Novocastratm Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dysferlin

Μεθοδολογία ανοσοϊστοχημείας για χρήση αντισωμάτων Novocastra TM
σε ιστό εγκλεισμένο σε παραφίνη με χρήση της τεχνικής ανάκτησης
αντιγόνου σε υψηλή θερμοκρασία.
A. Αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται
1. Πρότυποι διαλύτες που χρησιμοποιούνται στην ανοσοϊστοχημεία.
2. 0.5% v/v Υπεροξείδιο του υδρογόνου.
3. 50 mM αλατούχου ρυθμιστικού διαλύματος Tris (TBS) pH 7,6.
4. Διάλυμα(τα) ανάκτησης αντιγόνου – δείτε την ενότητα “Συστάσεις για τη χρήση”.
5. Αραιωτικό αντισώματος – βέλτιστα αραιωμένος φυσιολογικός ορός.
6. Φυσιολογικοί οροί από το είδος στο οποίο αναπτύσσεται το δευτεροταγές αντίσωμα.
7. Δευτεροταγές βιοτινυλιωμένο αντίσωμα – παρασκευάζετε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
8. Σύμπλοκο αβιδίνης/βιοτίνης-Υπεροξειδάση χρένου (ABC-HRP) - παρασκευάζετε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
9. Τετραϋδροχλωρική 3,3’ διαμινοβενζιδίνη (DAB) - παρασκευάζετε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
10. Αντίχρωση αιματοξυλίνης - παρασκευάζετε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
11. Μέσο στερέωσης – χρησιμοποιείτε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
Β. Εξοπλισμός που απαιτείται αλλά δεν παρέχεται
1. Θάλαμος επώασης ρυθμισμένος στους 25 °C.
2. Ατμοκλίβανος από ανοξείδωτο χάλυβα (Η Novocastra TM συνιστά την αλλαγή των παρεμβυσμάτων σε τακτικά διαστήματα για τη
διατήρηση των βέλτιστων συνθηκών αποκάλυψης).
3. Γενικός εργαστηριακός εξοπλισμός ανοσοϊστοχημείας.
Σημειωση ασφαλειας
Για να διασφαλιστεί η σωστή και ασφαλής χρήση του ατμοκλίβανού σας, ΠΑΡΑΚΑΛΟΥΜΕ ΔΙΑΒΑΣΤΕ ΤΙΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΤΟΥ
ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗ.
Γ. Διαλύματα ανάκτησης αντιγόνου (δείτε την ενότητα “Συστάσεις για τη χρήση”)
Διάλυμα ανάκτησης κιτρικών 0,01 M (pH 6,0)
Προσθέστε 3,84 g κιτρικού οξέος (άνυδρου) σε 1,8 L απεσταγμένου νερού. Ρυθμίστε σε pH 6,0 με χρήση 1 M NaOH. Αυξήστε τον όγκο
έως τα 2 L με απεσταγμένο νερό.
Διάλυμα ανάκτησης EDTA 1 mM (pH 8,0)
Προσθέστε 0,37 g EDTA (κωδικός είδους E-5134 της SIGMA) σε 1 L απεσταγμένου νερού. Ρυθμίστε σε pH 8,0 με χρήση 0,1 M NaOH.
Διάλυμα ανάκτησης 20 mM Tris/0,65 mM EDTA/0,0005% Tween 20 (pH 9,0)
Διαλύστε 14,4 g Tris (κωδικός είδους 271197K της BDH) και 1,44 g EDTA (κωδικός είδους E-5134 της SIGMA) σε 0,55 L απεσταγμένου
νερού. Ρυθμίστε το pH στο 9 με 1 M HCI και προσθέστε 0,3 ml Tween 20 (κωδικός είδους P-1379 της SIGMA). Αυξήστε τον όγκο έως
τα 0,6 L με απεσταγμένο νερό. Αυτό είναι ένα συμπύκνωμα 10x, το οποίο πρέπει να αραιώνεται με απεσταγμένο νερό, όπως απαιτείται
(π.χ. 0,15 L αραιωμένα με 1,35 L απεσταγμένου νερού).
