ag Standard» (ref. 72217) da Bio-Rad é linear de 0 a 100 pg/ml.
Especificidade de diagnóstico
A especificidade do teste, determinada a partir :
• de uma população de 4038 dadores de sangue, está calculada em 99,95%.
• de uma população de 209 doentes hospitalizados, está calculada em 100%.
Foi testado um painel de 105 amostras de doentes. Este compreende amostras :
• contendo anticorpos dirigidos contra HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubella, Toxoplasma Gondii, Treponema
pallidum, CMV
• contendo auto-anticorpos, taxas elevadas de IgG, IgM de factor reumatóide
• provenientes de mulheres grávidas, doentes cirróticos e submetidos a politransfusões, bem como de doentes
sofrendo de Lúpus Eritematoso Sistémico.
Uma única amostra, proveniente de um doente com Lúpus Eritematoso Sistémico, foi comprovada como reactiva
com o teste Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA, mas não foi confirmada como positiva com o teste de confirmação.
Precisão
A repetibilidade intra-ensaio foi estudada, testando 3 amostras positivos e uma negativa, 30 vezes cada uma,
durante um mesmo ensaio.
A reprodutibilidade inter-ensaio foi estudada, testando 3 amostras positivas e uma negativa, em triplicado, durante
5 dias, por dois técnicos diferentes.
Os coeficientes de variação obtidos nas amostras positivas testadas são inferiores a 10%.
14 - LIMITES DO TESTE
• O procedimento do teste Genetic Systems HIV-1 Antigen - EIA e o modo de interpretação dos resultados devem
ser utilizados para análise do antigénio HIV-1 em amostras de soro, de plasma ou de culturas celulares.
Recomenda-se aos utilizadores deste dispositivo que leiam o presente folheto informativo com atenção, antes da
realização do teste. Em particular os procedimentos do teste deverão ser respeitados no que diz respeito à
pipetagem das amostras e dos reagentes, à lavagem das placas e à duração das etapas de incubação.
• Uma amostra não deve ser considerada como reactiva para o antigénio HIV-1 a partir de um único resultado
reactivo. Para se estabelecer a especificidade da reactividade de cada amostra, segundo este teste, é necessário
efectuar novas quantificações, como por exemplo um teste de confirmação.
• Qualquer teste imunoenzimático altamente sensível pode estar sujeito a reacções não específicas que podem
provocar resultados falsamente positivos. A proporção das amostras reactivas falsamente reactivas depende da
sensibilidade e da especificidade do dispositivo utilizado.
• Podem obter-se resultados negativos para amostras cuja taxa em antigénio HIV seja demasiado baixa, em
comparação com os limites de detecção do teste, como também podem obter-se resultados negativos se o
marcador investigado não estiver presente na fase da doença em que a amostra foi recolhida.
• A variabilidade dos vírus HIV não permite excluir a possibilidade de reacções falsamente negativas. Nenhum
método conhecido pode oferecer garantia da ausência do vírus HIV.
• Se a adição da amostra ou do reagente não se processar em conformidade com as instruções, é possível obter
um resultado falsamente negativo. É necessário prever a realização de uma nova quantificação, em caso de
suspeita clínica de infecção ou de erro durante o procedimento.
• Um valor de absorvência inferior a 0,000 UA indica um erro durante o procedimento ou um problema associado
ao material, A amostra em questão deverá então ser testada de novo.
• Os factores que podem afectar a validade dos resultados são os seguintes: depósito incorrecto da amostra nos
poços, deficiente lavagem dos poços das microplacas, incumprimento dos tempos e temperaturas de incubação
indicados, erros nos depósitos de reagentes, presença de metais ou de lixívia nos poços.
• Os desempenhos deste teste não foram avaliados em amostras post mortem ou noutros fluídos biológicos para
além do soro ou do plasma ou amostras de cultura celular.
• A coloração do diluente pode não se alterar em presença da amostra de cultura celular, dependendo do meio
de cultura utilizado.
73

• A sensibilidade analítica, calculada em 8 pg/ml em avaliações do teste, pode variar em função das condições
operatórias e da variabilidade entre lotes. Consequentemente, apenas uma sensibilidade analítica inferior a
15 pg/ml pode constituir garantia para a Bio-Rad.
• O método colorimétrico de verificação do depósito das amostras e/ou dos conjugados e/ou da solução de
revelação não permite verificar a exactidão dos volumes distribuídos, mas apenas demonstrar a presença de
amostras e/ou de conjugados e/ou da solução de revelação. A taxa de respostas erróneas obtidas com este
método está associada à precisão do sistema utilizado (CV acumulados de pipetagem e de leitura superiores a
10% podem degradar significativamente a qualidade desta verificação).
• No caso de uma lavagem incorrecta após a etapa de incubação do conjugado, a verificação automática da
distribuição da solução de revelação (por leitura a 490 nm das densidades ópticas dos poços) pode dar origem
a resultados erróneos, com densidades ópticas superiores a 0.100 na ausência de solução de revelação. No
entanto, este fenómeno não foi observado durante as avaliações conduzidas nas 939 amostras testadas.
15 - REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Ver a versã o francesa
74

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Tester 71120
ENZYMATISK IMMUNOANALYS (EIA) FÖR DETEKTION AV HUMANT
IMMUNBRISTVIRUS TYP I (HIV-1) P24-ANTIGEN I HUMANT SERUM,
HUMAN PLASMA OCH CELLKULTURSUPERNATANT
IVD
Tillverkarens kvalitetskontroll
Alla reagens tillverkas och marknadsförs i enlighet med ett fullständigt kvalitetssystem, från
mottagandet av råmaterial till slutlig marknadsföring av produkt.
Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det
överensstämmer med acceptanskriterierna.
Handlingar som hör samman med produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas inom vårt
företag.
75

INNEHÅLL
1 - KLINISK BETYDELSE
2 - PRINCIP FÖR GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - INNEHÅLL I GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA
4 - NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL
5 - HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR
6 - FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
7 - PROVTAGNING OCH PROVHANTERING
8 - REKONSTITUTION AV REAGENS
9 - FÖRVARINGSFÖRHÅLLANDEN - HÅLLBARHET
10 - TESTFÖRFARANDE
11 - BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT
12 - SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING
13 - TESTRESULTAT
14 - BEGRÄNSNINGAR
15 - REFERENSER
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1 - KLINISK BETYDELSE
Etiologisk agens för förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) är ett retrovirus som benämns humant immunbristvirus (HIV).
HIV har isolerats från patienter med AIDS och från friska personer som löper hög risk för att drabbas av AIDS.( 1,2 )
Det är känt att smitta överförs genom intim sexuell kontakt, genom användning av smittade nålar, genom transfusion
av smittade blodprodukter och perinatalt från infekterad moder till fetus eller barn.( 1,8 )
Bevis på föregående exponering för HIV påvisas genom närvaro av virusspecifik antikropp i en persons serum eller
plasma efter virusexponering. Innan antikroppar kan påvisas, förekommer en tidig tidsperiod när fria virusantigen
cirkulerar i blodet. En av dessa virusantigen är virusets främsta kärnprotein, p24. HIV-antigentester kan användas för
att påvisa förekomst av virusantigen, och därmed HIV-infektion, före serokonversion. Antigenemiperioden, innan HIVantikroppar
visar sig, varierar och kan vara i dagar eller veckor hos infekterade personer. Vid serokonversion hos en
person förenas virusspecifika antikroppar med cirkulerande antigen så att nivåerna fria antigen i blodet faller eller
försvinner helt.( 9,11 ) Antigenemi kan senare åter utvecklas efter hand som sjukdomen fortskrider.( 12 )
Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA är avsett att användas för screening av blod- och plasmaprodukter och som ett
hjälpmedel vid diagnos och prognos i samband med HIV-1-infektion.
2- PRINCIP FÖR GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA
Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA är en enzymatisk immunoanalys för detektion av HIV-1 kärnantigen (p24) i
humana serum- och plasmaprover. Genetic Systems HIV-1 Antigen konfirmations-test (kod 71121) är ett tilläggstest
som används tillsammans med HIV-1 Antigen EIA för att konfirmera närvaro av HIV p24 antigen i upprepat reaktiva
prover.
Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA grundar sig på användning av en fast fas som preparerats med monoklonal
antikropp (mus) mot HIV-1-antigen, ett första konjugat som preparerats med biotinylerad anti-p24 antikropp (får) och
ett andra konjugat som preparerats med avidin bundet till pepparrotsperoxidas.
Testutförandet omfattar följande reaktionssteg:
1. Spädningsvätska tillsätts varje brunn. De prover som ska testas och kontrollserum fördelas till respektive brunnar.
Om HIV-1 Ag förekommer i provet, binder det till antikroppar, som brunnen är klädd med. Eventuellt HIV-1 Ag som
bundit till brunnen stannar kvar under efterföljande tvätt.
Färgen på spädningsvätskan ändras från grönt till blått, vilket bekräftar prov-/kontroll-tillsats i brunnen.
2. Konjugat 1 tillsätts därefter till varje brunn och plattan inkuberas. Den biotinylerade anti-p24 antikroppen (får) i
konjugat 1 binder till eventuell HIV-1 Ag som är bunden till brunnen. Antigen-antikropps-komplexet stannar kvar
under efterföljande tvättsteg.
3. Konjugat 2 fördelas därefter till brunnarna och inkuberas. Avidin i konjugat 2 binder specifikt till antikropps-HIV-1
Ag-komplexen bundna till brunnarnas väggar. Eventuellt obundet konjugat avlägsnas genom tvätt.
4. TMB-arbetslösning tillsätts till plattan och inkuberas. En blå eller blågrön färg utvecklas i förhållande till mängden
HIV-1 Ag som förekommer i provet. Framkallningen stoppas genom tillsats av syra som ändrar den blågröna färgen
till gult. Provernas och kontrollernas optiska absorbans bestäms med spektrofotometri vid en våglängd på 450/
620–700 nm.
77

