Aplicación de la biología molecular en alergia a alimentos

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kDa, que fueron caracterizados como miembros de la familia de proteínas de transferencia de lípidos (LTPs) 14,15 . La utilidad de LTPs purificadas de distintas fuentes en el diagnóstico de alergia a Rosáceas ha sido demostrada en un estudio reciente (García-Selles et al., datos sin publicar). Más del 90% de los pacientes alérgicos a melocotón y manzana reaccionan en pruebas cutáneas con la proteína correspondiente (Pru p 3 y Mald d 3). Las LTPs son proteínas de defensa ampliamente distribuidas en distintos tejidos de las plantas, lo que sugiere su potencial papel como panalergenos responsables de reacciones cruzadas entre frutas, semillas y pólenes 16,17 . La alta estabilidad térmica y digestiva de estas proteínas posibilita su actuación como alergenos en alimentos o bebidas elaboradas tales como zumo de melocotón 18 , vino 19 , o cerveza 20 . A partir de clones cDNA de las LTPs de melocotón y manzana 21 , se ha deducido la secuencia completa de aminoácidos de las proteínas maduras que muestran un 82% de identidad. La comparación con las secuencias de otras proteínas de la familia permite localizar zonas conservadas y variables que pueden formar parte de epítopos secuenciales implicados en reactividades cruzadas. El modelado de la estructura tridimensional, como el presentado en la Figura 2, permitirá localizar zonas potencialmente expuestas, candidatas a incluir epítopos conformacionales. El clon de melocotón ha sido expresado en la levadura Pichia pastoris 21 . La purificación de la proteína recombinante, ha demostrado que, al menos in vitro, su capacidad de ligar IgE es similar a la de la proteína nativa. LOS PANALERGENOS RESPONSABLES DEL SÍNDROME LÁTEX/FRUTAS SON QUITINASAS DE CLASE I Alrededor de un 30-50% de los pacientes alérgicos a látex presenta hipersensibilidad a frutas, principalmente aguacate, castaña, plátano y kiwi. La denominación "síndrome látex/frutas" fue propuesta 22 para describir este tipo de reacción cruzada, que debe implicar la presencia de epítopos comunes en alguno de los alergenos de látex y en proteínas de las frutas. La purificación y caracterización en aguacate 23-25 , castaña 23,25 y plátano 26,27 de los alergenos principales ha permitido concluir que son quitinasas de clase I. Estas proteínas poseen en la zona N-terminal de su secuencia un dominio heveína con cerca de un 70% de identidad Proteínas de defensa y de reserva como alergenos de alimentos vegetales Fig. 2. Modelado de la LTP de melocotón, Pru p 3, a partir de su secuencia de aminoácidos y tomando como referencia la LTP de maíz cuya estructura se ha determinado por resonancia magnético nuclear. Ct y Nt señalan los extremos carboxi y amino-terminal de la proteína. En colores se representan los tramos de hélice α. con el alergeno principal de látex, la heveína (Hev b 6.02). Este dominio no está presente en las quitinasas de clase II, que sin embargo presentan cerca del 80% de identidad de secuencia con el dominio catalítico de las quitinasas de clase I. En la Figura 3 se presentan los resultados de experimentos de inmunoinhibición con las quitinasas de ambas clases purificadas de castaña. El clonaje y expresión de la quitinasa de clase I de castaña y de su dominio catalítico 28 ha permitido analizar el papel de los dos dominios de estas enzimas en su capacidad de ligar IgE. La importancia del dominio heveína en dicho reconocimiento es evidente pues la deleción del mismo supone la pérdida completa de reactividad en ensayos de inmunodetección después de fraccionamiento por electroforesis en presencia de SDS (SDS-PAGE). Sin embargo, ensayos de RAST de inhibición en condiciones no desnaturalizantes sugieren la presencia de epítopos conformacionales en el dominio catalítico. Las quitinasas de clase I son proteínas de defensa de las plantas ampliamente distribuidas. Son, por tanto, potenciales panalergenos responsables de reacciones cruzadas entre distintos tipos de alimentos vegetales. Son proteínas termolábiles, debido a lo cual sólo los alimentos consumidos crudos, pero no los que se consumen tras ser cocinados o después de ser sometidos a tratamientos térmicos industriales, están asociados con el síndrome látex-frutas 29,30 . Por otra parte el nivel de este tipo de alergenos puede verse incrementado después de determinados tratamientos, como es el caso del etileno utilizado para acelerar la maduración de frutas 30 . 17