Δ. Μεθοδολογία
Πριν από την εφαρμογή της μεθοδολογίας αυτής, οι χρήστες πρέπει εκπαιδευτούν σε ανοσοϊστοχημικές τεχνικές.
Οι πελάτες θα πρέπει να προσδιορίσουν τις βέλτιστες αραιώσεις για αντισώματα. Εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, όλα τα βήματα
εκτελούνται σε θερμοκρασία δωματίου (25 °C).
1. Κόψτε και στερεώστε τις τομές σε αντικειμενοφόρους πλάκες επιστρωμένες με κατάλληλο μέσο συγκόλλησης ιστών.
2. Αφαιρέστε την παραφίνη από τις τομές σε ξυλένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου.
3. Επανυδατώστε μέσω διαβαθμισμένων αλκοολών.
4. Εξουδετερώστε την ενδογενή υπεροξειδάση με χρήση 0,5% v/v υπεροξειδίου του υδρογόνου/μεθανόλης επί 10 λεπτά.
5. Πλύνετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε τρεχούμενο νερό βρύσης.
Υποβάλλετε σε προεπεξεργασία τις τομές ως εξής:
6. Θερμάνετε 1,5 L του συνιστώμενου διαλύματος ανάκτησης (δείτε την ενότητα “Συστάσεις για τη χρήση”) μέχρι βρασμού σε
ατμοκλίβανο. Καλύψτε τη συσκευή, αλλά μην ασφαλίζετε το καπάκι. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε μεταλλικές
βάσεις χρώσης (μην τοποθετείτε τις αντικειμενοφόρους πλάκες κοντά μεταξύ τους διότι ενδέχεται να συμβεί ανομοιόμορφη χρώση)
και χαμηλώστε μέσα στον ατμοκλίβανο, διασφαλίζοντας ότι οι αντικειμενοφόροι πλάκες είναι εντελώς εμβαπτισμένες σε διάλυμα
ανάκτησης. Ασφαλίστε το καπάκι. Όταν ο ατμοκλίβανος φθάσει σε θερμοκρασία και πίεση λειτουργίας, χρονομετρήστε επί 1 λεπτό
(εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά στην ενότητα “Συστάσεις για τη χρήση”). Αφαιρέστε τον ατμοκλίβανο από την πηγή θερμότητας
και αφήστε να τρέξει πάνω της κρύο νερό χωρίς να αφαιρέσετε το καπάκι. ΜΗΝ ΑΝΟΙΓΕΤΕ ΤΟ ΚΑΠΑΚΙ ΠΡΟΤΟΥ ΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ
ΔΕΙΞΟΥΝ ΟΤΙ ΕΧΕΙ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΘΕΙ Η ΠΙΕΣΗ. Ανοίξτε το καπάκι, αφαιρέστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες και τοποθετήστε τις
αμέσως σε κρύο νερό βρύσης.
7. Πλύνετε τις τομές σε TBS επί 1 x 5 λεπτά με απαλή ανακίνηση.
8. Καλύψτε τις τομές με αραιωμένο φυσιολογικό ορό επί 10 λεπτά.
9. Επωάστε τις τομές με βέλτιστα αραιωμένο πρωτοταγές αντίσωμα (δείτε την ενότητα “Συστάσεις για τη χρήση”).
10. Πλύνετε σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS επί 2 x 5 λεπτά με απαλή ανακίνηση.
11. Επωάστε τις τομές σε κατάλληλο βιοτινυλιωμένο δευτεροταγές αντίσωμα.
12. Πλύνετε σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS επί 2 x 5 λεπτά με απαλή ανακίνηση.
13. Επωάστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε ABC-HRP.
14. Πλύνετε σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS επί 2 x 5 λεπτά με απαλή ανακίνηση.
NCL-Hamlet
Page 46