3 - INNEHÅLL I GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA
MÄRKNING REAGENSTYP LEVERANSFORM
71120
R1 MIKROPLATTA : 12 remsor med 8 brunnar, 2 plattor
coatade med monoklonal(mus) antikropp mot HIV-1 p24
Konserveringsmedel : ProClin 300, natriumazid (< 0,1 %)
R2 KONCENTRERAD TVÄTTLÖSNING (10 x) 1 flaska
Buffert Tris NaCl pH 7,4
250 ml
Konserveringsmedel : 0,01 % natriummertiolat
R3 SPÄDNINGSVÄTSKA 1 flaska
Konserveringsmedel : 0,5 % ProClin 300
20 ml
Indikator för provtillsats (grön)
C0 NEGATIVT KONTROLLSERUM (humant) 1 flaska
Normalt humant serum, icke-reaktivt för HIV antigen, HBs Ag och antikroppar 10 ml
mot HIV-1, HIV-2, HCV och HTLV-1 0,005 % gentamicinsulfat.
Konserveringsmedel : 0,5 % ProClin 300
C1 POSITIVT KONTROLLSERUM 1 flaska
Renat, splittrat HIV-1 antigen
7 ml
Konserveringsmedel : 0,5 % ProClin 300
R4 KONJUGATKONCENTRAT 1 (100 x) 1 flaska
Anti-p24 konjugat (får) 0,005 % gentamicinsulfat.
1 ml
Konserveringsmedel : 0,5 % ProClin 300 Gult färgämne
R5 KONJUGATKONCENTRAT 2 (100 x) 1 flaska
Avidin-HRP konjugat 0,005 % gentamicinsulfat
1 ml
Konserveringsmedel : 0,5 % ProClin 300 Grönt färgämne
R6 KONJUGAT-SPÄDNINGSVÄTSKA 1 flaska
Buffert med proteinstabilisatorer
100 ml
Konserveringsmedel : 0,5 % ProClin 300
R8 SUBSTRATBUFFERT 1 flaska
Citronsyra/natriumacetat buffert pH 4,0
60 ml
Väteperoxid 0,015 %. Dimetylsulfaxid (DMSO) 4 %
R9 KROMOGEN 1 flaska
Tetrametylfaxid (TMB)
5 ml
R10 STOPPLÖSNING 2 flaskor
1N H 2 SO 4
2 x 28 ml
Plattförslutare
4 - NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL
• Destillerat vatten
• Hushållsblekmedel (5 till 8 % natriumhypoklorit) som kan spädas till en minimikoncentration på 10-procentigt
blekmedel (eller 0,5 % natriumhypoklorit). Alternativa desinfektionsmedel inbegriper: 70 % etanol eller 0,5 %
Wescodyne (West Chemical Products, Inc.).
• Precisionspipetter som kan pipettera volymer från 10 µl till 200 µl, 1 ml, 5 ml och 10 ml (noggrannhet inom
±10 %). En flerkanalspipett som kan pipettera 100 µl eller 200 µl (valfritt).
• Graderade mätglas på 25 ml, 100 ml, 1 000 ml
• Behållare för smittfarligt avfall.
• Vattenbad eller torr inkubator* med termostatinställning på 37 ±1°C eller 40 ±1°C.
• Manuell, halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor (*).
• Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620–700 nm filter (*).
• Nollremsor för delvis automatisk testning.
• EIA reagensbehållare (valfritt).
78
25 st

• Engångshandskar.
• Absorberande papper.
• Rena plastbehållare (av polystyren eller polypropylen) för beredning av konjugatarbetslösning och TMB-lösning.
• Cellodlingsmedium, t.ex. RPMI-1640 innehållande 10 % fetalt kalvserum, motsvarande det som används för
cellodling (vid analys av cellodlingsprov).
(*) Begär gärna mer information om den utrustning som vår tekniska avdelning rekommenderar.
5 - HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR
Alla reagens som ingår i testet är avsedda för in vitro-diagnostik.
• Använd engångshandskar när du hanterar reagens och prover. Tvätta händerna noggrant efter hantering.
• Munpipettera ej!
• Material av humant ursprung som använts vid beredning av negativ kontroll har testats och befunnits icke-reaktiv
för HIV-1 antigen, anti-HIV1 och anti-HIV2 antikroppar, hepatit B antigen (HBsAg), anti-HCV antikroppar och anti
HTLV 1/ HTLV 2 antikroppar.
• Den positiva kontrollen har värmeinaktiverats med dissocierande agens.
• Eftersom ingen metod med säkerhet kan garantera frånvaron av HIV, HBV, HCV eller andra smittsamma agens,
bör reagens och patientprover betraktas som potentiellt smittsamma och hanteras enligt sedvanliga rutiner.
• Betrakta material i direkt kontakt med prover, reagens av humant ursprung och även buffertlösningarna som
kontaminerat material och behandla dem som sådana.
• Undvik spill!
• Nedstänkta ytor skall rengöras med klorblekmedel utspätt till 10 %. Om det smittsamma materialet är en syra, skall de
nedstänkta ytorna först neutraliseras med bikarbonat, för att sedan rengöras med hjälp av klorblekmedel och avtorkas
med absorberande papper. Material som använts för rengöring skall kastas i behållare för smittat avfall.
• Prover, reagens av humant ursprung och kontaminerade material och produkter skall kastas efter desinfektion,
- antingen genom blötläggning i klorblekmedel i slutgiltig koncentration på 5 % natriumhypoklorit (1 volym
klorblekmedel per 10 volymer kontaminerad vätska) i 30 minuter
- eller genom autoklavering vid 121°C i minst 2 timmar.
Autoklavering är den bästa metoden för inaktivering av HIV och HBV.
VARNING ! KÖR INGA LÖSNINGAR INNEHÅLLANDE NATRIUMHYPOKLORIT I AUTOKLAV.
• Ett varuinformationsblad kan erhållas om så önskas.
• Undvik all hud- och slemhinnekontakt med substratbuffert, kromogen eller stopplösning (risk för toxicitet, irritation
eller brännskada).
• Glöm ej att neutralisera och/eller att autoklavera flytande lösningar eller vätska innehållande biologiska prover
innan de kastas i vasken.
• Hantering och avlägsnande av kemiska produkter skall genomföras enligt rutiner för god laboratoriesed (GLP).
• Vissa reagens innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Natriumazid kan bilda explosiva koppar- eller
blyazider i avloppsledningar. För att undvika ansamling av azider, skall ledningarna spolas med rikligt med vatten
om reagens slås ut i avloppet.
• Vissa reagens innehåller 0,5 % ProClin 300
ProClin TM 300 0,5 %: Irriterande
R43 : Kan verka irriterande vid hudkontakt.
S28-37 : Vid hudkontakt, tvätta genast med rikligt med tvål och vatten.
Använd lämpliga skyddshandskar
Xi - Irriterande
6 - FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas:
• Använd ej reagens efter passerat bäst före-datum.
• Ändra ej i testförfarandet.
• Späd alla reagens noggrant och undvik kontamination.
• Blanda inte reagenser från olika partier inom en bestämd testkörning.
Kommentar : För tvättlösningen (R2, märknings-ID: 10 x, blåfärgad), peroxidassubstratbufferten (R8, märknings-
ID: TMB buf., blåfärgad), kromogenen (R9, märknings-ID : TMB 11 x, lilafärgad) och stopplösningen (R10,
märknings-ID : 1N rödfärgad) kan du använda andra partier än de som ingår i testet om samma parti används
inom en bestämd testkörning. Dessa reagenser kan användas tillsammans med vissa andra produkter från vårt
företag. Kontakta vår avdelning för teknisk service om du vill ha mer information
• Låt reagens anta rumstemperatur (18–30°C) före användning (ca 30 min).
79