R. Sánchez-Monge, et al Fig. 3. A. Inmunoinhibición de un extracto proteico de castaña fraccionado por SDS-PAGE y electrotransferido a membranas de PVDF. El pool de sueros de pacientes alérgicos a látex y frutas utilizado se preincubó con los siguientes inhibidores: Albúmina de suero bovino (BSA), quitinasas purificadas de castaña de clase I (QI) y II (QII), extracto de látex (Hb). B. CAP de inhibición de castaña. Inhibidores: Extracto proteico de castaña CsT, preparación enriquecida en quitinasas de castaña (CsQ), quitinasas de clase I (QI) y II (QII) purificadas de castaña, y extracto de latex (Hb). Se utilizó un extracto comercial de D.pteronyssinus como control negativo. VICILINAS Y LA ALERGIA A LEGUMINOSAS EN LA ZONA MEDITERRÁNEA Las semillas de leguminosas son una de las principales causas de alergias alimentarias infantiles. En países anglosajones y en Japón, cacahuete y soja son las principales especies causantes de reacciones de hipersensibilidad, mientras que en la zona Mediterránea y en la India las especies más implicadas son lenteja y garbanzo. Los aler- 18 1 29 Len c 1 306 D D D E E E E Q E E E T S K Q V Q R Y R A K L S P G D V F 339 Vic-50kd G K E N D K E E E Q E E E T S K Q V Q L Y R A K L S P G D V F V I Ara h 1 G R R EE E E D E D E E E S N R E V R R Y T A R L K E G D V F I M 478 _ 512 EG Fig. 4. Alineamiento de la secuencia N-terminal del alergeno de lenteja (Len c 1) con secuencias de una provicilina de guisante (∆ señala el sitio de procesamiento) y del alergeno de cacahuete (Ara h 1). genos principales de cacahuete y soja han sido ampliamente estudiados pero no así los de lenteja y garbanzo. Se han caracterizado dos tipos de alergenos en lentejas cocidas 31 . Uno de ellos es un grupo de isoalergenos de 12-16 kDa (Len c 1), que son variantes de γ-vicilinas, presumiblemente producto del procesamiento de un precursor de 50 kDa. Son reconocidos por un 65% de sueros de niños alérgicos a lenteja. Presentan homología de secuencia con la región C-terminal de vicilinas de guisante y con el alérgeno Ara h 1 de cacahuete, ambos de 50-60 kDa (ver Figura 4). El clonaje y secuenciación de la vicilina de lenteja permitirá su comparación con Ara h 1 (que es también una vicilina) del que se ha descrito el mapeo de epítopos IgE 32 . El otro alergeno es una proteína biotinilada de 66 kDa (Len c 2). Proteínas homólogas han sido descritas en guisante y otras especies. La presencia de homólogos para ambos tipos de alergenos en otras especies de leguminosas puede explicar las reactividades cruzadas observadas 33,34 . AGRADECIMIENTOS Los autores desean reconocer las aportaciones de los siguientes investigadores: Drs. A. Armentia (Hospital Río Hortega, Valladolid), L. Gómez (E.T.S. Ingenieros de Montes, UPM), D. Barber (ALK-Abelló, Madrid) e I. Moneo (Instituto de Salud Carlos III, Madrid), en el caso de los inhibidores de α-amilasa/tripsina de cereales y su relación con asmas ocupacionales y alergia alimentaria; Drs. C. Blanco y T. Carrillo (Hospital Dr Negrín, Las Palmas de Gran Canaria), y C. Aragoncillo y C. Collada (E.T.S. Ingenieros de Montes, UPM), en la identificación de quitinasas de clase I como panalergenos asociados al síndrome látexfrutas; Drs. D. Barber y M. Lombardero (ALK-Abelló, Madrid), F.J. García Sellés (Hospital Virgen de la Arrixaca, Murcia), M. Fernández-Rivas (Hospital Fundación Alcorcón, Madrid), y J. Fernández Crespo y J. Rodríguez (Hospital 12 de Octubre, Madrid) en el establecimiento de LTPs
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