• Utför ej testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle
kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet.
• Använd glasvaror som har tvättats grundligt och sköljts i destillerat vatten eller använd helst engångsmaterial.
• Se till att mikroplattan inte hinner torka mellan tvättprocedur och reagenstillsats.
• Använd en ny pipettspets för varje prov.
• Kontrollera exakthet, precision och funktion av använda pipetter och instrument.
• Tvätt: Följ noggrant det beskrivna tvättförfarandet för bästa möjliga testresultat.
• Använd aldrig samma behållare för fördelning av konjugat- och framkallningslösning.
• Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de
olika konjugat- eller substratlösningarna.
• Framkallningslösningen (substratbuffert och kromogen) måste vara rosafärgad. Om den rosa färgen förändras
några minuter efter rekonstitueringen är detta en indikation på att reagenset inte kan användas och måste ersättas.
Framkallningslösningen kan beredas i rena engångstråg av plast eller i glasbehållare som först har förtvättats med
1N HCl och därefter sköljts noggrant med destillerat vatten och torkats. Detta reagens måste förvaras i mörker.
7 - PROVTAGNING OCH PROVHANTERING
Tag blodprov enligt sedvanlig praxis.
Serum-, plasma- och cellodlingsprover kan användas. Följande antikoagulantia har utvärderats och befunnits
acceptabla: EDTA, heparin, natriumcitrat, CPDA-1 och ACD. Prover som tagits i rör med antikoagulantia ska fyllas
helt upp till markeringen för att undvika spädningsfel.
Avlägsna serum eller plasma från koagel eller röda blodkroppar så fort som möjligt för att undvika hemolys. En
utpräglad hemolys kan inverka på testets prestanda. Prover med synliga partiklar ska renas genom centrifugering
före analys. Suspenderade fibrinaggregat eller fibrinpartiklar kan ge falskt positiva resultat.
Cellodlingsprover som kräver spädning före analys kan spädas med cellodlingsmedium som motsvarar det som
användes vid odling av cellerna.
ANVÄND EJ VÄRMEINAKTIVERADE PROVER.
Proverna bör förvaras vid +2-8°C om screeningen utförs inom 7 dagar, eller djupfrysas vid –20°C. Plasma ska tinas
snabbt genom uppvärmning några minuter i vattenbad i 40°C (för att undvika fibrinutfällning).
På grund av instabilitet hos HIV Ag får temperaturer över 40°C inte användas.
Prover som har fryst/tinats fler än 3 gånger får inte användas.
Om proverna ska transporteras, skall de förpackas enligt regler för transport av etiologiska ämnen.
ANVÄND EJ KONTAMINERADE, HYPERLIPEMISKA ELLER HYPERHEMOLYSERADE SERUM- ELLER PLASMAPROVER.
Kommentar : Prover som innehåller upp till 80 mg/l bilirubin, 36 mg/l Ig M eller IgG, lipemiska prover som
innehåller upp till motsvarande 5 g/l lipider och hemolyserade prover som innehåller upp till 5 g/l hemoglobin
påverkar inte resultaten.
8 - REKONSTITUTION AV REAGENS
Obs! Låt reagens anta rumstemperatur (18–30°C) före användning med undantag för konjugatkoncentrat 1 och 2
(R4 och R5).
1) Reagens färdiga att använda
Reagens R1 : Mikroplatta
Varje bricka innehållande 12 remsor är förpackad i en försluten foliebelagd påse. Klipp upp påsen med sax eller
skär upp den med skalpell 0,5–1 cm ovanför markeringen. Öppna påsen och ta ut brickan. Lägg tillbaka remsor
som inte används i påsen. Återförslut påsen och förvara den vid +2–8 °C.
Reagens R3 : Spädningsvätska
Reagens C0 : Negativt kontrollserum
Reagens C1 : Positivt kontrollserum
Reagens R10 : Stopplösning
2) Reagens att späda
Tvättlösning (X10) (R2)
Späd tvättlösningen R2 1:10 med destillerat vatten. Homogenisera.
OBS ! Genetic Systems EIA tvättlösningskoncentrat (30X), som ingår i andra Genetic Systems testkit, kan även
användas i denna analys. Späd 1 del koncentrat med 29 delar vatten.
Konjugatarbetslösning 1 (R4 + R6) och konjugatarbetslösning 2 (R5 + R6)
Konjugat 1 (R4) och 2 (R5) levereras som 100X koncentrat. Bered separat konjugatarbetslösning 1 och konjugatarbetslösning
2 genom att späda varje konjugat 1:101 i konjugatspädningsvätska (R6). Bered i rena plastbehållare.
Anteckna konjugatkoncentratets partinummer, datum och klockslag för beredning samt datum och klockslag för sista
80

förbrukning (24 timmar efter beredning) på behållaren. Blanda arbetslösningen försiktigt före användning. Efter
blandning är konjugatarbetslösning 1 gul och konjugatarbetslösning 2 grön.
Beredning av konjugatarbetslösning 1 eller 2 per remsa
Antal remsor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
som ska användas
Mängd konjugat 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
koncentrat (µl)
Mängd konjugat 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
spädningsvätska (ml)
* En hel platta; **Två hela plattor
Enzym framkallningslösning (R8 + R9)
Späd kromogen (R9) 1:11 i substratbuffert (R8). (t.ex.: 1 mL reagens R9 +10 mL reagens R8). 10 mL krävs och är
tillräckligt för 1 till 12 remsor. Homogenisera.
9 - FÖRVARINGSFÖRHÅLLANDEN - HÅLLBARHET
Testet bör förvaras vid +2-8°C. Varje reagens som ingår i Genetic Systems HIV-1 Ag EIA test kan användas efter
första öppnandet till det sista förbrukningsdatum som anges på förpackningen med undantag för nedanstående
särskilda anvisningar :
R1 : Efter att den vakuumförslutna påsen har öppnats är mikrobrunnsremsorna stabila i 1 månad om de förvaras vid
+2-8°C i väl återförsluten påse.
R2 : Spädd tvättlösning är stabil i 14 dagar i plastbehållare vid förvaring i +2-8°C.
R8 + R9 : Efter rekonstituering är reagenset stabilt i 6 timmar, vid mörk förvaring i rumstemperatur (18-30°C).
R4 - R5 : Efter rekonstituering är konjugatarbetslösningarna stabila i 24 timmar i rumstemperatur (18-30°C).
10 - TESTFÖRFARANDE
Nedan beskrivs två förfaranden för detektion av HIV-1 p24 antigen i humant serum-, plasma- eller cellodlingsprov :
Förfarande Inkubering Inkubering av Inkubering av Färgav
prov konjugat 1 konjugat 2 framkallning
37°C Statisk inkubering Statisk inkubering Statisk inkubering Statisk inkubering
inkubering 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, 18 till 30°C
torr värme torr värme torr värme i mörker
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
40°C IStatisk inkubering Statisk inkubering Statisk inkubering Statisk inkubering
inkubering 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 30 ± 1 min.
torr värme torr värme torr värme torr värme
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
För prover som ursprungligen analyserats vid antingen 37°C eller 40°C ska eventuell upprepad analys eller
konfirmation utföras med samma förfarande.
Den förväntade analystiden för detta test är ungefär 3,5–4 timmar från start av den första inkubationen. Varje
omgång av analysen måste utföras till slut utan avbrott sedan den väl startats.
Två positiva kontroller och tre negativa kontroller ska analyseras på varje platta.
Tre cellodlingsmediumkontroller behövs i stället för förpackningens negativa kontroll (C0) om cellodlingsprover
testas.Gränsvärdet för patientprover fastställs med kontrollerna på varje separat platta.
Undvik att utsätta plattorna för ljus under det sista inkuberingssteget (efter tillsats av TMB-arbetslösning).
Följ föreslaget förfarande noga och följ god laboratoriesed enligt nedan :
1. Definiera noga provfördelnings- och identifieringsprotokoll.
2. Bered tvättlösningen.
3. Ta ut bricka och remsor (R1) ur skyddsförpackningen.
4. Applicera direkt, utan föregående tvätt av plattan, i tur och ordning:
4.1 50 µl spädningsvätska i varje brunn.
4.2 150 µl negativt kontrollserum (C0) i brunn A1- B1 - C1.
4.3 150 µl positivt kontrollserum (C1) i brunn D1- E1.
4.4 150 µl prov i brunn G1, etc.
Tre cellodlingsmediumkontroller behövs i stället för förpackningens negativa kontroll om cellodlingsprover
analyseras. Kontrollera att spädningsvätskan blandas väl med provet (eller kontrollen).
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OBS ! Provfördelning kan kontrolleras visuellt i detta hanteringssteg. Efter tillsats av prov ändrar spädningsvätskan
färg från grönt till blått för att visa att provet eller kontrollen är tillsatt i brunnen. När innehållet i varje brunn
blandas väl är färgen enhetlig. Cellodlingsprover uppvisar eventuellt inte någon färgförändring beroende på det
cellodlingsmedium som används. (Se punkt 12 angående automatisk verifiering - SPEKTROFOTOMETRISK
VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING)
5. Täck om möjligt mikroplattan med självhäftande film. Tryck fast den ordentligt över plattan så att det blir tätt.
6. Inkubera plattan i 60 ± 5 minuter vid 37 ± 1°C eller 40 ± 1°C i en statisk inkubator med torr värme.
7. Ta bort den självhäftande filmen. Aspirera innehållet i alla brunnar till en behållare för smittförande avfall
(innehållande natriumhypoklorit). Fördela minst 0,370 ml tvättlösning till varje brunn. Vänta under en blötningstid
på 20 till 60 sekunder. Sug upp igen. Upprepa detta 4 gånger (dvs. totalt minst 5 tvättar). Den återstående
volymen måste vara mindre än 10 µL. (Om det behövs kan du torka mikroplattan genom att vända den upp och
ned på ett absorberande papper).
Om automatisk tvättare används ska samma förfarande följas.
8. Fördela snabbt 100 µL av konjugatarbetslösning 1 till alla brunnar.
Konjugatet måste skakas varsamt innan användning.
OBS ! Tillsats av konjugatarbetslösning 1 som är färgad gul kan kontrolleras visuellt vid detta steg av analysen.
9. Täck om möjligt mikroplattan med självhäftande folie. Inkubera plattan i 30 ± 5 minuter vid 37 ± 1°C eller
40 ±1°C i en statisk inkubator med torr värme.
10. Ta bort den självhäftande filmen. Aspirera innehållet i alla brunnar i en behållare för smittförande avfall
(innehållande natriumhypoklorit). Fördela minst 0,370 ml tvättlösning till varje brunn. Vänta under en blötningstid
på 20 till 60 sekunder. Sug upp igen. Upprepa detta 4 gånger (dvs. totalt minst 5 tvättar). Den återstående
volymen måste vara mindre än 10 µl. (Om det behövs kan du torka mikroplattan genom att vända den upp och
ned på ett absorberande papper.)
11. Fördela snabbt 100 µL av konjugatarbetslösning 2 till alla brunnar.
Konjugatet måste skakas varsamt innan användning.
Observera : Tillsats av konjugatarbetslösning 2 som är grönfärgad kan kontrolleras visuellt vid detta steg av analysen.
12. Täck om möjligt mikroplattan med självhäftande film. Inkubera plattan i 30 ± 5 minuter vid 37 ± 1°C eller
40 ± 1°C i en statisk inkubator med torr värme.
13. Ta bort den självhäftande filmen, töm alla brunnar genom att suga upp vätskan och tvätta minst 5 gånger enligt
ovanstående beskrivning. Den återstående volymen måste vara mindre än 10 µl. (Om det behövs kan du torka
remsorna genom att vända dem upp och ned på ett absorberande papper.)
14. Fördela snabbt i varje brunn 100 µl av framkallningslösningen (R8+R9) som beretts strax före användningen. Låt
reaktionen fortgå i mörker i 30 ± 5 minuter vid rumstemperatur (18–30°C). Använd ingen självhäftande folie
under denna inkubering.
Obs ! Fördelningen av framkallningslösningen, som är rosafärgad, kan kontrolleras visuellt i denna fas av
hanteringen. Det finns en klar färgskillnad mellan tomma brunnar och brunnar med den rosafärgade substratlösningen.
(Se avsnitt 12 om automatisk verifiering : SPEKTROFOTOMETRISK PROV- OCH REAGENSPIPETTERING)
15. Tillsätt 100 µl av stopplösningen (R10). Använd samma ordningsföljd och fördelningshastighet som för
substratlösningen. Homogenisera reaktionsblandningen.
OBS ! Fördelningen av stopplösningen, som är färglös, kan kontrolleras visuellt i denna fas av hanteringen. Efter
tillsats av stopplösningen försvinner substratets rosa färg (för negativa prover) eller ändrar färg från blått till gult
(för positiva prover).
16. Torka noggrant av mikroplattans botten. Vänta minst 4 minuter efter tillsatsen av stopplösningen innan avläsning
görs. Avläs den optiska densiteten vid 450/620-700 nm med hjälp av mikroplattans avläsare inom 30 minuter
efter att reaktionen har avbrutits.
17. Kontrollera alla resultat med avseende på överensstämmelse mellan avläsning och provtillsats- och identifieringsprotokoll
för plattan.
11 - BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT
1) Validering av resultat
En analysomgång är giltig om följande kriterier uppfylls :
• Absorbansvärdet för varje negativ kontroll (NC) (eller cellodlingskontroll, om tillämpligt) är större än 0,000 AU och
mindre än eller lika med 0,100 AU. Ett värde för den negativa kontrollen kan kasseras om det faller utanför
gränsvärdet. NC-medelvärdet kan beräknas från de två återstående absorbansvärdena. Om två eller fler negativa
kontroller ligger utanför gränsen, är plattan ogiltig och testet måste upprepas.
• Medelvärdet för de positiva kontrollerna (PCX) måste vara större än eller lika med 0,500 AU och de enskilda
absorbansvärdena måste ligga inom intervallet för reproducerbarheten på 0,65 till 1,35 gånger PCX. Inget värde
för den positiva kontrollen får uteslutas.
82

2) Beräkning av absorbansmedelvärde
Från de validerade kontrollerna kan absorbansmedelvärdet bestämmas för de negativa kontrollerna och de positiva
kontrollerna genom att summan av respektive kontroll divideras med antalet godkända kontroller.
3) Gränsvärde
Bestäm gränsvärdet genom att addera 0,070 till NC-medelvärdet (NCX) enligt nedanstående exempel :
NCX = 0,033
Gränsvärde = 0,070 + 0,033 = 0,103
4) Utvärdering av resultat
Förekomst eller frånvaro av HIV-1 antigen bestäms genom att provets absorbansvärde jämförs med gränsvärdet.
Prover med absorbansvärden

Diagnostisk specificitet
Den diagnostiska specificiteten som utvärderades på :
• 4 038 blodgivare uppskattades till 99,95 %.
• 209 kliniska patienter uppskattades till 100 %.
En panel bestående av 105 patientprover har testats. Den var sammansatt av prover :
• innehållande antikroppar mot HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, rubella, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, CMV
• innehållande autoantikroppar, reumafaktor- IgG och IgM
• från gravida kvinnor, cirrospopulation, patienter som erhållit flera transfusioner och patienter med systemisk lupus
erythematosus
Endast ett prov från en patient med systemisk lupus erythematosus har befunnits reaktivt enligt Genetic Systems
HIV-1 Ag EIA men har ej bekräftats med konfirmationstestet.
Noggrannhet
Reproducerbarheten inom test har utvärderats genom analys av 3 positiva prover och ett negativt prov 30 gånger i
samma analysomgång.
Reproducerbarheten mellan test har utvärderats genom analys av 3 positiva prover och ett negativt prov under 5
dagar med 2 olika operatörer.
Variationskoefficienten för positiva prover var mindre än 10 %.
14 - BEGRÄNSNINGAR
• Förfarandet för Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA och utvärderingen av resultat måste följas vid analys av
serum-, plasma- eller cellodlingsprover med avseende på förekomst av HIV-1 antigen. Användaren av denna
förpackning bör läsa bipacksedeln noga innan testet utförs. I synnerhet måste testförfarandet följas noga
beträffande pipettering av prov och reagens, tvätt av platta och tid för inkuberingsstegen.
• En bestämning av ett prov som reaktivt för HIV-1 antigen får inte baseras på ett enstaka reaktivt testresultat.
Ytterligare testning som till exempel konfirmationstest erfordras för att bestämma specificiteten för ett prov som är
reaktivt enligt screeningförfarandet.
• Liksom för alla högkänsliga immunanalyser finns det en risk för icke-specifika reaktioner som kan leda till falskt
positiva resultat. Andelen falskt reaktiva resultat beror på testets sensitivitet och specificitet.
• Negativa resultat kan erhållas om koncentrationen av HIV-Ag i provet är för liten för testets detektionsgränser eller
om den markör som detekteras inte förekommer under det sjukdomsstadium då provet tas.
• Med hänsyn till variationerna av HIV-virus ska möjligheten för falskt negativa resultat inte uteslutas. Ingen känd
testmetod kan fullständigt garantera frånvaro av HIV-virus.
• Om det beskrivna förfarandet ej följs vid tillsats av prov eller reagens, kan det leda till ett falskt negativt test.
Upprepad analys ska övervägas om det finns klinisk misstanke om infektion eller handhavandefel.
• Ett absorbansvärde på mindre än 0,000 AU tyder på ett handhavandefel eller instrumentfel, varvid testet ska
upprepas.
• Faktorer som kan inverka på resultatens giltighet är till exempel om provet inte fördelas i brunnen, otillräcklig tvätt
av mikroplattans brunnar, om angivna inkuberingstider och temperaturer inte följs, fördelning av fel reagens till
brunnarna, förekomst av metaller eller stänk av blekmedel i brunnarna.
• Testets prestanda har inte utvärderats på post mortem-prover eller på andra biologiska vätskor än serum-, plasmaoch
cellodlingsprover.
• Spädningsvätskans färg ändras eventuellt inte för cellodlingsprover beroende på cellodlingsmediet.
• Även om den analytiska sensitiviteten uppskattats till 8 pg/mL vid utvärdering av detta test, kan den variera efter
driftsförhållandena och beroende på variationer mellan tillverkningssatser. Bio-Rad garanterar därför endast den
analytiska sensitiviteten under 15 pg/mL.
• Den kolorimetriska metoden för verifiering av prover, konjugat och framkallningslösning medger inte verifiering av
noggrannheten av de fördelade volymerna. Denna metod visar bara förekomsten av prov, konjugat och
framkallningslösning i brunnarna. Graden av felsvar med denna metod är nära förbunden med noggrannheten för
det använda systemet (kumulerad variationskoefficient för fördelning och avläsning över 10 % minskar signifikant
verifieringens kvalitet).
• Vid mycket dålig tvätteffekt efter konjugatinkuberingen, kan den automatiska verifieringen av pipetteringen av
framkallningslösning (genom avläsning av OD i brunnarna vid 490 nm) ge felaktiga resultat, med OD över 0,100
i frånvaro av framkallningslösning. Detta fenomen har dock inte observerats under utvärderingen av 939 testade
prover.
15 - REFERENSER
Se fransk version
84

GENETIC SYSTEMS HIV-1 Ag EIA
192 Test 71120
ENZYMIMMUNANALYSE (EIA) TIL KONSTATERING AF HUMAN
IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I (HIV-1) P24-ANTIGEN I
HUMANT SERUM, PLASMA OG CELLEKULTUR SUPERNATANT
IVD
Producentens kvalitetskontrol
Alle producerede og kommercialiserede reagenser er underlagt et komplet kvalitetssystem lige fra
modtagelsen af råmaterialet til den endelige kommercialisering af produktet.
Hvert parti sendes til kvalitetskontrol og frigives kun til markedet, hvis det opfylder de fastsatte
godkendelseskriterier.
Dokumentationen i forbindelse med produktion og kontrol af hvert parti opbevares i virksomheden.
85

INDHOLD
1 - KLINISK VÆRDI
2 - PRINCIP FOR GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA
3 - INDHOLD AF GENETIC SYSTEM TM HIV-1 ANTIGEN EIA
4 - NØDVENDIGT, IKKE MEDFØLGENDE MATERIALE
5 - HELBREDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER
6 - FORHOLDSREGLER
7 - INDSAMLING OG HÅNDTERING AF PRØVEMATERIALE
8 - REKONSTITUERING AF REAGENSER
9 - OPBEVARINGSBETINGELSER - HOLDBARHED
10 - ANALYSEPROCEDURE
11 - BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE
12 - SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE - OG REAGENSPIPETTERING
13 - YDEEVNE
14 - TESTENS BEGRÆNSNINGER
15 - REFERENCER
86

1 - KLINISK VÆRDI
Det ætiologisk aktive organisme i Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) er en retrovirus, som kaldes Human
Immunodeficiency Virus (HIV). HIV er isoleret fra patienter med AIDS og fra raske personer med stor risiko for at få
AIDS 1,2 . Man ved, at overførsel sker ved intim seksuel kontakt, ved brug af inficerede nåle, ved transfusioner af
inficerede blodprodukter og perinatalt fra inficerede mødre til foster eller barn. 1,8 .
Tegn på, at patienten har været udsat for HIV, ses normalt ved tilstedeværelsen af virusspecifikke antistoffer i
vedkommendes serum eller plasma efter eksponering for virusen. Før de sporbare antistoffer viser sig, er der en tidlig
periode i forløbet, hvor frie, virale antigener cirkulerer i blodet. Et af disse virale antigener er det virale kerneprotein
p24. HIV-antigenanalyser kan anvendes til at konstatere tilstedeværelsen af virale antigener, og dermed en HIV-infektion,
før serokonversion. Perioden med tilstedeværelse af antigener, som går forud for forekomsten af HIV-antistoffer, varierer
og kan vare i dage eller uger hos smittede personer. Når serokonverteringen finder sted, danner virusspecifikke
antistoffer komplekser med de cirkulerende antigener, således at niveauet af frie antigener i blodet falder eller forsvinder
fuldstændigt. 9,11 . Senere i sygdomsforløbet kan der igen forekomme frie antigener. 12
Genetic Systems TM HIV-1 Antigen EIA er beregnet til screening af doneret blod og plasma og som en hjælp i
diagnosticering og prognosticering af HIV-1-infektion.
2 - PRINCIP FOR GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
Genetic Systems TM HIV-1 Antigen EIA er en enzymimmunteknik til påvisning af HIV-1 kerneantigenet (p24) i humane
serum- og plasmaprøver. "Genetic Systems HIV-1 Antigen Confirmatory" Test (kode 71121) er en supplerende
analyse til brug sammen med HIV-1 Antigen EIA for at bekræfte tilstedeværelsen af HIV p24 antigenet i gentagne
reaktive prøver.
Genetic Systems TM HIV-1 Antigen EIA er baseret på anvendelsen af en fast fase belægt med monoklonale antistoffer
fra mus mod HIV-1 Antigen, et primært konjugat med biotinyleret anti-p24 antistof fra får og et sekundært konjugat
med avidin bundet til peroxidase fra peberrod.
Udførelsen af testen omfatter følgende trin i reaktionsforløbet:
1. Prøvefortynder tilsættes hver brønd. De prøver, der skal testes, og kontrolsera tilføres deres respektive brønde. Hvis
der findes HIV-1 Ag i prøven, binder det sig til antistofferne i brønden. HIV-1 Ag bundet til brønden forbliver der
under efterfølgende vask.
Prøvefortynderens farve skifter fra grøn til blå for at bekræfte, at en prøve (eller kontrol) er tilsat brønden.
2. Konjugat 1 tilsættes herefter hver brønd, og disse inkuberes. Det biotinylerede fåre-anti-p24 antistof i konjugat 1
binder sig til HIV-1 Ag somer bundet til HIV-1 antistof i brønden. Antigen-antistofkomplekserne forbliver bundet
under det efterfølgende vask.
3. Konjugat 2 tilsættes herefter hver brønd og inkuberes. Avidinen i konjugat 2 bindes specifikt til antistof-HIV-1 Agkomplekserne,
som er bundet til brønden. Ubundet konjugat vaskes bort.
4. TMB-opløsning tilsættes herefter pladen og inkuberes. En blå eller grøn farve udvikles i forhold til den mængde
HIV-1 Ag, der findes i prøven.
Farveudviklingen standses ved tilsætning af syre, hvorved den blå-grønne farve skifter til gul. Den optiske
absorption af prøverne og kontrollerne bestemmes spektrofotometrisk ved en bølgelængde på 450/620-700 nm.
87

3 - INDHOLD AF GENETIC SYSTEM HIV-1 ANTIGEN EIA
ETIKET REAGENSTYPE PRÆSENTATION
71120
R1 MIKROTITERPLADE: 2 plader
12 teststrimler med 8 brønde, belagt med murine, monoklonale antistoffer
mod HIV-1 p24.
Konserveringsmiddel : ProClin 300 Natriumazid (< 0,1%)
R2 Koncentreret skylleopløsning (10x) 1 flaske
Tris NaCl-buffer pH 7,4
250 ml
Konserveringsmiddel : Thimerosal 0,01 %
R3 Prøvefortynder 1 flaske
Konserveringsmiddel : ProClin 300 0,5% Prøvetilsætningsfarve (grøn)
20 ml
CO Negativt Kontrolserum (Humant) 1 flaske
Normalt humant serum ikke reaktivt for HIV-antigen, HBs Ag og antistoffer
10 ml
mod HIV-1, HIV-2, HCV og HTLV-1.Gentamicinsulfat, 0,005%
Konserveringsmiddel : ProClin 300 0,5%
C1 Positivt Kontrolserum 1 flaske
Oprenset, dissocieret HIV-1 antigen.
7 ml
Konserveringsmiddel : ProClin 300 0,5 %
R4 Koncentreret konjugat 1 (100 X) 1 flaske
Anti-p24 konjugat fra får Gentamicinsulfat, 0,005 %
1 ml
Konserveringsmiddel : ProClin 300 0,5 % Gul farve
R5 Koncentreret konjugat 2 (100 X) 1 flaske
Avidin-HRP-konjugat Gentamicinsulfat, 0,005%
1 ml
Konserveringsmiddel : ProClin 300 0,5% Grøn farve
R6 Konjugatfortynder 1 flaske
Buffer med proteinstabilisatorer
100 ml
Konserveringsmiddel : ProClin 300 0,5%
R8 Substratbuffer 1 flaske
Citronsyre/Natriumacetatbuffer pH 4,0
60 ml
Hydrogenperoxid 0,015% Dimethylsulphoxid (DMSO) (4%).
R9 Kromogen 1 flaske
Tetramethylbenzidin (TMB)
5 ml
R10 Stopopløsning 2 flasker
1N H 2 SO 4
2 x 28 ml
Selvklæbende film til mikrotiterplader
25 film
4 - NØDVENDIGT, IKKE MEDFØLGENDE MATERIALE
• Destilleret vand
• Natriumhypoklorit fortyndes til en minimumkoncentration 0,5% natriumhypoklorit). Alternative desinficeringsmidler
er: 70% ethanol eller 0,5% WescodyneTM (West Chemical Products, Inc.)
• Præcisionspipetter til levering af mængder fra 10 µl til 200 µl, 1 ml, 5 ml og 10 ml (nøjagtighed inden for ± 10%).
En multikanal-pipetteringsenhed, som kan levere 100 µl eller 200 µl, kan også anvendes.
• Graduerede cylinderglas på 25 ml, 100 ml og 1000 ml.
• affaldsbeholder til farligt affald.
• Vandbad eller varmeskab* med termostatindstilling til 37°C ± 1°C eller 40°C ± 1°C.
• Manuel, halvautomatisk eller automatisk mikrotiterpladevasker (*).
• Mikrotiterpladelæser med filtre på 450 nm og 620-700 nm (*).
• Strimler med brønde uden antistof belægning (Bruges som pladsholder i automatisk mikrotiterpladelæser).
• EIA reagensbeholdere (valgfri).
• Engangshandsker.
• Sugende papir.
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• Rene plastikbeholdere (af enten polystyren eller polypropylen) til forberedelse af konjugatopløsninger og TMB-opløsning.
• Cellekulturmedium, fx RPMI-1640 indeholdende 10% føtalt kalve serum, svarende til det, der anvendes til den
inficerede cellekultur (til test af cellekulturprøver).
(*) Kontakt os, hvis detaljerede oplysninger om det udstyr, der anbefales af vores tekniske afdeling ønskes.
5 - HELBREDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER
Alle reagenser i kittet er beregnet til "in vitro"-diagnosticering.
• Benyt engangshandsker, når reagenserne og prøverne håndteres, og vask hænderne grundigt efter håndteringen.
• Undgå at pipettere med munden.
• Humant kildemateriale, der er brugt i fremstillingen af den negative kontrol, er testet og fundet ikke-reaktivt for
HIV-1 antigen, anti-HIV1- og anti-HIV2-antistoffer, hepatitis B-antigen (HB Ag), anti-HCV-antistoffer, anti-HTLV 1/
HTLV-2-antistoffer og anti-HIV1/HIV2.
• Den positive kontrol er varmeinaktiveret under tilstedeværelse af et dissocieringsstof.
• Da der ikke er kendskab til en testmetode, der med garanti kan sikre, at viraene HIV, Hepatitis B eller C eller
andre smitstoffer ikke forekommer, skal disse reagenser samt patientprøverne betragtes som potentielt smitsomme
og håndteres varsomt.
• Alt udstyr, der er i direkte kontakt med prøver og reagenser af humant kildemateriale samt bufferopløsninger, skal
betragtes som kontaminerede og håndteres derefter.
• Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale.
• Kontaminerede overflader skal rengøres med natriumhypoklorit i en opløsning på 10%. Hvis den kontaminerende
væske er en syre, skal de kontaminerede overflader først neutraliseres med natriumbikarbonat, derefter renses
med natriumhypoklorit og tørres op med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal kasseres
og placeres i en beholder til biologisk farligt affald.
• Prøver, reagenser af humant kildemateriale samt kontaminerede materialer og produkter skal kasseres efter
desinficering:
- enten ved nedsænkning i natriumhypoklorit med en slutkoncentration på 5% (1 del natriumhypoklorit til 10
dele kontamineret væske eller vand) i 30 minutter
- eller ved autoklavering ved 121°C i mindst to timer.
Autoklavering er den bedste metode til at deaktivere HIV og HBV.
ADVARSEL! UNDGÅ AT PLACERE OPLØSNINGER, DER INDEHOLDER NATRIUMHYPOKLORIT, I AUTOKLAVEN.
• Sikkerhedsdataarket udleveres ved henvendelse.
• Undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og stopopløsningen (fare for
forgiftning, irritation eller ætsning).
• Husk at neutralisere og/eller autoklavere affaldsopløsninger fra rengøringsprocessen eller enhver anden væske,
der indeholder biologisk prøvemateriale, før de hældes i afløbet.
• Kemikalier skal håndteres og kasseres ifølge god laboratoriepraksis.
• Nogle reagenser indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid kan danne kobber- og blyazider
i laboratoriets rør. Disse azider er eksplosive. Undgå dannelse af azider ved at skylle rørene med store mængder
vand, hvis opløsninger med azidindhold hældes i afløbet efter deaktivering.
• Nogle reagenser indeholder 0,5 % ProClin 300.
ProClin 300 0,5%: Lokal irriterende
R43 : Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden
S28-37 : Kommer stof på huden vaskes straks med store mængder sæbe og vand. Brug egnede
beskyttelseshandsker under arbejdet
Xi - Lokal irriterende
6 - FORHOLDSREGLER
Resultaternes pålidelighed afhænger af en korrekt overholdelse af følgende regler for god laboratoriepraksis:
• Undgå at anvende forældede reagenser.
• Analyseproceduren må ikke ændres.
• Rekonstituer reagenserne forsigtigt for at undgå kontaminering.
• Bland ikke reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel.
Bemærk : Det gælder for vaskeopløsning (R2, etiketidentifikation: 10 x farvet blå), peroxidasesubstratbuffer
(R8, etiketidentifikation: TMB-buffer, farvet blå), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB 11x, farvet lilla) og
stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N farvet rød). Det er muligt at bruge andre partier end dem i dette
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sæt under forudsætning af, at det samme parti bruges inden for hele testforløbet. Disse reagenser kan anvendes
sammen med en række andre produkter fra vores virksomhed. Kontakt vores tekniske serviceafdeling for
detaljerede oplysninger.
• Vent 30 minutter, før reagenserne tages i brug, så de kan stabilisere sig ved stuetemperatur (18-30°C).
• Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der
kan ændre konjugatets enzymaktivitet.
• Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er rengjort grundigt og skyllet med
destilleret vand.
• Undgå, at mikrotiterpladen tørrer ud mellem fra vask og fordelingen af reagensstoffet.
• Brug en ny pipettespids til hver prøve.
• Kontroller, at pipetterne er præcise og nøjagtige, og at de instrumenter, der anvendes, fungerer korrekt.
• Vask: Følg de foreskrevne vaskeprocedurer nøje for at opnå de bedst mulige testresultater.
• Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat og farveudviklingsopløsning.
• Enzymreaktionen er meget følsom over for metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med
de forskellige konjugat- eller substratopløsninger.
• Udviklingsopløsningen (substratbuffer + kromogen) skal være pink. Ændres den pink farve inden for få minutters
opløsning, kan reagensen ikke anvendes og skal udskiftes.
Forberedelsen af udviklingsopløsningen kan foretages i en ny engangsplastikbakke eller en glasbeholder, der først
er rengjort med 1N HCI og derefter skyllet grundigt med destilleret vand og tørret. Denne reagens skal opbevares
i mørke.
7 - INDSAMLING OG HÅNDTERING AF PRØVEMATERIALE
Tag en blodprøve i overensstemmelse med gældende praksis.
Der kan anvendes serum, plasma eller cellekulturprøver. Følgende antikoagulanter er vurderet og fundet acceptable:
EDTA, heparin, natriumcitrat, CPDA-1 og ACD. Prøver, som indsamles i antikoagulantrør, skal fylde røret helt op som
noteret på etiketten for at undgå utilsigtet fortynding.
Separer serummet eller plasmaet fra de koagulerede eller røde celler, så snart det er muligt, for at undgå eventuel
hæmolyse. Udbredt hæmolyse kan påvirke testresultatet. Prøvemateriale med observerbare partikler skal renses ved
centrifugering forud for testen. Opslæmmede fibrinaggregater eller -partikler kan give fejlagtigt positive resultater.
Cellekulturprøver, som skal fortyndes før testen, skal fortyndes med et cellekulturmedium svarende til det, der er
anvendt for at dyrke cellerne.
ANVEND IKKE VARME-INAKTIVERET PRØVEMATERIALE.
Prøverne skal opbevares ved 2-8°C, hvis screeningen udføres inden for 7 dage, eller dybfryses ved -20°C.
Plasmaprøver skal tøs hurtigt op ved få minutters opvarmning i vandbad ved 40°C (for at undgå fibrinudfældning).
På grund af HIV Ag’sustabilitet kan temperaturer over 40°C ikke anvendes.
Prøver, der har været nedfrosset og optøet mere end tre gange, kan ikke anvendes.
Hvis prøvematerialet skal sendes, skal det pakkes ifølge de gældende regulativer angående transport af ætiologiske
agenser.
UNDGÅ AT ANVENDE KONTAMINERET, HYPERLIPÆMISK ELLER HYPERHÆMOLYSERET SERUM ELLER PLASMA.
Bemærk : Prøver, der indeholder op til 80 mg/l bilirubin, 36 mg/l Immunoglobulin M eller G, lipæmiske prøver, der
indeholder mængder op til det, der svarer til 5 g/l lipider og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 5 g/l
hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne.
8 - REKOMSTITUERING AF REAGENSER
Bemærk : Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur (18-30°C), før de anvendes, med undtagelse af
koncentreret konjugat 1 og 2 (R4 og R5).
• Brugsklare reagenser
Reagent R1 : Mikrotiterplade
Hver bakke indeholder 12 teststrimler, der er pakket i en forseglet foliepose. Åbn posen med en saks eller skalpel
0,5-1 cm oven for linjen. Åbn posen, og fjern bakken. Læg ubrugte teststrimler tilbage i posen. Forsegl posen igen,
og placer den igen ved 2-8°C.
Reagent R3 : Prøvefortynder
Reagent C0 : Negativt kontrolserum
Reagent C1 : Positivt kontrolserum
Reagent R10 : Stopopløsning
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• Reagenser til rekonstituering
Skylleopløsning (X10) (R2) : Fortynd skylleopløsningen R2 i 10 ml destilleret vand. Bland.
BEMÆRK : Genetic Systems EIA Wash Solution Concentrate (30X), et komponent i andre genetiske system-testkits,
kan også anvendes i denne analyse. Fortynd 1 del koncentrat med 29 dele vand.
Konjugatopløsning 1 (R4 + R6) og Konjugatopløsning 2 (R5 + R6)
Konjugaterne 1 (R4) og 2 (R5) leveres som 100X koncentrater. Fremstil separat konjugatopløsning 1 og konjugatopløsning
2 ved at fortynde hver konjugat 1:101 i konjugatfortynder (R6). Forbered det i rene plastikbeholdere. Noter
konjugatkoncentrationens lotnummer, dato og tidspunkt for tilberedelsen samt dato og tidspunkt for udløb (24 timer
fra tilberedelsen) på beholderen. Bland arbejdsreagenserne forsigtigt før brug. Efter blanding er konjugatopløsning
1 gul og konjugatopløsning 2 grøn.
Forberedelse af konjugatopløsning 1 eller 2 ved strimmel
Antal strimler 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24**
der skal bruges
Mængde konjugat 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240
Koncentrat (µl)
Mængde konjugat 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
Fortynder (ml)
* En fuld plade; **To fulde plader
Farveudviklingsopløsning (R8 + R9)
Opløs kromogenet (R9) 1:11 i buffersubstratet (R8). (Eksempel: 1 ml R9-reagens +10 ml R8-reagens). Der skal bruges
10 ml til mellem 1 og 12 teststrimler. Bland.
9 - OPBEVARINGSBETINGELSER - HOLDBARHED
Kittet skal opbevares ved 2-8°C. Hver reagens i Genetic SystemsTM HIV-1 Ag EIA-kittet kan efter åbning anvendes
indtil den på pakken anførte udløbsdato, medmindre andet er angivet:
R1 : Når den vakuumforseglede pose er åbnet, forbliver teststrimlerne med mikrotiterpladebrøndene holdbare i en
måned, når de opbevares ved 2-8°C i den omhyggeligt forseglede pose.
R2 : Når den færdige vaskeopløsning opbevares ved 2-8°C, er den holdbar i 14 dage i en plastikbeholder.
R8 - R9 : Når reagensen er opløst og opbevares i mørke, den holdbar i seks timer ved stuetemperatur (18-30°C).
R4 - R5 : Når konjugatet er opløst, er det holdbart i 24 timer ved stuetemperatur (18-30°C).
10 - ANALYSEPROCEDURE
To procedurer til påvisning af HIV-1 p24 Antigen i humant serum, plasma eller cellekulturprøver beskrives
nedenfor:
Fremgang Prøvemateriale Konjugat 1 Konjugat 2 Farve
småde inkubation inkubation inkubation fremkaldning
37°C inkubation, inkubation, inkubation, inkubation,
inkubation, 37±1°C, 37±1°C, 37±1°C, 18 to 30°C,
varmeskab varmeskab varmeskab i mørke
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
40°C inkubation, inkubation, inkubation, inkubation,
inkubation 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 40 ± 1°C, 37±1°C,
varmeskab, varmeskab, varmeskab, varmeskab,
60 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min. 30 ± 5 min.
For prøver, som oprindelig er testet ved enten 37°C eller 40°C, skal der anvendes samme procedure til evt. gentagen
testning eller bekræftelse.
Den forventede kørselstid for denne procedure er ca. 3,5 - 4,0 timer fra det første inkubationstrin startes. Hver
analyse skal køres færdig uden afbrydelse, når den først er påbegyndt.
Der skal køres to positive og tre negative kontrolprøver på hver plade. Det er nødvendigt med tre cellekulturmediumkontroller
i stedet for kittets negative kontrol (C0), når der testes cellekulturprøver. Cut-off for patientprøver bestemmes
af kontrollerne på den enkelte plade.
Undgå at udsætte pladerne for lys under det sidste inkubationstrin (efter tilsætning af TMB-opløsningen).
Følg nøje den angivne procedure under iagttagelse af regler for god laboratoriepraksis :
1. Fastlæg prøvefordelingen og identifikationsoversigten omhyggeligt.
91

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2. Klargør den fortyndede vaskeopløsning.
3. Tag transportbakken og teststrimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen.
4. Anvend direkte uden forudgående vask af pladen og i rækkefølge:
4.1 50 µl fortynder i hver brønd
4.2 150 µl negativt kontrolserum (C0) i brønd A1, B1 - C1
4.3 150 µl positivt kontrolserum (C1) i brønd D1-E1.
4.4 150 µl prøvemateriale i brønd G1 osv. . .
Det er nødvendigt med tre cellekulturmedium-kontrolprøver i stedet for kittets negative kontrol, når der testes
cellekulturprøver. Sørg for, at prøvefortynderen er blandet godt med prøven (eller kontrollen).
N.B : Fordelingen af prøvematerialet kan kontrolleres visuelt på dette stadium af processen: Efter tilsætning af
prøven skifter fortynderen farve fra grøn til blå for at bekræfte, at en prøve (eller kontrol) er tilsat brønden. Når
det er blandet ordentligt, har indholdet i hver brønd en ensartet farve. Nogle cellekulturprøver skifter ikke farve,
afhængig af hvilket cellekulturmedium der er anvendt. (Se afsnit 12 om automatisk kontrol -
SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVEPIPETTERING).
5. Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende film, hvis dette er muligt. Pres filmen ned over hele pladen, så en tæt
forsegling sikres.
6. Mikrotiterpladen inkuberes i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 1°C eller 40 ± 1°C i et varmeskab.
7. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til farligt biologisk affald (en beholder
med natriumhypoklorit). Tilføj mindst 0,370 ml vaskeopløsning til hver brønd. Vent 20-60 sekunder . Sug igen.
Gentag denne procedure fire gange (dvs. alt i alt mindst 5 vask). Restmængden skal være mindre end 10 µl (hvis
det er nødvendigt, kan pladen tørres ved at lægge den med bagsiden opad på sugende papir).
Hvis der bruges en automatisk vasker, skal den samme procedure følges(se afsnit 10: Analyseprocedure).
8. Fordel hurtigt 100 µl af konjugat 1 opløsningen i alle brøndene.
Konjugatet skal rystes forsigtigt før brug.
NB : Fordelingen af konjugatopløsning 1, der er farvet gul, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i processen.
9. Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende film, hvis dette er muligt. Mikrotiterpladen inkuberes i 30 ± 5 minutter
ved 37 ± 1°C eller 40 ± 1°C i et varmeskab.
10. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til farligt biologisk affald (en beholder
med natriumhypoklorit). Tilføj mindst 0,370 ml vaskeopløsning i hver brønd. Vent 20-60 sekunder. Sug igen.
Gentag denne procedure fire gange (dvs. alt i alt mindst 5 vask). Restmængden skal være mindre end 10 µl (hvis
det er nødvendigt, kan pladen tørres ved at lægge den med bagsiden opad på sugende papir).
11. Fordel hurtigt 100 µl af konjugat 2 opløsningen i alle brøndene.
Konjugatet skal rystes forsigtigt før brug.
NB : Fordelingen af konjugatopløsning 2, der er farvet grøn, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i processen.
12. Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende film, hvis dette er muligt. Mikrotiterpladen inkuberes i 30 ± 5 minutter
ved 37 ± 1°C eller 40 ± 1°C i et varmeskab.
13. Fjern den selvklæbende film, tøm alle brønde ved opsugning, og vask mindst fem gange som beskrevet ovenfor.
Restmængden skal være mindre end 10 µl (hvis det er nødvendigt, kan teststrimlerne tørres ved at lægge dem
omvendt på sugende papir).
14. Fordel hurtigt 100 µl nyforberedt udviklingsopløsning (R8 + R9) i hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i
30 ± 5 minutter ved stuetemperatur (18 -30°C). Undgå at bruge selvklæbende film under dyrkningen.
N.B.: Fordelingen af udviklingsopløsningen, der er farvet pink, kan kontrolleres visuelt på dette stadie i
manipulationen.
Der er en tydelig farveforskel på en tom brønd og en brønd med den pink-farvede substratopløsning (se afsnit 12
om automatisk kontrol : SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING).
15. Tilføj 100 µl stopopløsning (R10) i samme rækkefølge og med samme distributionsfrekvens som for
substratopløsningen. Homogeniser reagensblandingen.
N.B.: Fordelingen af stopopløsningen, der er ufarvet, kan kontrolleres visuelt på dette stadie i manipulationen.
Efter tilsætningen af stopopløsningen forsvinder den pink farve i substratet (for de negative prøver) eller bliver blå
til gul (for de positive prøver).
16. Tør undersiden af pladen forsigtigt af. Mindst fire minutter efter tilsætning af stopopløsningen og senest 30
minutter efter at reaktionen er stoppet aflæses den optiske densitet ved 450/620-700 nm ved hjælp af en
mikropladeaflæser.
17. Kontroller, at alle resultater stemmer overens, hvad angår aflæsning, plade, prøvefordeling og identifikationsoversigt.

11 - BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE
1 - Validering af resultater
En kørsel er gyldig, hvis følgende kriterier er opfyldt :
• Absorptionsværdien for hver Negativ Kontrol (NC) (eller cellekulturkontrol, hvis det er relevant) er større end
0,000 AU og mindre end eller lig med 0,100 AU. En negativ kontrolværdi kan kasseres, og middelværdien af
de negative kontroller kan udregnes på basis af de resterende to værdier. Middelværdien for de negative
kontroller kan udregnes på basis af de resterende to absorptionsværdier. Hvis to eller flere negative kontroller
ligger uden for grænseværdierne, er pladen ugyldig og må laves om.
• Middelabsorptionsværdien af de positive kontroller (PCX) skal være større end eller lig med 0,500 AU, og de
individuelle absorptionsværdier skal ligge inden for en reproduktionsgrænse på 0,65 til 1,35 gange PCX'en.
Positive kontrolværdier må ikke kasseres.
2 - Udregning af middelabsorptioner
På basis af de validerede kontrolprøver bestemmes middelabsorptionerne for de negative kontroller og positive
kontroller ved at dele summen af deres absorptionsværdier med antallet af acceptable kontroller.
3 - Cut-off-værdi
Bestem cut-off-værdien ved at lægge 0,070 til NC middelværdien (NCX) som vist i eksemplet nedenfor.
NCX = 0,033
Cut-off-værdi = 0,070 + 0,033 = 0,103
4 - Fortolkning af resultater
Tilstedeværelsen af HIV-1 antigen, bestemmes ved at sammenholde prøvens absorptionsværdi med cut-off-værdien.
Prøvemateriale med absorptionsværdier på

• 55 cellekultur-supernatanter af HIV 1 (53 gruppe M og 2 gruppe O) og fortyndingspanelet "Ag VIH SFTS 96" er
blevet fundet positive med Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA testen med undtagelse af to fortyndinger af
gruppe O cellekultur-supernatanter.
- De 53 cellekultur supernatanter af HIV-gruppen M består af følgende genotyper: 10 genotyper A, 10 B, 9 C, 5
D, 11 E, 2 F, 2 G, 1 H, 2 J og 1 N.
- Fortyndingspanelet "Ag VIH SFTS 96" omfatter følgende genotyper: A, B, C, D, E, F, G, H genotyper fra gruppe
M og 1 fra gruppe O.
Analytisk sensitivitet
Testens sensitivitetsgrænse er vurderet på en række fortyndinger, der er forberedt efter den franske standard (renset
viralt lysat af genotype B i negativt citratplasma), og BBI-panelet (PRA 801). Sensitivitetsgrænsen er bedømt til 8
pg/ml Ag HIV uanset fremgangsmåde.
Kalibreringskurven opnået med HIV-1 Ag Standard (kode 72217) kalibreret prøve er lineær mellem 0 og 100 pg/ml.
Diagnostisk specificitet
Den diagnostiske specificitet, der er evalueret på :
• 4038 bloddonorer, er bedømt til 99,95%.
• 209 kliniske patienter, er bedømt til 100%.
Et panel på 105 patientprøver er testet. Det består af prøver:
• som indeholder antistoffer mod HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubelle, Toxoplasma Gondii, Treponema Pallidum, CMV
• som indholder auto-Ab, IgG, IgM reumatoid faktor
• fra gravide kvinder, population med skrumpelever, population med mange transfusioner og patienter med SLE
(Systemic Lupus Erythematosus)
Der blev kun fundet en prøve, der kom fra en patient med SLE (Systemic Lupus Erythematosus), som var reaktiv med
Genetic Systems HIV-1 Ag EIA testen, men ikke blev bekræftet med den bekræftende test.
Nøjagtighed
Reproducerbarheden i samme analysserie er vurderet ved at teste tre positive prøver og en negativ prøve 30 gange
i samme kørsel.
Reproducerbarheden mellem analyseserier er vurderet ved at teste tre positive prøver og en negativ prøve i fem dage
med to forskellige teknikere.
Variationskoefficienten for positive prøver var mindre end 10%.
14 - TESTENS BEGRÆNSNINGER
• Genetic Systems HIV-1 Antigen EIA-procedure og fortolkning af resultater skal følges ved test af serum, plasma
eller cellekulturprøver for tilstedeværelsen af HIV-1 antigen. Det anbefales brugeren af kittet at læse pakkens
indlægsseddel grundigt, før testen udføres. Især skal testproceduren følges omhyggeligt hvad angår prøve- og
reagenspipettering, vask af plader og tiderne for inkubationstrinnene.
• En bestegnelse som reaktiv over for HIV-1 antigen må ikke baseres på et enkelt reaktivt testresultat. Der skal
udføres yderligere test, som bekræftende testkørsler, for at fastlægge specificiteten af prøvemateriale, som er
reaktivt på screeningproceduren.
• Alle immunanalyser med høj sensitivitet har mulighed for at give ikke-specifikke reaktioner, som kan føre til falske
positive resultater. Antallet af falske reaktiver afhænger af testkittets sensitivitet og specificitet.
• Der kan opstå negative resultater, hvis mængden af den tilstedeværende markør i prøven er for lav til analysens
konstateringsgrænser, eller hvis markøren, som konstateres, ikke findes på det stadium af sygdommen, hvor
prøven er taget.
• Med variationen af HIV-virus kan muligheden for falskt negative resultater ikke udelukkes. Ingen kendt testmetode
kan give fuld sikkerhed for, at der ikke forefindes HIV-virus.
• Undlader man at tilføre prøvemateriale eller reagens efter instruktionerne i proceduren, kan det give falske
negative resultater. Det bør overvejes at gentage testen, hvor der er mistanke om kontaminering eller en
procedurefejl.
• En absorptionsværdi på under 0,000 AU antyder en procedure- eller instrumentfejl, og testen skal i så fald tages
om.
• Faktorer, som kan påvirke resultaternes validitet, er bl.a. at undlade at tilsætte prøvemateriale i brønden,
utilstrækkelig vask af mikrotiterpladebrønde, at undlade at følge de opgivne inkubationstider og -temperaturer,
tilsætning af forkerte reagenser i brøndene, tilstedeværelse af metaller eller stænk af natriumhypoklorit i brøndene.
• Testens funktion er ikke vurderet på post mortem-prøver eller biologiske væsker ud over serum, plasma eller
cellekulturprøver.
94

• Ved cellekulturprøver må prøvefortynderne ikke ændre farve efter cellekulturmediet.
• Selvom den analytiske sensitivitet er bedømt til 8 pg/ml under testens vurderinger, kan den variere efter
funktionsbetingelserne og variationer i batchen. Derfor garanterer Bio-Rad kun en analytisk sensibilitet under 15
pg/ml.
• Den kolorimetriske metode til kontrol af prøve-, konjugat- og udviklingsopløsningsfordelingen kontrollerer ikke
nøjagtigheden af de fordelte mængder. Denne metode viser kun forekomsten af prøvemateriale, konjugat og
udviklingsopløsning i brønde. Fejlprocenten ved denne metode er tæt forbundet med nøjagtigheden af det
anvendte system (en kumuleret variationskoefficient på mere end 10% for fordelingen og aflæsningen nedsætter
kvaliteten af kontrollen markant).
• I tilfælde af meget dårlig vaskeeffektivitet efter inkubationen af konjugatet kan den automatiske kontrol af
pipettering af udviklingsopløsning (ved aflæsning af brøndenes OD ved 490 nm) give forkerte resultater med OD
over 0,100 uden udviklingsopløsning. Dette fænomen er imidlertid aldrig observeret under bedømmelsen af 939
testede prøver.
15 - REFERENCER
Se den franske udgave.
95

• CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
0
• Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic
in vitro)
• Marcodo CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
• EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In vitro-Diagnostika)
• Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
• Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico
in vitro)
• CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)
• CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
IVD
• For in vitro diagnostic use
• Pour diagnostic in vitro
• Para diagnóstico in vitro
• In vitro-Diagnostikum
• Per uso diagnostico in vitro
• Para uso em diagnóstico in vitro
• In vitro diagnostik
• In vitro diagnose
REF
• Catalogue number
• Référence catalogue
• Número de catálogo
• Bestellnummer
• Numero di catalogo
• Número de catálogo
• Katalognummer
• Katalognummer
LOT
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• Fabricant
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• Hersteller
• Produttore
• Fabricante
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• Chargen-Bezeichnung
• Codice del lotto
• C6digo do Iote
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EC REP • Authorised Representative
• Représentant agréé
• Representante autorizado
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• Distributore autorizzato
• Representante Autorizado
• Auktoriserad representant
• Autoriseret repræsentant
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• Date de péremption AAAA/MM/JJ
• Estable hasta AAAA/MM/DD
• Vervvendbar bis JJJJ/MM/TT
• Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
• Data de expiração AAAA/MM/DD
• Utgångsdatum År/Månad/Dag
• Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD
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• Limites de températures de stockage
• Temperatura limite
• Lagerungstemperatur
• Limiti di temperatura di conservazione
• Limites de temperatura de armazenamento
• Temperaturbegränsning
• Temperaturbegrænsning
i
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• Consulte Ia instrucción para el uso
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